丹酚酸B 抑制AKT 的磷酸化誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌MFE-280 細(xì)胞自噬性死亡和細(xì)胞衰老

李 君 王倩青 郜智慧 李 力 高明飛 陳貝貝 （新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院婦瘤二科，新鄉(xiāng) 453000）

子宮內(nèi)膜癌（endometrial carcinoma，EC）是一種常見的婦科惡性腫瘤，發(fā)病率呈逐年升高的趨勢［1］。目前，EC的發(fā)病機(jī)制尚不明確，早期EC患者無明顯癥狀，主要采用手術(shù)治療，晚期及復(fù)發(fā)EC 患者主要采用放化療法，但其治療效果一般［2-3］。分析EC 的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的治療藥物，受到了研究者們的廣泛關(guān)注。丹酚酸B（salvianolic acid B，SAB）是從丹參的干燥根中提取的有效生物活性成分，可由三分子丹參素與一分子咖啡酸縮合形成，具有抗炎、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)、心臟保護(hù)、抗腫瘤等多種生物學(xué)作用，臨床常用于心血管疾病的治療［4］。近年來研究顯示，SAB 可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的自噬、凋亡、衰老等過程，在抗缺血-再灌注損傷、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗腫瘤中均具有重要作用，但SAB 對EC 的作用及其機(jī)制尚不清楚［5-6］。因此，本研究探討了SAB 對EC細(xì)胞自噬性死亡和細(xì)胞衰老的作用，旨在為SAB 在EC治療中的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 流式細(xì)胞儀（FACScan）購自美國Franklin Lakes 公司；多功能酶標(biāo)檢測儀（iMark680）購自Bio-Rad 公司；熒光顯微鏡購自日本Olympus 公司；SAB 購自上海融禾醫(yī)藥公司，批號(hào)190608，純度＞98%；CCK-8 檢測試劑盒購自上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司；LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin1、自噬相關(guān)蛋白 7（autophagy associated protein 7，ATG7）、磷酸肌醇3激酶（phosphoinositol 3 kinase，PI3K）、p-PI3K、絲/蘇氨酸激酶（silk/threonine kinase，AKT）、p-AKT 單克隆抗體均購自美國Santa Cruz 公司；β-actin 和辣根過氧化酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記羊抗兔IgG購自DAKO公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 采用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%熱滅活胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)MFE-280細(xì)胞，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，然后取對數(shù)期細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液繼續(xù)培養(yǎng)過夜，加入100μl不同濃度的 SAB（終濃度為 0、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10 μmol/L）孵育 24 h，棄培養(yǎng)液，每孔分別加入10 μl CCK-8 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，檢測450 nm波長的吸光度值，計(jì)算各組細(xì)胞抑制率，根據(jù) SAB 抑制曲線設(shè)置SAB 低劑量（0.5 μmol/L）、中劑量（1μmol/L）、高劑量組（2.5μmol/L）。對照組SAB濃度為0μmol/L。

1.2.2 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的增殖 取各組對數(shù)生長期細(xì)胞與相應(yīng)濃度藥物孵育24 h 后，更換為正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 d，至大多數(shù)單個(gè)克隆中細(xì)胞數(shù)大于50，每孔加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛室溫固定10 min 后，采用1%結(jié)晶紫染色，觀察每孔內(nèi)細(xì)胞克隆形成率。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡 取各組與相應(yīng)濃度藥物孵育24 h 的細(xì)胞，離心（1 000 r/min，5 min），棄上清，依次加入Annexin V-FITC、propidium iodide，室溫避光孵育30 min，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.2.4 Western blot 檢測細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)和PI3K/AKT 的磷酸化水平 取各組與相應(yīng)濃度藥物孵育24 h 的細(xì)胞，提取總蛋白并進(jìn)行蛋白定量，經(jīng)SDS-PAGE 凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，室溫封閉2 h，加一抗（Beclin1、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、ATG7、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT，稀釋比例均為1∶1 000）4 ℃孵育過夜，洗膜加二抗（稀釋比例為1∶5 000）室溫孵育2 h，電化學(xué)發(fā)光顯影，β-actin作為內(nèi)參，分析對比條帶強(qiáng)弱。

1.2.5 免疫熒光檢測細(xì)胞自噬活性 取各組與相應(yīng)濃度藥物孵育48 h 的細(xì)胞，棄培養(yǎng)基，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的甲醛固定10 min，加入200 μl Triton-X作用30 min，采用3%牛血清蛋白封閉，加入LC3一抗孵育過夜，加入熒光耦聯(lián)二抗，37 ℃孵育1 h 后封片，熒光顯微鏡下觀察LC3熒光斑點(diǎn)數(shù)。

1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞線粒體膜電位 取各組與相應(yīng)濃度藥物孵育24 h 的細(xì)胞，2.5%胰酶消化，離心（1 000 r/min，10 min），加入1 mmol/L 的JC-1染色工作溶液1 ml，37 ℃孵育30 min，上流式細(xì)胞儀檢測熒光強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，滿足正態(tài)分布計(jì)量資料均以表示，采用單因素方差分析比較組間差異性，若組間比較有差異，采用SNK-q比較兩組間差異性，且差異均以P＜0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SAB 抑制MFE-280 細(xì)胞的劑量篩選 CCK-8結(jié)果顯示（圖1），SAB 對MFE-280 細(xì)胞的抑制作用呈藥物濃度依賴性，半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）為1.040 μmol/L。因此設(shè)置SAB 低劑量、中劑量、高劑量組的濃度分別為0.5、1、2.5 μmol/L。

圖1 SAB抑制MFE-280細(xì)胞的劑量篩選Fig.1 Dose screening of MFE-280 cells inhibited by SAB

2.2 SAB 對MFE-280 細(xì)胞增殖的影響 克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖2），隨著SAB 劑量增加，SAB 濃度為 1 μmol/L 和 2.5 μmol/L 時(shí)，細(xì)胞的克隆形成率明顯下降（P＜0.05）。

圖2 SAB對MFE-280細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effect of SAB on proliferation of MFE-280 cell

2.3 SAB 對MFE-280 細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示（圖3），隨著SAB 劑量增加，SAB 濃度為 1 μmol/L 和 2.5 μmol/L 時(shí)，細(xì)胞的凋亡率明顯升高（P＜0.05）。

圖3 SAB對MFE-280細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effect of SAB on apoptosis of MFE-280 cell

2.4 SAB 對MFE-280 細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 Western blot 檢測結(jié)果顯示（圖4），隨著SAB 劑量增加，SAB 濃度為1 μmol/L 和2.5 μmol/L 時(shí)，細(xì)胞Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和 ATG7 蛋白的表達(dá)均明顯升高（P＜0.05）。

圖4 SAB對MFE-280細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of SAB on expression of autophagy-related proteins in MFE-280 cell

2.5 SAB 對 MFE-280 細(xì)胞 LC3 熒光斑點(diǎn)數(shù)的影響 免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示（圖5），隨著SAB劑量增加，SAB 濃度為1 μmol/L 和2.5 μmol/L 時(shí)，細(xì)胞LC3熒光斑點(diǎn)數(shù)明顯升高（P＜0.05）。

圖5 SAB對MFE-280細(xì)胞LC3+表達(dá)的影響Fig.5 Effect of SAB on expression of LC3+ in MFE-280 cell

2.6 SAB 對MFE-280 細(xì)胞線粒體膜電位的影響流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示（圖6），隨著SAB 劑量增加，SAB 濃度為1 μmol/L 和2.5 μmol/L 時(shí)，線粒體膜電位明顯下降（P＜0.05）。

圖6 SAB對MFE-280細(xì)胞線粒體膜電位的影響Fig.6 Effect of SAB on mitochondrial membrane potential of MFE-280 cell

2.7 SAB對MFE-280細(xì)胞PI3K和AKT磷酸化的影響 Western blot 檢測結(jié)果顯示（圖7），隨著SAB 劑量增加，SAB 濃度為1 μmol/L 和2.5 μmol/L 時(shí)，細(xì)胞p-PI3K/PI3K 和p-AKT/AKT 蛋白表達(dá)均明顯下降（P＜0.05）。

圖7 SAB對MFE-280細(xì)胞PI3K和AKT磷酸化的影響Fig.7 Effect of SAB on phosphorylation of PI3K and AKT in MFE-280 cell

3 討論

EC 是一種上皮性惡性腫瘤，病因復(fù)雜，病因尚不明確，臨床主要根據(jù)患者的病理特征，采用手術(shù)輔以放化療的綜合治療手段，但其治療效果并不十分理想［7］。SAB 對心、腦、肝、腎等重要臟器均具有重要的藥理作用，近年來研究顯示，SAB 對膠質(zhì)瘤、肝細(xì)胞癌等惡性腫瘤也有一定的保護(hù)作用，但其對EC 的作用尚不清楚［8-9］。本研究分析了不同濃度SAB對EC細(xì)胞的作用，發(fā)現(xiàn)SAB對MFE-280細(xì)胞的抑制作用呈藥物濃度依賴性，當(dāng)SAB 達(dá)到1μmol/L及以上可以明顯抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，提示SAB 可以以劑量依賴性的方式抑制MFE-280 細(xì)胞的增殖活性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究顯示，SAB可以參與調(diào)控機(jī)體自噬、凋亡、衰老等多種信號(hào)通路蛋白的表達(dá)，發(fā)揮其抗腫瘤、心腦血管保護(hù)作用［10-11］。因此，本研究進(jìn)一步分析SAB 對MFE-280 細(xì)胞自噬和細(xì)胞衰老的影響，旨在探討SAB 抗EC 的機(jī)制，為SAB 的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，同時(shí)也為新藥的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

自噬是一種不依賴Caspase 途徑的細(xì)胞死亡方式，可以與溶酶體融合為自噬溶酶體，清除細(xì)胞內(nèi)的多余物質(zhì)，降解細(xì)胞內(nèi)損傷或衰老的細(xì)胞器，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定［12］。本研究中，隨著SAB 作用劑量增加，細(xì)胞 Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和 ATG7 蛋白的表達(dá)均明顯升高，LC3熒光斑點(diǎn)數(shù)明顯升高，提示SAB可以呈劑量依賴性地促進(jìn)細(xì)胞Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和ATG7 蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞的自噬活性。Beclin1 是一種自噬相關(guān)的抑癌基因，與初期自噬吞噬小泡的形成有關(guān)，ATG7 可以參與形成前自噬體結(jié)構(gòu)，還可以促進(jìn)LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)變，提示SAB 可以增強(qiáng)自噬的形成［13-14］。LC3 是一種自噬體標(biāo)志蛋白，在自噬過程中，LC3-Ⅰ會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N膜結(jié)合形式即LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ可以很好地反映細(xì)胞的自噬活性，提示SAB 可以呈劑量依賴性的增強(qiáng) MFE-280 細(xì)胞自噬活性［15］。CHENG 等［16］的研究顯示，自噬性死亡是腫瘤細(xì)胞死亡的主要途徑之一，過度增強(qiáng)的自噬活性可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡，從而發(fā)揮其抗腫瘤作用。黃小娟等［17］的研究顯示，SAB 可以誘導(dǎo)小鼠自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3-Ⅱ的表達(dá)，減輕腎組織的病理損傷，改善腎組織纖維化，提示SAB 可以通過增強(qiáng)MFE-280 細(xì)胞自噬活性，發(fā)揮其抗腫瘤作用。

本研究中，隨著SAB 作用劑量增加，細(xì)胞JC-1紅色熒光表達(dá)明顯下降。JC-1 是一種檢測線粒體膜電位的熒光探針，在線粒體膜電位升高時(shí)，JC-1可形成聚合物出現(xiàn)紅色熒光；在線粒體膜電位降低時(shí)，JC-1 為單體出現(xiàn)綠色熒光，提示SAB 可以呈劑量依賴性的地降低MFE-280 細(xì)胞線粒體膜電位［18］。線粒體在細(xì)胞內(nèi)能量代謝、細(xì)胞凋亡等過程中具有重要的調(diào)控作用，是細(xì)胞衰老的關(guān)鍵［19］。線粒體膜電位是線粒體膜內(nèi)外的電位差，研究顯示，線粒體膜電位升高可以影響線粒體內(nèi)ATP 的合成，影響細(xì)胞內(nèi)的能量代謝，影響細(xì)胞自噬性死亡、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞衰老等多種病理生理過程［20-21］。SAB 可能呈劑量依賴性地降低MFE-280 細(xì)胞的線粒體膜電位，誘導(dǎo)MFE-280 細(xì)胞的自噬性死亡和衰老。本研究中，隨著SAB 作用劑量增加，細(xì)胞內(nèi)PI3K 和AKT 的磷酸化水平明顯下降。PI3K/AKT 信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)自噬的重要信號(hào)通路，磷酸化的PI3K可以激活下游的Akt，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和衰老等［22］。MA 等［23］的研究顯示，SAB 可以通過抑制PI3K/AKT 的磷酸化，改善腎缺血再灌注損傷，提示SAB可能通過抑制PI3K/AKT的磷酸化，調(diào)控MFE-280細(xì)胞的生物學(xué)行為。多項(xiàng)研究顯示，阻斷PI3K/AKT信號(hào)通路可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的自噬性死亡，本研究結(jié)果與其基本一致，提示SAB 誘導(dǎo)MFE-280 細(xì)胞的自噬性死亡可能與抑制PI3K/AKT 信號(hào)通路有關(guān)［24-25］。

綜上所述，SAB可呈劑量依賴性地抑制MFE-280細(xì)胞的增殖活性，誘導(dǎo)MFE-280 細(xì)胞的自噬性死亡、凋亡和衰老，其作用機(jī)制可能與被抑制的PI3K/AKT 信號(hào)通路有關(guān)，有望應(yīng)用于臨床治療。但本研究尚處于初步探索階段，其具體的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。