長雙歧桿菌DD98體內(nèi)外安全性評(píng)價(jià)

莊偉清， 李忠磊， 張旭東， 陳代杰， 譚 俊*

1. 上海醫(yī)藥工業(yè)研究院， 上海 201203； 2. 上海交通大學(xué) 藥學(xué)院， 上海 200240

益生菌是一種活的微生物，當(dāng)攝入達(dá)到一定量時(shí)能夠?qū)λ拗髌鸬酱龠M(jìn)健康的作用[1]，其中大部分是乳酸菌，包括乳桿菌、乳球菌和雙歧桿菌等至少23個(gè)屬。近些年來，大量的研究表明益生菌在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)方面有很多重要的功能，另有研究[2-5]發(fā)現(xiàn)益生菌能夠改善腹瀉，改善炎癥性腸病，改善胃腸道功能和抗過敏等。目前益生菌已被應(yīng)用于發(fā)酵乳制品及許多功能性食品中，被認(rèn)為是有益且安全的，深受消費(fèi)者的青睞。盡管益生菌受到一致好評(píng)，但是潛在的安全問題是不容忽視的[6,7]，隨著益生菌市場(chǎng)規(guī)模的不斷擴(kuò)大，尤其是在食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域，根據(jù)新思界產(chǎn)業(yè)研究發(fā)布的《2016年—2019年中國乳酸菌市場(chǎng)深度分析報(bào)告》顯示，2015年我國乳酸菌市場(chǎng)的規(guī)模已經(jīng)達(dá)到 660億元，益生菌的安全性評(píng)價(jià)變得更加重要[8,9]。

對(duì)于將作為益生菌使用的乳酸菌，參照世界衛(wèi)生組織(WHO)、聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)和歐盟制定的益生菌安全性評(píng)估指南[10-13]，需從傳統(tǒng)的生理生化檢測(cè)、體外致病基因檢測(cè)、抗生素抗性實(shí)驗(yàn)和細(xì)菌易位實(shí)驗(yàn)、體內(nèi)致病性檢測(cè)等方面判斷其安全性。乳酸菌一般被認(rèn)為是對(duì)人體無害的，但是隨著抗生素藥物的濫用，新型乳酸菌的分離應(yīng)用和轉(zhuǎn)基因乳酸菌的出現(xiàn)，乳酸菌的安全性值得關(guān)注，特別是投入到實(shí)際應(yīng)用之前。開展乳酸菌菌種安全性評(píng)價(jià)，是保證最終產(chǎn)品的食用安全，也是保護(hù)消費(fèi)者健康的重要措施[14-16]。因此，本文對(duì)具有調(diào)節(jié)腸道菌群作用的長雙歧桿菌DD98進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)，包括急性毒性實(shí)驗(yàn)、耐藥性實(shí)驗(yàn)及有害代謝產(chǎn)物等實(shí)驗(yàn)，以確定其安全性，對(duì)開發(fā)相應(yīng)益生菌產(chǎn)品具有一定參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌種

長雙歧桿菌(Bifidobacteriumlongum)DD98，本實(shí)驗(yàn)室專利菌株。

1.1.2培養(yǎng)基

MRS 培養(yǎng)基：蛋白胨 10.0 g /L，牛肉粉 5.0 g/L，酵母粉 4.0 g /L，葡萄糖 20.0 g /L，吐溫80 1 mL，K2HPO4·7H2O 2.0 g /L，乙酸鈉·3H2O 5.0 g/L，檸檬酸三銨2.0 g/L， MgSO4·7H2O 0.2 g /L，MnSO4·4H2O 0.05 g /L，瓊脂粉 15.0 g /L，pH 6.2；115 ℃滅菌20 min。

斜面固體培養(yǎng)基：蛋白胨 3.0 g /L，酵母粉 12.5 g /L，葡萄糖 6.0 g /L，氯化鈉 5.0 g /L，無水乙酸鈉 3.0 g/L，L-半胱氨酸鹽酸鹽 0.55 g /L，瓊脂粉 18.0 g /L，pH 6.8，121 ℃滅菌 20 min。種子培養(yǎng)基：即斜面固體培養(yǎng)基去掉瓊脂。

發(fā)酵培養(yǎng)基：脫脂奶粉 80.0 g /L，酵母粉 5.0 g /L，碳酸鈉 3.8 g /L，pH 6.8，115 ℃高壓滅菌 20 min。

脫羧酶培養(yǎng)基：胰蛋白胨5.0 g，酵母粉5.0 g，牛肉膏5.0 g，氯化鈉2.5 g，葡萄糖0.5 g，吐溫80 1 g，MnSO40.5 g，MgSO40.2 g，F(xiàn)eSO40.04 g，硫胺素0.01 g，K2HPO42g，CaCO30.1 g，溴甲酚0.06 g，5-磷酸吡哆醛0.05 g，前體氨基酸5.0 g，加去離子水至1 L，調(diào)pH至5.3～5.5，115 ℃滅菌20 min。

硝酸鹽培養(yǎng)基：蛋白胨5.0 g /L，硝酸鉀 1.0 g /L，pH 7.0。購置青島海博生物科技有限公司，產(chǎn)品編號(hào)：HB8460。

1.1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性 SPF 級(jí) ICR 小鼠，6～8 周齡，質(zhì)量 18±2 g，由上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)計(jì)劃通過上海交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)審核。

1.1.4儀器

超低溫冰箱FermoTM900，美國Thermo Scientific；超凈工作臺(tái)ZHJH-C1112B，上海智城分析儀器公司；立式高壓滅菌鍋LDZX-75KBS，上海申安醫(yī)療器械廠；BIOTECH-7BG發(fā)酵系統(tǒng)，上海保興生物設(shè)備工程有限公司；酶標(biāo)儀Multiskan Go，美國Thermo Scientific；CA-500 血液自動(dòng)分析儀，山東蘭橋醫(yī)學(xué)科技有限公司； Bio-Rad 熒光定量 PCR 儀，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司； Nano Drop 紫外分光光度計(jì)，Thermo scientific 公司。

1.2 方法

1.2.1DD98發(fā)酵乳制備

將DD98工作種子接種到新鮮斜面上，于37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)24 h；將斜面上的菌苔接種至種子培養(yǎng)基中， 37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h；將種子按照5 %的接種量接入7 L發(fā)酵罐(罐內(nèi)裝6 L發(fā)酵乳培養(yǎng)基)，溫度37 ℃，轉(zhuǎn)速200 r/min，發(fā)酵罐通氮?dú)猓l(fā)酵過程 pH控制在6.5，待補(bǔ)堿瓶中堿液補(bǔ)完，發(fā)酵液 pH 降至5.5時(shí)發(fā)酵結(jié)束，將發(fā)酵液灌裝至無菌瓶里保存。

1.2.2發(fā)酵乳活菌檢測(cè)

采用平皿澆筑法：選擇合適的稀釋度菌液，分別取 1 mL 加到無菌平皿里，然后將室溫的 BBL 瓊脂培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，立即混勻至平板凝固。每個(gè)稀釋度涂三個(gè)平板，37 ℃倒置厭氧培養(yǎng) 24 h 左右，待菌落長好后，計(jì)數(shù)并計(jì)算出原菌液的活菌數(shù)(CFU/mL)：每毫升原菌液活菌數(shù)=同一稀釋度 3個(gè)平皿菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)。

1.2.3抗生素敏感性檢測(cè)

采用藥敏紙片擴(kuò)散法(K-B法)測(cè)定DD98對(duì)30種抗生素的敏感性，將待測(cè)菌液涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，待完全被吸收后，將抗生素紙片放置在上面，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h后測(cè)定抑菌圈大小，實(shí)驗(yàn)用抗生素標(biāo)準(zhǔn)品由中國食品藥品檢定研究院出品。本實(shí)驗(yàn)委托中國科學(xué)院微生物研究所對(duì) DD98菌株進(jìn)行抗生素敏感檢測(cè)。

1.2.4急性毒性實(shí)驗(yàn)

30 只小鼠隨機(jī)分為 3 組，每組 10只，一周適應(yīng)性飼養(yǎng)后，分別灌胃生理鹽水、DD98 發(fā)酵乳高劑量組(1×1010CFU/mL)、DD98發(fā)酵乳低劑量組(1×108CFU/mL)，灌胃劑量為 0.2 mL/只，每天1次，連續(xù)灌胃20 d。每天觀察小鼠的活動(dòng)狀態(tài)，中毒表現(xiàn)，記錄體重變化。各組小鼠解剖腹部后，摘取其臟器(心、肝、脾、肺、腎)，用濾紙吸殘血，稱重，按照公式計(jì)算臟器指數(shù)[17-19]：臟器指數(shù)=各臟器質(zhì)量(mg)/小鼠體重(g)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，相關(guān)手術(shù)操作均嚴(yán)格遵守動(dòng)物倫理學(xué)原則。

1.2.5血常規(guī)指標(biāo)檢測(cè)

采用阻抗法，在 CA-500 血液自動(dòng)分析儀上進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè)。共檢測(cè) 8 種血常規(guī)指標(biāo)，包括白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)、血紅蛋白(HGB)、血細(xì)胞比容(HCT) 、紅細(xì)胞平均體積(MCV)、紅細(xì)胞平均血紅蛋白含量(MCH)、紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度(MCHC)、血小板(PLT)[20, 21]。

1.2.6細(xì)菌移位能力評(píng)價(jià)

HPLC法同時(shí)測(cè)定蒙藥達(dá)烏里芯芭中梓醇和益母草苷的含量 ……………………………………………… 包玉秋等（11）：1542

分析小鼠血和臟器組織(心、肝、脾、肺、腎)的細(xì)菌移位情況。將50 μL小鼠血涂布于MRS平板，于37 ℃下分別厭氧及有氧培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)平板上的菌落數(shù)。取組織樣品，以1 g/mL懸滴于無菌生理鹽水中，勻漿后取100 μL涂布于MRS平板，37℃下分別厭氧及有氧培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)平板上的菌落數(shù)，有菌落生長即記為陽性。

1.2.7硝酸鹽還原酶實(shí)驗(yàn)

將DD98菌株接種至硝酸鹽培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，滴加碘化鉀溶液和淀粉溶液，觀察顏色變化，以不接種菌液的硝酸鹽培養(yǎng)基為空白對(duì)照。

1.2.8氨基脫羧酶活性檢測(cè)

將DD98菌株活化后，分別接入含0.1 %前體氨基酸(賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸)的脫羧酶培養(yǎng)基和未添加前體氨基酸的脫羧酶培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2 d～3 d，觀察培養(yǎng)基顏色及測(cè)定培養(yǎng)基pH[22, 23]。

1.2.9數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)，使用 SPSS 21.0 軟件統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并進(jìn)行相應(yīng)顯著差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)

表1 抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過DD98對(duì)30種常見抗生素的藥敏性實(shí)驗(yàn)可知，DD98對(duì)大部分抗生素具有敏感性，僅對(duì)部分抗生素具有抗性：如氨基糖苷類(慶大霉素、奈替米星、阿米卡星)；喹諾酮類(環(huán)丙沙星)及磺胺類(復(fù)方新諾明)藥物。

2.2 有害代謝產(chǎn)物實(shí)驗(yàn)

2.2.1硝酸鹽還原酶實(shí)驗(yàn)

硝酸鹽能在硝酸鹽還原酶的作用下還原成亞硝酸鹽，亞硝酸鹽是一種劇毒物質(zhì)，在胃酸環(huán)境下可與食物中的胺類物質(zhì)形成強(qiáng)致癌物亞硝胺。因此，硝酸鹽還原酶實(shí)驗(yàn)對(duì)菌株的安全性考察非常重要，如果該菌產(chǎn)生硝酸鹽還原酶，在硝酸鹽培養(yǎng)基上生長時(shí)會(huì)將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，此時(shí)滴加碘化鉀溶液，亞硝酸鹽可以從碘化鉀中置換出單質(zhì)碘，再滴加淀粉溶液時(shí)會(huì)變藍(lán)色[24]。長雙歧桿菌DD98在該實(shí)驗(yàn)時(shí)不能使培養(yǎng)基變藍(lán)色，為陰性反應(yīng)，說明該菌不產(chǎn)生硝酸鹽還原酶，可以在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用。

2.2.2氨基脫羧酶活性檢測(cè)

氨基酸被氨基脫羧酶脫羧后轉(zhuǎn)化成生物胺，過量的生物胺可引起頭痛、惡心、呼吸困難、高血壓等中毒癥狀，是非常重要的食品安全性問題，因此，氨基脫羧酶活性檢測(cè)對(duì)菌株的安全性考察非常重要。脫羧酶培養(yǎng)基中，溴甲酚紫的指示范圍是pH 5.2～6.8，pH在5.5時(shí)呈黃色，稍大于5.5就會(huì)呈現(xiàn)紫色或者紫紅色。氨基酸脫羧后，會(huì)使脫羧酶培養(yǎng)基呈堿性，添加溴甲酚紫指示劑，溶液呈黃色為陰性，紫色則為陽性[25]。長雙歧桿菌DD98測(cè)定結(jié)果為黃色，說明該菌是安全的，可以在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用。

2.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.3.1口服DD98機(jī)型毒性實(shí)驗(yàn)

灌胃結(jié)束的20 d內(nèi)，小鼠活動(dòng)正常，飲水飲食無異常，皮毛正常，體重隨時(shí)間增加，發(fā)酵乳組與對(duì)照組無顯著性差異，說明灌胃DD98發(fā)酵乳不會(huì)影響小鼠生長。血常規(guī)指標(biāo)可以反映出試驗(yàn)菌株在血液中的副作用，表2結(jié)果顯示，灌胃DD98發(fā)酵乳的小鼠與對(duì)照組小鼠的血常規(guī)各項(xiàng)指標(biāo)無顯著性差異(P>0.05)，說明服用DD98發(fā)酵乳不會(huì)對(duì)小鼠產(chǎn)生不良反應(yīng)。

表2 血常規(guī)指標(biāo)(n=10)

2.3.2細(xì)菌移位檢測(cè)

益生菌移位可能引發(fā)感染，比如菌血癥、敗血癥或心內(nèi)膜炎等[26]，因此，細(xì)菌移位對(duì)菌株的安全性考察非常重要。表3結(jié)果表明，對(duì)照組與試驗(yàn)組的血和臟器組織(心、肝、脾、肺和腎)經(jīng)過培養(yǎng)后，培養(yǎng)基上沒有菌落生長，表明長雙歧桿菌DD98沒有從腸道轉(zhuǎn)移到血和臟器組織，為發(fā)生移位現(xiàn)象，說明該菌是安全的，可以在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用。

表3 被試菌轉(zhuǎn)移到血及臟器組織的移位率

3 總結(jié)

通過長雙歧桿菌DD98的安全性評(píng)價(jià)可知：DD98對(duì)大部分抗生素具有敏感性；不會(huì)產(chǎn)生硝酸鹽還原酶和氨基脫羧酶；口服不同劑量試驗(yàn)菌發(fā)酵乳，小鼠均未發(fā)生不良反應(yīng)，試驗(yàn)菌未發(fā)生血液及臟器組織(心、肝、脾、肺、腎)的移位，綜上，長雙歧桿菌DD98具有較好的安全性，可以在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用。