曲霉(霉菌)蛋白酶早期研究的回顧

胡學(xué)智

上海市工業(yè)微生物研究所，上海 200233

蛋白酶是一用途廣泛的生物催化劑，上世紀(jì)50年代我國還沒有酶制劑工業(yè)，唯一的酶制劑只有制藥廠少量生產(chǎn)的胰酶和胃蛋白酶，供作醫(yī)藥用的消化劑和制革廠的軟化劑，60年代才開始注意微生物蛋白酶的開發(fā)利用，例如成都生物制品所之利用霉菌培養(yǎng)物試制蛋白胨，中科院微生物研究所之廣泛收集淀粉酶、蛋白酶生產(chǎn)微生物供釀造業(yè)使用，中科院上海生化研究所之利用菠蘿罐頭下腳提取蛋白酶、利用動物廢棄胰臟提取蛋白酶等等。

筆者所在研究所前身上海市第一輕工業(yè)局試驗所發(fā)酵組于1959年在顧問陳騊聲先生領(lǐng)導(dǎo)下完成了液體曲制酒精研究后，為響應(yīng)市科委“大打工業(yè)生產(chǎn)細(xì)菌戰(zhàn)”的號召，在進(jìn)行谷氨酸發(fā)酵研究同時，又開展了曲霉蛋白酶的生產(chǎn)與應(yīng)用研究，自1960到1974年的14年間先后完成了曲霉中性、酸性蛋白酶的生產(chǎn)和工業(yè)上應(yīng)用的研究，囿于當(dāng)時的環(huán)境和水平，我們克服了設(shè)備簡陋、資料缺乏等困難，通過合理的實驗設(shè)計和大量的試驗工作，終于完成了任務(wù)，并成功地工業(yè)生產(chǎn)中性和酸性蛋白酶，及開拓出在工業(yè)上能廣泛應(yīng)用。

光陰荏苒，轉(zhuǎn)瞬間60年過去了，當(dāng)年與我共事的同志都已耄耋之年，有的已經(jīng)離世，筆者也已年逾九旬，趁現(xiàn)在思維尚清，對我們上世紀(jì)60～70年代在蛋白酶研究中的崢嶸歲月的片段作一回顧，些許經(jīng)驗供同輩和后進(jìn)同行參考，也為我國酶制劑工業(yè)發(fā)展提供點滴史實，不失為有意義之舉。

1 棲土曲霉蛋白酶和制革原料皮脫毛

1959年我所前身上海市第一輕工業(yè)局試驗所發(fā)酵組與上海酒精廠、輕工業(yè)部食品發(fā)酵研究所合作項目“液體曲制酒精的研究”工業(yè)化試驗成功，在國內(nèi)首先將抗生素生產(chǎn)的深層發(fā)酵技術(shù)引進(jìn)到我國的發(fā)酵工業(yè)，使酒精工業(yè)擺脫繁重的體力勞動，為進(jìn)一步機械化自動化創(chuàng)造了條件。1964年我所與天廚味精廠、上海生化研究所合作的發(fā)酵法生產(chǎn)味精的研究又積極開展，加深了市科委對發(fā)酵工業(yè)的重視，提出了“工業(yè)生產(chǎn)細(xì)菌戰(zhàn)”的口號，我們?yōu)轫憫?yīng)工業(yè)細(xì)菌戰(zhàn)的號召，又展開了蛋白酶生產(chǎn)和工業(yè)利用的研究，首先對由全國收集到的40余株釀造用曲霉作了普查，用麩皮原料做成麩曲，用水抽提后，分別在中性pH 7.0和酸性pH 4.0的環(huán)境下，用明膠甲醛滴定法測定它們的明膠分解力，結(jié)果表明黃綠色的曲霉在中性pH具有較強的蛋白質(zhì)分解力，但在pH 4.0的酸性下無蛋白酶活性或活性甚微，若將浸出液在pH 3.0、40 ℃處理10 min，則中性下的酶活全部消失，只剩下在酸性的微弱酶活，而黑色曲霉則相反，在中性pH毫無蛋白酶活性，而只有在pH 4.0的酸性環(huán)境才有較強的蛋白酶活性，雖經(jīng)pH 3.0處理也無損于蛋白酶的活性，然而若經(jīng)pH 7.0的環(huán)境下40 ℃處理10 min則酶活力完全消失，此結(jié)果否定了當(dāng)時應(yīng)輕工業(yè)部邀請來華的蘇聯(lián)酶學(xué)專家芬尼克莎娃院士所作酶制劑的學(xué)術(shù)報告中宣稱“黑曲霉不產(chǎn)蛋白酶”的結(jié)論，我們推測她是按常規(guī)，是在中性的pH下進(jìn)行測定所致，此結(jié)果加強了我們可用黑曲霉生產(chǎn)耐酸性蛋白酶的信心，其實日本已有從黑曲霉研制酸性蛋白酶的報導(dǎo)了。

皮革生產(chǎn)的第一步是將原料皮用水浸軟，在肉面涂抹硫化物石灰漿，使毛囊破壞而脫毛，再人工鏟毛，這種工藝勞動強度高，污水嚴(yán)重，既污染環(huán)境，更損害工人健康，我們應(yīng)制革行業(yè)要求，試圖利用蛋白酶來破壞毛囊使之脫毛，而改善生產(chǎn)面貌，我們打破常規(guī)，采用將皮革原料樣品直接投入各種菌株麩曲抽提液中，保溫振蕩來篩選適合脫毛的蛋白酶生產(chǎn)菌種的方法，很快就篩選出了適用的蛋白酶生產(chǎn)菌——棲土曲霉3.374，此菌為中科院微生物研究所之保藏菌種，乃由上海酒精廠制成麩曲后交制革廠試用，很快酶法脫毛在上海和華東地區(qū)迅速推廣，在上海市7 000人大會受到了市領(lǐng)導(dǎo)的表揚，也引起了輕工業(yè)部的注意，酶脫毛新工藝于是在全國推廣，由于固體培養(yǎng)方法簡單可土法上馬，在一些偏遠(yuǎn)地區(qū)甚至連小學(xué)、小酒坊也辦起了土法生產(chǎn)蛋白酶，來供應(yīng)當(dāng)?shù)刂聘飶S的需要。此外，我們還協(xié)助上海肉類加工廠、上海魚品加工廠等將麩曲蛋白酶用于蛋白胨、蛋白、口服水解蛋白及硫酸軟骨素等制造以代替供應(yīng)緊張的胰酶，還用于塑料筆桿廠的廢膠卷片基三醋酸纖維和銀粒的回收。在此基礎(chǔ)上我們又展開了液體深層培養(yǎng)生產(chǎn)蛋白酶的研究，在中科院微生物研究所的支持下，對該所提供的棲土曲霉突變株3.942的液體深層培養(yǎng)生產(chǎn)蛋白酶開展了深入的研究，我們發(fā)現(xiàn)，向培養(yǎng)基添加洗凈劑LS等表面活性劑，可以不用玉米、黃豆粉等糧食原料，而只用麩皮、米糠、玉米漿等農(nóng)副產(chǎn)物為原料，來生產(chǎn)蛋白酶，取得通風(fēng)量要比原來降低到1/3，產(chǎn)酶量增加60%的效果，為低成本工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)，與溫州味精廠協(xié)作進(jìn)行生產(chǎn)性擴大試驗，在半年多時間內(nèi)，克服了種種困難終于試生產(chǎn)成功，國內(nèi)生產(chǎn)的真菌中性蛋白酶終于上市供應(yīng)全國有關(guān)行業(yè)的應(yīng)用，促進(jìn)了許多行業(yè)的發(fā)展，此成果受到浙江省領(lǐng)導(dǎo)的重視，并被列為浙省重第二重大科研成果，當(dāng)時籌款40多萬元，新建溫州發(fā)酵化工廠進(jìn)行生產(chǎn)。

在溫州味精廠進(jìn)行中試是異常艱辛和難以想象的，這個廠是由粉絲作坊等組合而成，工人文化程度低，更缺乏微生物方面的知識，要其掌握先進(jìn)的深層發(fā)酵技術(shù)難度可想而知，該廠廠長王峰同志是位復(fù)員軍人，在他領(lǐng)導(dǎo)下辦起了味精廠，我們廠所密切合作在試制過程中好不容易解決了染菌，又遇到原料缺貨，如過濾用的助濾劑硅藻土缺貨，我們只得自己動手做，將建筑用硅藻土在食堂廚房鐵鍋中焙炒去除有機質(zhì)，在大于200 ℃的高溫下鏟刀柄都烤焦了，工人眉毛也烤黃了，就這樣制出了合用的助濾劑。又如鹽析用硫銨也因供應(yīng)不繼得自己解決，我們只得從鹽析廢母液濃縮后回收才解決問題，像這樣的問題層出不窮，我們就是在這樣條件下來完成試驗任務(wù)的。1968年11月，在浙江省科委主持下對棲土曲霉3.942蛋白酶進(jìn)行了全國鑒定，浙江日報作為重大新聞大幅報導(dǎo)。不久上海輕工業(yè)局也籌建了佳樂酶制劑廠，令我們前去協(xié)助生產(chǎn)該蛋白酶。

2 酸性蛋白酶的研究

毛皮是北方人冬季御寒的主要用品，毛皮生產(chǎn)的傳統(tǒng)制法是米硝法，將米面抹在毛皮上任其自然發(fā)酵，使皮膠元的間隙蛋白質(zhì)分解而變得松軟，但這種工藝制成的皮有異臭，毛皮不可水洗，含灰量高，穿著笨重，生產(chǎn)耗費糧食，為此新疆建設(shè)兵團(tuán)要求我所對采用酶法軟化毛皮進(jìn)行研究，以應(yīng)中國人民解放軍總后部提出“減輕戰(zhàn)士裝備重量一公斤”的號召，我們先同上海皮張廠協(xié)作，試用胰酶和棲土曲霉蛋白酶來軟化毛皮取得成功，成品毛皮輕薄軟暖，還可水洗，又大大節(jié)約糧食，此技術(shù)受到了第二輕工業(yè)部、外貿(mào)部和全國合作總社的重視，成立了三部聯(lián)合領(lǐng)導(dǎo)小組來推廣酶法軟化毛皮新技術(shù)，1974年專門邀請我們?nèi)埣铱谌珖浕ば鹿に噷W(xué)習(xí)班講授蛋白酶有關(guān)知識(胡學(xué)智、王恩榮同去)，因酸性蛋白酶可在酸性環(huán)境下發(fā)揮作用，無中性蛋白酶之缺點，細(xì)菌不易繁殖，不會引起爛皮、掉毛等事故，且軟化浴可反復(fù)使用多次，節(jié)省成本故更為適用。

為此我們集中精力開展了酸性蛋白酶的研究，那時尚沒有可以省工省時的優(yōu)選法，更沒有現(xiàn)代的高通量篩選技術(shù)，要取得成功全靠成百上千甚至上萬個搖瓶培養(yǎng)收集測定數(shù)據(jù)才行，工作量之大現(xiàn)在是難以想象的。

我們對100多株黑曲霉，每個菌株采用固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)同時并舉的方法，液體培養(yǎng)每個菌株同時用四種配方培養(yǎng)基來篩選菌種以避免優(yōu)良菌株之漏篩。最后篩選得到黑曲霉3.350，宇佐美曲霉白色變株(即537的母株)以及玉桂色曲霉No.81的酶活性最強。

我們對黑曲霉3.350培養(yǎng)條件優(yōu)化以后乃同上海酒精廠合作進(jìn)行發(fā)酵罐放大試驗，為便于查找發(fā)酵罐發(fā)酵發(fā)生的異常情況，我們套用了在谷氨酸發(fā)酵研究中摸索出來的一套罐對照試驗方法，將實驗室配制的培養(yǎng)基和發(fā)酵罐滅菌后的培養(yǎng)基分裝三角瓶，接種試管菌種后搖瓶培養(yǎng)來觀察發(fā)酵罐培養(yǎng)基有何問題，將實驗室配制之培養(yǎng)基分別接種試管菌種和種子罐種子作搖瓶試驗以檢驗種子罐培養(yǎng)有無問題等，試驗一式三份，故每上罐一次搖瓶對照樣品就一大堆，工作量很大。

在5 000 L發(fā)酵罐發(fā)酵時，一連幾個月發(fā)酵很不正常時或不長菌，時或產(chǎn)酶很少，查遍菌種、原料和罐對照搖瓶都無問題，令人費解，也遭到了廠方質(zhì)疑，懷疑菌種、懷疑科研不成熟等等，壓力很大。作者只得從發(fā)酵罐去找原因，乃親自鉆入發(fā)酵罐檢查，發(fā)現(xiàn)在紫銅冷卻盤管有一層藍(lán)綠色污垢，憑著大學(xué)中學(xué)到的定性化學(xué)分析知識，意識到這是一種銅氨復(fù)離子，是由培養(yǎng)基中銨離子與銅結(jié)合生成的絡(luò)合物，因為我們所用培養(yǎng)基中含大量的氯化銨作無機氮源，而銨離子對銅有腐蝕性，乃生成了銅氨復(fù)離子從而對菌體造成毒害，于是將此判斷反映給廠領(lǐng)導(dǎo)，建議將銅管換熱器改成不銹鋼的，起初廠方不信，我們只得將銅管銅片按發(fā)酵罐中冷卻管與發(fā)酵液接觸面積之比例剪取小塊銅片放入搖瓶培養(yǎng)基中作搖瓶試驗來驗證。結(jié)果表明，加有銅片的一組菌體生長不佳產(chǎn)酶甚少，而對照組不加銅片的一切正常，這一措施終于獲得了廠領(lǐng)導(dǎo)的信服，花4千多元錢改換了冷卻管，再次投料試驗，一舉成功，一連試驗45罐平均產(chǎn)酶活性2 500 U/mL，最高3 000 U/mL，圓滿完成了酸性蛋白酶的試生產(chǎn)任務(wù)，我國酸性蛋白酶終于工業(yè)生產(chǎn)成功，填補了我國酶制劑工業(yè)的一個空白。

此外我們又同上海醫(yī)藥工業(yè)研究院協(xié)作，將酸性蛋白酶鹽析粗品離交脫鹽純化冷凍干燥后作成腸溶片，在上海十家醫(yī)院(包括中山醫(yī)院、第六人民醫(yī)院、第二人民醫(yī)院、龍華醫(yī)院、曙光醫(yī)院、市勞動衛(wèi)生研究所等中西醫(yī)院及四家地段醫(yī)院)的支持下，歷時二年多對700多名內(nèi)外科患者進(jìn)行臨床試驗[9]，結(jié)果表明酸性蛋白酶對于呼吸道疾病、外科血栓性靜脈炎、術(shù)后血腫水腫粘連等均有良好效果，用于慢性支氣管炎的有效率達(dá)80%，且兼具平喘效果，藥用酸性蛋白酶受到醫(yī)院和患者的歡迎，但因不久國家有文件規(guī)定非醫(yī)藥企業(yè)不得從事藥品生產(chǎn)，藥用酸性蛋白酶終于未能正式生產(chǎn)造?；颊?，殊為可惜。

近年由不同菌株生產(chǎn)的酸性蛋白酶已被廣泛用作飼料添加劑，用于糧食酒精發(fā)酵、酒、醬、醋等發(fā)酵制品的生產(chǎn)，對提高飼養(yǎng)效率，減少動物疾病，提高發(fā)酵品得率與品質(zhì)發(fā)揮了明顯的經(jīng)濟(jì)效益。

3 關(guān)于蛋白酶活性劑測定出現(xiàn)的問題

蛋白酶是一類復(fù)雜的酶，專一性極強，對其切開的肽鍵氨基酸組成有著嚴(yán)格的選擇性，水解肽鍵的能力還受到肽鍵長度、切開點前后肽鍵氨基酸組成的影響，不同來源蛋白酶水解同一蛋白質(zhì)的能力不同，同一蛋白酶水解不同蛋白質(zhì)的能力也不同，故采用不同的蛋白酶測定方法，能反映蛋白酶對不同蛋白質(zhì)底物的水解行為。上世紀(jì)50年代我國還沒有酶制劑工業(yè)，也沒有測定蛋白酶的標(biāo)準(zhǔn)方法，其時國外已發(fā)展了不少測定蛋白酶活性的方法，例如明膠液化法、明膠粘度下降法、明膠甲醛滴定法、酪蛋白血紅蛋白沉淀法、275 nm紫外分光光度法、Folin試劑顯色法，以及Gross-Fold法、DHT酪蛋白測定法等等。由于Folin試劑顯色法靈敏度高，即使微弱的蛋白酶活性也可以顯示出來，因此我們在國內(nèi)首先選用了Folin試劑比色法來測定蛋白酶活性，那時光電比色計已算是很高級的儀器了，而Folin試劑得自己來合成，此法在國內(nèi)推廣后，經(jīng)中國發(fā)酵協(xié)會驗證后，申報國家標(biāo)準(zhǔn)局列為國家標(biāo)準(zhǔn)法。其實此法還存在一些問題尚待解決。我們在酸性蛋白酶研究時，用Folin法測定金屬離子對酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)向酶液添加終濃度2×10-3mol/L的銅、錳、鋁等金屬離子時，可明顯提高酸性蛋白酶的活性，尤其這三者同時添加時，酶活性可增強三倍(表1)，因而得出Cu2+、Mn2+、Al3+可激活酸性蛋白酶活性的結(jié)論，并發(fā)表在《微生物學(xué)報》[1976,16(3):220-223]和作者參與編寫的《酶制劑工業(yè)》、《酶制劑生產(chǎn)技術(shù)》等書中，40多年來被廣泛引用，但在2005年筆者等利用宇佐美曲霉酸性蛋白酶試制高效酒精發(fā)酵劑時，試圖向酶粉添加銅離子等來增強蛋白酶活性，同一樣品同時用紫外分光光度法測定法與Folin法測定酶活性，卻發(fā)現(xiàn)用紫外分光光度法測定280 nm吸光值的方法，Cu2+、Mn2+等對酶活性非但無激活作用反而有輕度的抑制。雖然Folin法測定對這些金屬離子對酶活性仍呈明顯的促進(jìn)作用(表2)。令人百思不解，查遍有關(guān)文獻(xiàn)終于在日本酶學(xué)泰斗赤崛四郎1950年所著巨著《酵素研究法》第二卷蛋白酶一章中得到啟發(fā)，他說“Folin法與紫外分光法相比，靈敏度高，尤其加有銅的Folin試劑靈敏度更高，適合于微量蛋白酶的檢測，與之相反，紫外分光275 nm吸收法，不受加銅的影響”，可見銅離子的存在可引起酪氨酸與Folin試劑的藍(lán)色反應(yīng)增強而造成銅離子可增強蛋白酶活性之假像，以致造成誤導(dǎo)，為此將此發(fā)現(xiàn)發(fā)表在《江蘇調(diào)味劑食品雜志》，但未受到有關(guān)人員的注意，陸續(xù)有人在其文章中仍談到銅等金屬離子對酸性蛋白酶呈激活作用。令人費解的是我們在1967年進(jìn)行棲土曲霉蛋白酶研究時，同樣是用Folin法來測定金屬元素對酶活性的影響的，卻并未發(fā)現(xiàn)銅離子對中性蛋白酶的激活作用(表3)，唯一的區(qū)別是酸性蛋白酶是在酸性環(huán)境下作保溫處理，

表1 金屬離子對酸性蛋白酶活性的激活作用*

表2 金屬離子對宇佐美曲霉酸性蛋白酶活性影響*

表3 金屬離子對棲土曲霉中性蛋白酶的影響*

而中性蛋白酶是在中性環(huán)境下處理的，除此無法解釋，這恐怕還有待于今后學(xué)者去探明了。

4 后記

上世紀(jì)60年代我國科技界為貫徹科研14條，通過批判“知識私有”、“技術(shù)壟斷”、“名利思想”等資產(chǎn)階級思想，提倡共產(chǎn)主義風(fēng)格，我們與大家一樣，對科研上的有所發(fā)現(xiàn)、有所心得以及一些know how都會無保留地與同行共享，甚至連原始記錄也會公開給前來學(xué)習(xí)取經(jīng)的同志參閱，唯恐對方不掌握。技術(shù)交流會、技術(shù)鑒定會、主辦方都能把技術(shù)無保留地與大家交流，使與會者深為受益，當(dāng)時的研究論文報告都能翔實記敘研究過程的細(xì)節(jié)，可以照搬重復(fù)出來，因之國內(nèi)有些科研內(nèi)容時有雷同而水平也相仿。

在谷氨酸發(fā)酵研究中，北大錢存柔教授將其分離得到的谷氨酸桿菌29906無私地供給我們研究，中科院上海生化所的周光宇先生將其國外學(xué)習(xí)帶回的栓壓法測定谷氨酸和紙層析、電泳等新技術(shù)無私傳授給我們，上海植物生理研究所焦瑞身先生將其從國外帶回的黑曲霉337與330提供給我們研究，使液體曲制酒精得以迅速完成，上海醫(yī)藥工業(yè)研究院童村院長將其抗生素發(fā)酵摸索得出的一套染菌防治措施無保留地傳授給我們，解決了谷氨酸發(fā)酵罐經(jīng)常染菌的問題，在葡萄糖異構(gòu)酶的研究中，江蘇化工研究所將其鏈霉菌生產(chǎn)異構(gòu)酶的資料、固定化技術(shù)連同菌種毫無保留提供我們作進(jìn)一步的研究，同樣我們也將自己的研究心得無保留地奉獻(xiàn)給前來取經(jīng)學(xué)習(xí)的同行，例如蘑菇菌絲體深層培養(yǎng)技術(shù)，國內(nèi)外首創(chuàng)的用蘑菇深層培養(yǎng)菌絲體作農(nóng)業(yè)栽培種的方法，以及經(jīng)過千百次試驗成功的糖蜜原料發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸的研究都無保留地傳授給前來學(xué)習(xí)的同行，使這些技術(shù)得以在外地推廣應(yīng)用。在谷氨酸發(fā)酵研究中，周光宇先生提供的利用谷氨酸脫羧酶栓壓法測定谷氨酸的方法在全國味精行業(yè)獲得推廣，但因老方法制取的脫羧酶活性不高反應(yīng)時間長，影響工作效率，我們通過研究，向培養(yǎng)基添加含有脫羧酶輔酶維生素B6的酵母，使大腸桿菌脫羧酶總活性增加了5倍，反應(yīng)時間由24 min縮短到6 min～7 min，大大提高了工作效率和正確性，我們主動將這一研究結(jié)果油印后寄發(fā)全國味精廠和科研大專院校交流共享，像這樣將研究成果無保留給兄弟單位參考的事在當(dāng)年是很平常的事。當(dāng)時，發(fā)表研究論文，為避免名利思想之嫌大多以單位名義發(fā)表，若合作方是工廠企業(yè)，則署名時將工廠企業(yè)列在前，而科研設(shè)計單位列于后。80年代改革開放以來，為了促進(jìn)競爭，實現(xiàn)了專利制，加強了保密觀念，技術(shù)成果實行有償轉(zhuǎn)讓，一段時間甚至有些技術(shù)交流咨詢也實行起按時計費等等，一些研究報告、技術(shù)鑒定資料、論文和技術(shù)總結(jié)也語焉不詳，只起到自我推介廣告的作用。因此，如何做到既保密又實用而且有學(xué)術(shù)交流價值，是值得研究的。