非編碼RNA在骨代謝及骨重建中作用的研究進(jìn)展

黃竹 楊嵐 江千舟 郭呂華

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，廣州口腔疾病研究所，廣州醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（廣州510140）

隨著二代深度測(cè)序等新技術(shù)的不斷發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)大部分人類基因組被轉(zhuǎn)錄成RNA，但這其中只有不到2%的RNA序列進(jìn)行蛋白質(zhì)的編碼，剩余的大部分RNA序列并不參與蛋白質(zhì)的編碼，被稱為非編碼 RNA（non-coding RNAs，ncRNAs）［1］，這表明非編碼RNA占了RNA的絕大部分，了解其主要功能和作用機(jī)制才能更深入理解機(jī)體的病理生理狀態(tài)。非編碼RNA通過募集表觀遺傳調(diào)節(jié)因子或轉(zhuǎn)錄因子來激活或沉默轉(zhuǎn)錄過程，在細(xì)胞活動(dòng)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用［2］。ncRNAs廣泛參與機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育過程，并與各種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，而近年的研究發(fā)現(xiàn)，ncRNAs與骨改建、成骨分化以及骨代謝相關(guān)疾病密切相關(guān)［3-5］。了解非編碼RNA在骨代謝和骨修復(fù)重建中的作用機(jī)制，有助于探明骨相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)理，為骨相關(guān)疾病的臨床治療提供理論基礎(chǔ)。本文通過對(duì)幾種常見非編碼RNA調(diào)節(jié)相應(yīng)骨細(xì)胞，促進(jìn)成骨分化的相關(guān)研究進(jìn)行綜述，闡明非編碼RNA在骨修復(fù)重建及骨相關(guān)疾病中的研究進(jìn)展。

1 非編碼RNA家族

不編碼蛋白的RNA家族根據(jù)功能可分為兩大家族：管家非編碼RNA（housekeeping noncoding RNAs）和調(diào)控性非編碼RNA（regulatory noncoding RNAs）。其中管家非編碼RNA包括了轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNAs），核糖體RNA（rRNAs）和胞質(zhì)小RNA（small cytoplasmic RNAs，scRNAs）。管家 ncRNA 在轉(zhuǎn)錄翻譯的過程中多個(gè)環(huán)節(jié)起作用，是蛋白表達(dá)不可或缺的組成部分；而調(diào)控性非編碼RNA是隨著各種基因技術(shù)的發(fā)展才逐漸步入人們視線的新發(fā)現(xiàn)的RNA類型。大量的研究顯示這一類RNA在幾乎所有生物活動(dòng)中發(fā)揮作用，是生物體RNA的重要組成部分。調(diào)控性非編碼RNA根據(jù)長(zhǎng)度可分為兩類：分為短鏈非編碼RNA和長(zhǎng)鏈非編碼RNA。其中短鏈非編碼RNA是由少于200核苷酸組成，主要包括小干擾RNA（small interfering RNAs），微小RNA（microRNAs，miRNAs）以及PIWI相互作用RNA（piRNAs），目前研究較為廣泛的是miRNAs。據(jù)估計(jì)，人類基因組編碼超過1 800種miRNAs。而長(zhǎng)度＞200核苷酸的RNA成為長(zhǎng)鏈非編碼RNA。近年來，還出現(xiàn)一種帶有環(huán)形結(jié)構(gòu)的環(huán)狀RNA。微小RNA，長(zhǎng)鏈非編碼RNA，和環(huán)狀RNA是目前研究較為廣泛的幾種ncRNAs。

1.1 微小 RNA（micro RNAs，miRNAs） 微小RNA是一類存在于所有真核細(xì)胞中，長(zhǎng)度約為20～22核苷酸的莖環(huán)狀內(nèi)源性小RNA，大多位于非編碼區(qū)內(nèi)。miRNA通過結(jié)合序列互補(bǔ)配對(duì)信使RNA轉(zhuǎn)錄本的3′-UTR端，能有效降低靶基因的表達(dá)水平，負(fù)向調(diào)控蛋白的表達(dá)［6］。miRNA對(duì)蛋白的負(fù)向調(diào)控作用通過以下3種機(jī)制來實(shí)現(xiàn)：（1）RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex，RISC）對(duì)互補(bǔ)區(qū)域的信使RNA進(jìn)行切割和降解是其主要的作用機(jī)制；（2）與信使RNA結(jié)合和去穩(wěn)定化；（3）降低核糖體翻譯的效率［7］。人類基因組編碼著大約1 800種miRNAs，并且接近三分之二的編碼蛋白的基因擁有miRNA的結(jié)合位點(diǎn)［8］。miRNAs在骨的形成和代謝中發(fā)揮重要作用，如miR-21、miR-31、miR-155等miRNAs在破骨細(xì)胞形成或發(fā)揮作用過程中高表達(dá)而被廣泛研究［9］。

1.2 長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNAs，lncRNAs） lncRNAs可分為5種，反義長(zhǎng)非編碼RNA（antisense lncRNAs）、內(nèi)含子非編碼 RNA（intronic transcriptlncRNAs）、lincRNA（large intergenic noncoding RNAs）、啟動(dòng)子相關(guān)lncRNA（promoter-associated lncRNAs）、非非翻譯區(qū) lncRNA（UTR associated lncRNAs）。lncRNAs不直接參與蛋白的編碼，而是通過多種機(jī)制參與蛋白調(diào)控，如組蛋白修飾、DNA甲基化、染色質(zhì)重構(gòu)、作為競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)源性RNA（ceRNA，competing endogenous RNA）、參與mRNA穩(wěn)定化和支架蛋白的募集等［5］。由于lncRNAs分子結(jié)構(gòu)的靈活性，lncRNAs既能通過堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合RNA，又能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)甚至三級(jí)結(jié)構(gòu)等多種折疊構(gòu)象結(jié)合蛋白，影響轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)，使lncRNAs形成可調(diào)節(jié)DNA、RNA分子和蛋白復(fù)合體的廣泛調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)［10］。

1.3 環(huán)狀RNA（circular RNAs，circRNAs） 20世紀(jì)70年代末首次在真核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)circ RNA，它是一類廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的非編碼RNA（Non-coding RNAs）。與常規(guī)線性RNA不同，環(huán)狀RNA以連續(xù)共價(jià)閉合環(huán)的特殊結(jié)構(gòu)取代線性RNA分子3′-帽子結(jié)構(gòu)以及5′-多聚核苷酸末端結(jié)構(gòu)，使環(huán)狀RNA具有更高的穩(wěn)定性和保守性。隨著現(xiàn)代基因研究技術(shù)的發(fā)展，大量證據(jù)［11］表明circRNAs并非是錯(cuò)誤剪接的產(chǎn)物，而是在生物體內(nèi)發(fā)揮著重要的作用，并與人類疾病的發(fā)生發(fā)展有著緊密的關(guān)聯(lián)。環(huán)狀RNA通過調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯、拼接等關(guān)鍵步驟介導(dǎo)多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程。circRNAs主要的作用是其本身存在大量miRNA結(jié)合位點(diǎn)，可以通過“海綿吸附”機(jī)制誘捕miRNA，從而調(diào)節(jié)靶基因翻譯。此外，它可以作為調(diào)控因子在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)親本基因進(jìn)行調(diào)控，它還可以直接對(duì)蛋白進(jìn)行調(diào)控，協(xié)調(diào)蛋白與蛋白之間的關(guān)系［11］。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA與骨相關(guān)疾病發(fā)生關(guān)系密切，如骨肉瘤的發(fā)生［12］。

2 非編碼RNA對(duì)骨代謝以及骨修復(fù)再生的影響

人體正常骨組織維持在一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡中，骨重建是一個(gè)終身的過程，是新骨組織形成和成熟骨組織再吸收之間動(dòng)態(tài)平衡的過程［13］。成骨和破骨兩個(gè)過程不斷進(jìn)行，并達(dá)到一定的平衡和穩(wěn)定。ncRNAs作為人類基因組的大部組成部分，在胚胎骨骼發(fā)育以及成熟骨組織種都發(fā)揮重要作用，影響著骨骼內(nèi)外各種相關(guān)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化以及凋亡等各項(xiàng)生理活動(dòng)［4-5，14］。

2.1 ncRNAs對(duì)成骨細(xì)胞（osteoblast）破骨細(xì)胞（osteoclast）的作用 目前已有多個(gè)研究證明多種ncRNAs在成骨分化過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。成骨細(xì)胞是來自間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）系的分化細(xì)胞。CHONG等［15］通過對(duì)MACF1沉默的前成骨細(xì)胞測(cè)序分析篩選得到lncRNA AK016739，并證明lncRNA AK016739通過抑制轉(zhuǎn)錄因子RUNX2和TCF7/LEF1來抑制骨的成骨細(xì)胞分化和骨的生成。QIAN等［16］用BMP2處理過的MC3T3-E1細(xì)胞，158個(gè)環(huán)狀RNA的表達(dá)發(fā)生改變，其中有74個(gè)上調(diào)和84個(gè)下調(diào)，其中hsa_circ_0005846、hsa_circ_0019142和hsa_circ_0010042顯著上調(diào)。破骨細(xì)胞來源于由多能造血干細(xì)胞產(chǎn)生的單核-巨噬細(xì)胞前體細(xì)胞，主要介導(dǎo)骨組織的吸收。破骨細(xì)胞在形成過程中，多個(gè)miRNAs發(fā)揮作用，其中miRNA-21是迄今為止鑒定最為廣泛的促破骨細(xì)胞生成的miRNA 之一［17］。CAI等［18］通過將載 miR-214沉默抑制劑的納米材料，凍干后溶解靜脈注射入卵巢摘除小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)骨吸收程度較陰性對(duì)照組降低，經(jīng)證實(shí)是miR-214通過減弱破骨細(xì)胞的活動(dòng)起作用。

2.2 ncRNAs對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）的作用 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone-derived mesenchymal stem cells，BMSCs）是一類具有多向分化潛能的細(xì)胞，在骨組織工程中起著重要的作用。研究表明在骨修復(fù)重建過程中，BMSCs的多種ncRNAs會(huì)發(fā)生不同程度的改變。ZHANG等［19］對(duì)成骨誘導(dǎo)分化處理后的hBMSCs進(jìn)行編碼和非編碼轉(zhuǎn)錄本表達(dá)的功能網(wǎng)絡(luò)分析和生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)了6種核心的調(diào)控 lncRNAs（XR_111050、NR_024031、FR374455、FR401275、ER406817和 FR148647），并且進(jìn)一步驗(yàn)證lncRNA（XR_111050）可增強(qiáng)MSCs的成骨分化。REN等［20］通過CGRP刺激小鼠BMSCs細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo)處理后進(jìn)行基因芯片測(cè)序發(fā)現(xiàn)58個(gè)差異表達(dá)的circRNAs，其中44個(gè)下調(diào)，14個(gè)上調(diào)并驗(yàn)證mmu_circRNA_003795在成骨誘導(dǎo)過程中顯著上調(diào)，說明環(huán)狀RNA在BMSCs在成骨分化過程中發(fā)揮重要的作用。XIAO等［21］的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，miR-483-3p通過靶向STAT1來增強(qiáng)RUNX2的轉(zhuǎn)錄活性，從而促進(jìn)BMSCs的成骨分化，由此確定miR-483-3p在成骨誘導(dǎo)中的作用，并提示miR-483-3p為治療骨質(zhì)疏松癥的新型潛在治療靶標(biāo)。

2.3 ncRNAs對(duì)牙周膜干細(xì)胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）的作用 PDLSCs具有自我更新能力以及多向分化潛能，特別是成骨向分化潛能。LIU等［22］使用R語言篩選出人的牙周炎牙周膜組織與健康牙周膜組織之間差異表達(dá)的lncRNAs和mRNAs。結(jié)果顯示，與健康樣本相比，牙周炎樣品中的LncRNA MEG3和LncRNA IGF1的表達(dá)降低，而miR-27a-3p的表達(dá)則升高。實(shí)驗(yàn)證明過表達(dá)MEG3可升高IGF1的表達(dá)從而抑制miRNA-27a-3p來促進(jìn)成骨分化。ALP和ARS染色的結(jié)果表明，lncRNA MEG3或IGF1的上調(diào)促進(jìn)了PDLSCs的成骨分化，而miRNA-27a-3p的上調(diào)則可以抑制成骨。在牙周炎患者中，MEG3的表達(dá)下調(diào)并通過miR-27a3p/IGF軸抑制了PDLSCs的成骨分化。另外，通過微陣列分析發(fā)現(xiàn)，miRNAs也參與到PDLSCs成骨向分化的過程中［23］。

3 非編碼RNA與骨相關(guān)疾病的關(guān)系

臨床上，正常的骨結(jié)構(gòu)處于由成骨過程和破骨過程相協(xié)調(diào)的動(dòng)態(tài)平衡過程，一旦這個(gè)平衡被打破，就引起一系列的骨相關(guān)疾病等病理現(xiàn)象。骨關(guān)節(jié)炎、牙周炎、骨質(zhì)疏松等被認(rèn)為是與骨破壞相關(guān)的疾病。ncRNAs與這些骨相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［4-5，14］。

3.1 骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA） OA是以關(guān)節(jié)軟骨的退變及損傷為病理特征的慢性疾病，其病理特點(diǎn)為關(guān)節(jié)軟骨磨損退變，關(guān)節(jié)邊緣和軟骨下骨反應(yīng)性增生，骨贅形成。臨床表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)功能異常。XING等［24］骨關(guān)節(jié)病組織與正常組織相比，有121個(gè)IncRNA表達(dá)異常，其中上調(diào)的73個(gè)，下調(diào)的48個(gè)。六種 lncRNAs（HOTAIR，GAS5，PMS2L2，RP11-445H22.4，H19和CTD-2574D22.4）的表達(dá)在OA軟骨中上調(diào)，可能是通過增加MMP-9，MMP-13，BMP-2和ADAMTS5表達(dá)來調(diào)節(jié)的。IncRNAs可以通過甲基化或乙?；瘜?duì)組蛋白進(jìn)行修飾，進(jìn)而調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄活性。若充分利用IncRNAs的表觀遺傳干預(yù)能力，可進(jìn)行基因的靶向治療，甚至可能研發(fā)出一些靶向治療的藥物。

3.2 骨質(zhì)疏松 骨質(zhì)疏松（osteoporosis）是隨著年齡增大，人群發(fā)病率增高，以皮質(zhì)骨變薄，微結(jié)構(gòu)受損，骨小梁數(shù)量下降為特征，使骨骼易患骨脆性和骨折的風(fēng)險(xiǎn)增高的一種全身骨代謝障礙性疾病［24］。許多研究證明骨質(zhì)疏松與miRNAs調(diào)節(jié)有關(guān)。最近的研究表明，在骨質(zhì)疏松性骨折患者的血清中有幾種miRNA的表達(dá)顯著上調(diào)，并且可以影響成骨分化［17］。CHENG 等［25］檢測(cè)骨質(zhì)疏松患者的血清發(fā)現(xiàn)miRNA-365a-3p的表達(dá)顯著升高，通過預(yù)測(cè)網(wǎng)站miRanda預(yù)測(cè)并進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證了miRNA-365a-3與靶基因RUNX2的結(jié)合，下調(diào)miRNA-365a-3的表達(dá)能顯著降低成骨相關(guān)基因（OCN、OPN、collagen I）的表達(dá)。LI等［26］在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者的血清中檢測(cè)到miR-133a上調(diào)，這個(gè)結(jié)果與患者的腰骨礦物質(zhì)密度（BMD）呈負(fù)相關(guān)。經(jīng)證明，在體外敲除miR-133a可以抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成，在體內(nèi)可以減輕去卵巢大鼠的骨質(zhì)流失。目前有關(guān)骨質(zhì)疏松的基因研究，大部分聚焦于miRNAs，而lncRNAs和circRNAs在骨質(zhì)疏松這方面的研究目前較少［27-28］。越來越多的證據(jù)表明miRNAs在調(diào)節(jié)骨穩(wěn)態(tài)中起著關(guān)鍵作用。

3.3 骨肉瘤 在骨腫瘤發(fā)生和發(fā)展中circRNAs的表達(dá)水平失調(diào)已被證實(shí)扮演著極為重要的角色［29］。研究發(fā)現(xiàn)在人骨肉瘤組織中circUBAP2的表達(dá)顯著升高，并證實(shí)其是通過抑制miR-143的表達(dá)，上調(diào)Bcl-2的表達(dá)水平，提示circUBAP2在骨肉瘤的診斷治療和預(yù)后預(yù)測(cè)存在巨大潛力［30］。lncRNAs在骨肉瘤中也差異表達(dá)。有研究證明在骨肉瘤組織中，MiR-200s表達(dá)下調(diào)，與骨肉瘤組織中的lncRNA ZEB1-AS1和靶基因ZEB1表達(dá)水平負(fù)相關(guān)，上調(diào)lncRNA ZEB1-AS1可海綿吸附MiR-200s，從而使ZEB1表達(dá)水平上調(diào)。lncRNA ZEB1-AS1下調(diào)和miR-200s過表達(dá)的組合顯著抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖和遷移［31］。circRNAs和lncRNAs在骨肉瘤中通過miRNAs發(fā)揮作用，對(duì)于骨肉瘤疾病的診斷及預(yù)后預(yù)測(cè)都有著重要的影響。

3.4 牙周炎 牙周炎是多因素引起的牙周組織進(jìn)行性喪失的慢性疾病，除了微生物的作用，也可通過基因和表觀遺傳學(xué)因素調(diào)節(jié)牙周病原體誘導(dǎo)的宿主炎癥反應(yīng)來影響牙周炎的進(jìn)展［32］。LI等［33］利用生物信息學(xué)分析的方法對(duì)多個(gè)牙周炎樣本測(cè)序芯片數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，6個(gè)信使RNA（mRNAs）（HSPA4L、PANK3、YOD1、CTNNBIP1、EVI2B、ITGAL），3個(gè) miRNAs（hsa-miR-125a-3p、hsa-miR-200a、hsa-miR-142-3p）和 3個(gè) lncRNAs（MALAT1、TUG1、FGD5-AS1）可能參與到牙周炎發(fā)病過程與lncRNA相關(guān)的內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)網(wǎng)絡(luò)中。WANG等［34］對(duì)牙周炎患者與健康人的血液樣本進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，牙周炎患者在治療前l(fā)ncRNA AWPPH在血液中的表達(dá)水平明顯高于健康人，在接受治療后，lncRNA AWPPH表達(dá)水平降低。在對(duì)這些患者進(jìn)行跟蹤隨訪的時(shí)候，發(fā)現(xiàn)lncRNA AWPPH的水平與牙周炎復(fù)發(fā)情況呈正相關(guān)關(guān)系，高表達(dá)水平的lncRNA AWPPH可預(yù)測(cè)牙周炎的復(fù)發(fā)。牙周炎的發(fā)生發(fā)展與lncRNAs的調(diào)控有關(guān)。

4 總結(jié)與展望

非編碼RNA是人體內(nèi)重要的調(diào)控分子，在機(jī)體的病理生理狀態(tài)發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用。目前骨關(guān)聯(lián)疾病的病因和發(fā)病機(jī)制尚未闡明。在健康成熟的機(jī)體中，骨組織不斷進(jìn)行的骨改建是在破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收和成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成處于動(dòng)態(tài)平衡中進(jìn)行的，一旦這個(gè)平衡被破壞，就會(huì)引起病理性骨的動(dòng)態(tài)改建，而非編碼RNA在這個(gè)過程中扮演重要角色。

其中，相比于lncRNAs和circRNAs的海綿吸附作用間接調(diào)控靶基因，miRNAs對(duì)于靶基因的調(diào)控更為直接。miRNAs通過其特異性靶點(diǎn)和靶點(diǎn)介導(dǎo)的下游通路發(fā)揮作用。不同的miRNAs針對(duì)不同的基因。同一miRNA調(diào)控的靶基因往往因細(xì)胞和組織類型的不同而不同。即使在相同的細(xì)胞類型中，相同的miRNA目標(biāo)靶點(diǎn)在不同的應(yīng)激或疾病環(huán)境下也可能不同，這可能是由于不同條件下的基因表達(dá)和調(diào)控譜不同造成的。這說明miRNAs靶向基因調(diào)控具有高度特異性，對(duì)環(huán)境變化十分敏感。因此，在研究miRNAs在骨代謝疾病中的作用時(shí)，可針對(duì)不同人群、環(huán)境等條件對(duì)疾病加以區(qū)分研究。此外，同樣的生物過程，如破骨細(xì)胞分化，可以由多個(gè)miRNAs調(diào)控，其功能可能相互疊加，也可能相互補(bǔ)償。由此可見，在骨相關(guān)代謝疾病臨床前開發(fā)和臨床試驗(yàn)中，考慮特定miRNA靶向不同靶點(diǎn)的潛在副作用是非常重要的。

另一方面，在成骨相關(guān)研究中，circRNAs、lncRNAs研究較多的是它們的海綿吸附作用，它們能夠隔離miRNA并阻止其與mRNA靶點(diǎn)的結(jié)合。這些都增加了骨重建、骨代謝過程中基因調(diào)控的復(fù)雜性。盡管有研究表明它們還可以通過對(duì)靶基因的直接調(diào)控起作用，如circRNAs可作為內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)的序列來促進(jìn)起始因子或核糖體與可翻譯的circRNA直接結(jié)合［35］。但目前在成骨機(jī)制研究方面，circRNAs及l(fā)ncRNAs直接調(diào)控靶基因的研究尚不充分［36］，因此，后續(xù)研究可以從這方面深入。

在促進(jìn)成骨的環(huán)境或破骨的環(huán)境中，對(duì)于miRNA-mRNA和miRNA-ceRNA甚至是lncRNA-mRNA或circRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)的理解，對(duì)于有關(guān)非編碼RNA在骨代謝及骨再生相關(guān)調(diào)控機(jī)制的研究將有助于臨床上多種骨關(guān)聯(lián)疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究。由于miRNA分子靶向基因?qū)Νh(huán)境敏感的特異性，以及ceRNA網(wǎng)絡(luò)的多樣性，增加了機(jī)制研究的復(fù)雜性，但也為研究提供了更多的機(jī)會(huì)與可能，為骨關(guān)聯(lián)疾病治療提供了方向。