單細胞測序相關技術及其在生物醫(yī)學研究中的應用

張慧 徐楚帆 江來

上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院麻醉與重癥醫(yī)學科（上海200092）

細胞是構成生物體的基本組成單位，即便來源于相同個體同一細胞系，具體細胞在基因組、轉錄組、表觀遺傳組都可能呈現不同的特點［1］。以往基因組研究得到的結果往往是一群細胞基因表達的平均值，因而難以明確在生命發(fā)育及疾病發(fā)生過程起關鍵作用的具體細胞類型［2］。隨著分子生物學技術的飛速發(fā)展，通過對單個細胞進行全基因組或轉錄組的擴增后進行下一代測序（next generation sequencing，NGS）技術測序，單細胞測序技術（single cell sequencing，SCS）實現了單細胞的全基因組測序，從而揭示細胞群體差異和細胞進化關系［3］。目前，SCS技術已經應用于生命科學的各個方面，并逐漸在臨床疾病的診斷治療發(fā)揮重要作用，因此本文將對SCS技術進行總結概述，并對其最新應用進行介紹。

1 單細胞分離技術

單細胞分離是進行單個細胞研究的第一步，現有的單細胞分離方法包括熒光激活細胞分選、激光捕獲顯微切割和微流控技術等。熒光激活細胞分選是目前應用最多的單細胞分離方法，熒光標記是其實現單細胞篩選的基礎。熒光激活細胞分選需要懸浮大量細胞而實現分選，具有自動化高通量的優(yōu)勢，但不利于分離數量較少的細胞種群。此外，篩選過程產生的高流速可能對細胞活力造成損傷［4］。激光捕獲顯微切割通過顯微直視操作，利用激光束熔化覆蓋于組織切片上的熱塑聚合物薄膜，冷卻后將目的細胞固定于膜上從而實現細胞分離。激光捕獲顯微切割技術（LCM）是一種非接觸技術，在顯微解剖后不會破壞鄰近組織［4］，但人為操控細胞的選取和分離嚴重限制了通量［5］。微流控技術是一項新近發(fā)展起來、具有極好應用前景的單細胞分離技術。微流控技術在微尺水平上分選目的細胞，芯片精密的幾何學技術有效減少移液誤差，間接降低了微流控裝置所需底物含量［6］。此外，利用微流控技術可以實現在微流控芯片上對細胞進行操控，例如通過特定因子溶解上游細胞為下游細胞測序騰出空間［7］。

2 單細胞測序技術

基因測序技術是基因組學研究的關鍵，自Sanger測序法為代表的第一代測序技術發(fā)明以來，基因測序技術不斷發(fā)展，下一代測序方法實現了全基因組的高通量、低成本和快速化檢測，現已成為單細胞測序的首選方法。

2.1 單細胞基因組測序 單個二倍體細胞僅含6pg DNA，為獲取足夠多的DNA進行測序需要在測序前對DNA進行擴增，主要技術為全基因組擴增（WGA）。目前，WGA可細分為簡并寡核苷酸引物聚合酶鏈反應（DOP-PCR），多重置換擴增法（MDA）以及多重退火環(huán)狀循環(huán)擴增法（MALBAC）。DOP-PCR使用Taq DNA聚合酶，可以準確保留拷貝數水平，但因覆蓋度低使其難以檢測堿基水平的突變而應用受限。MDA通過使用Phi29或Bst DNA聚合酶使單細胞基因組或外顯子組達到高于90%的高覆蓋度，但存在覆蓋度不均而使閱讀深度失真，從而降低DNA拷貝數的測定［8］。MALBAC技術使用Bst DNA聚合酶形成環(huán)狀DNA片段后再進行線性PCR擴增，可同時獲取拷貝數變異（CNVs）和單核苷酸多態(tài)性（SNPs）［9］。為克服MALBAC所存在的假陽性率高的缺點，采用高保真DNA聚合酶代替Bst DNA聚合酶，可以減少擴增誤差從而優(yōu)化MALBAC［10］。通過擴增結束的產物來構建DNA文庫，再通過Illumina平臺或其他平臺進行下一步的測序工作。

2.2 單細胞轉錄組測序 單細胞轉錄組測序需先將mRNA逆轉錄成cDNA，再對cDNA進行擴增。近年來涌現出多種單細胞cDNA擴增法，如末端加尾法、Smart-seq、Cell-seq和獨特分子識別標識的全轉錄組擴增方法。末端加尾法是在第一鏈cDNA的3′末端加上一連串脫氧核苷酸A或G，然后利用其互補核苷酸T或C形成多聚引物，從而合成第二鏈cDNA。Smart-seq利用反轉錄酶的末端轉移酶和模板轉換活性在單細胞水平上生成并擴增全長cDNA，有效增加全長轉錄數量，但其擴增靈敏度較低。Cell-seq利用體外轉錄反應進行擴增，其線性擴增的方式可以減少擴增偏倚，但因其不能擴增全長cDNA，會引起部分轉錄組信息的丟失［11］。為了改善上述方法的局限，采用獨特分子識別標識（unique molecular identifiers，UMIs）的全轉錄組擴增方法應運而生。寡聚脫氧胸腺嘧啶序列是該方法擴增識別的引物，其模板通過攜帶獨特分子標識而識別轉換寡核苷酸，有效降低定量偏差和技術噪聲［12］。

2.3 單細胞表觀基因組測序 表觀基因組學是在基因組水平上對表觀遺傳學改變的研究。Hi-C法是最先被提出的單細胞表觀基因組測序方法，可在百萬堿基分辨率的基礎上識別單細胞水平的染色體相互作用［13］，隨后，科學家利用單細胞亞硫酸鹽測序法（scRRBS）對小鼠個體胚胎干細胞1500萬個CpG位點的胞嘧啶甲基化修飾進行測量，使得單細胞和單堿基水平上的DNA甲基化分析成為可能［14］，新的改進方法通過結合NGS可以進行全基因組亞硫酸鹽測序，實現在全基因組水平上評估DNA甲基化［15］。ATAC-seq則是表觀基因組測序的又一大進步，是一項使用高通量測序對易接近轉座酶核染色質區(qū)域進行分析的一種創(chuàng)新表觀遺傳學研究技術［16］，通過單細胞ATAC-seq技術，研究者從254個個體的GM12878類淋巴母細胞中描繪出可及性DNA圖譜，提出了對細胞間變異的深度見解［17］。

3 單細胞測序技術的應用

3.1 神經生物學 神經細胞是最具形態(tài)多樣化的細胞之一，以往通常根據神經元形態(tài)或化學特性區(qū)分不同神經元，單細胞測序克服了傳統分類方法在精準性上的缺陷。USOSKIN等［18］證實了一些已知的主要神經元的分型，還為新的神經元亞型分類提供了生物標志物：TAC1和FAM19A1分子識別PEP神經元，以富含大量Piezo2和特異性Slc17a8分子標記TH神經元，用溶血磷脂酸受體標識NP1神經元等。此外，一些研究對小鼠的多巴胺能神經元、背根神經節(jié)以及大腦皮質神經元進行了以單細胞轉錄組學為基礎的分類，揭示不同神經元在分子水平的生物學特性，描述了不同神經元之間的連接，并為神經退行性疾病以及神經精神疾病的研究提供了新的思路［19］。

3.2 微生物 目前，由于微生物的DNA和RNA含量少、擴增難度大，地球上超過99%的微生物不能在實驗室進行培養(yǎng)和繁殖［20］，對其遺傳信息的了解較少。而單細胞測序則為探索微生物基因組，揭示微生物種類的多樣性提供了可能。研究者利用單細胞基因組學對9個不同來源、屬于29個主要生命樹未知分支（即所謂“微生物暗物質”）的201個古細菌和細菌細胞進行了靶向測序，通過獲得的基因組信息闡明繁復的門內及門間關系，有利于在微生物水平上對生態(tài)系統進行解釋。SCS極大地擴充了有關生命樹的基因組信息，使生物進化得到更加系統化的認識［3］。

3.3 胚胎發(fā)育 早期胚胎發(fā)育伴隨廣泛的轉錄調控和表觀遺傳再編碼，由于可獲取的細胞數量少，傳統的測序方法難以反映此過程的基因組信息。單細胞測序克服這一缺點，成功揭示胚胎發(fā)育過程中細胞分化的多樣性和基因組信息調節(jié)的復雜性。用單細胞RNA測序分析人類和小鼠胚胎從卵子到桑椹胚發(fā)育過程，得出胚胎發(fā)育過程中細胞周期、基因調控、翻譯和代謝的轉錄改變的相繼次序。有研究使用單細胞亞硫酸鹽測序的方法檢測小鼠胚胎干細胞中DNA胞嘧啶的修飾，發(fā)現其表觀遺傳的改變表現為全面的脫甲基現象［14］。因此，利用單細胞測序方法可以反映早期胚胎發(fā)育過程中轉錄調節(jié)和表觀遺傳再編程的復雜性。

3.4 器官發(fā)生 絕大多數組織中的細胞類型分類都局限于已知的部分細胞標志物，針對同一器官不同分化時期進行單細胞測序可以重建分化過程中的細胞譜系。肺祖細胞的發(fā)育追溯到它們形成肺泡氣囊時，用單細胞轉錄組學的方法研究肺上皮的發(fā)育，確定了數百種新的標記物以區(qū)分四種主要的細胞類型并利用其重建肺泡囊分化過程中的細胞譜系［21］。單細胞基因表達譜表明腎臟在發(fā)育過程中存在多譜系啟動，腎祖細胞表現出與多種潛在分化譜系相關的基因的隨機表達［22］。這些初步研究表明使用無偏倚RNA測序方法可以對細胞進行細化分類并識別器官發(fā)育過程中細胞譜系的新標志物。

3.5 免疫 免疫系統的多樣性使得宿主免受多種病原的侵害，使用傳統的方法研究得到的是參與免疫反應總細胞的平均值，而單細胞技術使得研究在宿主應答中起到關鍵作用但數量極少的細胞的成為可能［23］。通過單細胞轉錄組學，分析在體外不同條件下被刺激的小鼠骨髓來源的樹突細胞，發(fā)現單個細胞顯示出不同的反應且這種反應通過干擾素旁分泌信號進行調節(jié)［24］。此外，通過單細胞RNA測序描繪出LPS引起抗原激活后的小鼠脾臟的4 000個單細胞圖譜，揭示了7種免疫細胞類型并識別出抗原激活后1 575個可變基因反應位點［25］。因此，單細胞測序用于研究抗原激活后免疫細胞的遺傳異質性反應具有良好的前景。

3.6 單細胞測序在臨床上的應用

3.6.1 腫瘤診斷與治療 惡性腫瘤細胞往往通過基因突變產生新的致病性表型從而適應宿主體內復雜的腫瘤微環(huán)境，目前有研究報道腫瘤組織可以單個細胞為單位產生獨特的突變表型，即瘤內異質性［26］，SCS技術的運用可以有效識別單個腫瘤細胞產生的獨特突變表型，提高惡性腫瘤的精準治療［27］。首先，SCS技術可以用于腫瘤標志物的檢測，例如結腸癌伴KRAS基因突變，非小細胞肺癌伴EGFR基因突變等［28］。同時，SCS參與部分腫瘤的治療，如用下一代測序技術檢測肺腺癌患者在鉑類化療期間的血漿樣本，通過ctDNA（circulating tumor DNA）的動態(tài)變化，可以對腫瘤治療方案進行調整［29］。此外，SCS技術對腫瘤治療的評估作用也日益受到重視，如WANG等［30］發(fā)現在腫瘤進化過程中三陰乳腺癌患者的腫瘤細胞突變率明顯高于雌激素受體陽性患者的腫瘤細胞，部分解釋了臨床上雌激素受體陽性乳腺癌患者的治療效果好于三陰乳腺癌患者的現象；又如通過對治療過程中多個時間段的外周血循環(huán)腫瘤細胞（circulation tumor cells，CTCs）進行單細胞水平的測序，可以實時監(jiān)測腫瘤的發(fā)展及癌細胞異質性的動態(tài)變化［31］。

3.6.2 輔助生殖 SCS技術作為胚胎植入前遺傳學診斷（PGD）和胚胎植入前遺傳學篩查（PGS）的新手段，可以對試管嬰兒植入前的胚胎進行遺傳學分析，有利于全面了解胚胎植入前的遺傳學信息以選擇整倍體胚胎進入子宮，同時診斷單基因遺傳病和染色體病，降低反復植入失敗及流產的發(fā)生，從而提高篩選后再植入的成功率［32］。此外，通過單細胞測序檢測女性卵細胞極體細胞或胚胎細胞，選擇健康的胚胎移植，可以降低新生兒先天性遺傳疾病的發(fā)生率，有助于預防遺傳疾?。?3］。

4 單細胞測序技術的優(yōu)勢與不足

4.1 單細胞測序的優(yōu)勢 SCS技術提供了一個前所未有的單細胞水平的研究方法，解決了細胞異質性難題。有別于傳統的基因組研究，SCS技術可以對胚胎干細胞、CTCs等數量較少的細胞進行擴增測序從而允許對復雜多樣化的生物學現象進行高特異性的探索。此外，SCS技術為臨床疾病，尤其是腫瘤的個性化治療開拓新思路，促進了精準醫(yī)學的發(fā)展。

4.2 單細胞測序的不足 盡管基因組研究的成本日漸降低，SCS技術成本目前仍居高不下，影響其廣泛運用。此外，單細胞水平測序對目標細胞提取的要求高，擴增過程常出現擴增失敗和等位基因脫扣，技術誤差、技術噪音仍不可避免。同時，測序技術仍面臨著用于分析數據的計算方法嚴重缺乏的問題，需要進一步的優(yōu)化。

5 展望

SCS技術在過去幾年迅速發(fā)展，已成為生物學研究的一項新手段，并改變了我們對很多疾病的認知。SCS在微生物、免疫和腫瘤等諸多領域發(fā)揮重要作用，已知的技術缺陷正在不斷改進，通過低量級泊松過程降低轉錄組測序的技術噪音；使用靶向正交驗證區(qū)分測序過程中的技術誤差和生物異質性等。隨著不斷創(chuàng)新，尤其是NGS的進步，高通量低成本的SCS技術將會給整個生命科學界帶來重大變革。