CAR-T細胞療法：一場新的腫瘤免疫之戰(zhàn)

向茂源，張獻全

（重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院腫瘤科，重慶）

1 CAR-T細胞療法的發(fā)展歷程

數(shù)十年來，腫瘤學家一直致力于潛心專研人體免疫系統(tǒng)的潛在特性。隨著對白細胞特性認識的不斷加深，免疫療法之母即同種異體干細胞移植(alloSCT)得到了發(fā)展。Kolb[1]于他1998年發(fā)表的論文中提出了證據(jù)，證明供體淋巴細胞輸血可以使復發(fā)的慢性髓系白血病患者獲得持久緩解。

雙特異性T細胞抗體CD19×CD3（the bispecific T- cellrecruiting antibody construct CD19×CD3）也能夠清除白血病及淋巴瘤[2]。這些雙特異性抗體（BiTE）由兩個單鏈可變片段組成，一個以腫瘤相關抗原為靶點，另一個以T細胞相關抗原為靶點，旨在引導T細胞活化，從而攻擊腫瘤細胞。

2 CAR-T的結構及制造方法

不同于傳統(tǒng)T細胞受體（TCR），CAR-T細胞對腫瘤的清除不需要與人類白細胞抗原(HLA)結合，而是依賴于嵌合抗原受體（CAR）分子，這可以減少腫瘤細胞中由 HLA表達引起的免疫性逸。同時，CAR-T細胞具有分化成記憶T細胞的優(yōu)勢，由此可建立長期的抗腫瘤活性。

2.1 CAR-T的結構組成

CAR是基因改造的T細胞受體，其結合了腫瘤相關抗原結構域[常由抗體產(chǎn)生的單鏈可變片段（scFv）]、鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)和受體的共刺激結構域。免疫球蛋白IgG1、IgG4、IgD和CD8分子形成鉸鏈區(qū)，其與scFv的靈活性相關。T細胞的CD3ζ、CD4、CD8、CD28分子形成跨膜區(qū)序列。共刺激結構域主要通過CD3ζ、CD28、CD27、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)等分子激活T細胞。

CAR-T細胞至今已發(fā)展四代。1987年，第一代CARs由Kuwana提出并設計[5]，彼時的CARs僅具有CD3ζ結構域，它們不能產(chǎn)生足夠的白介素-2（IL-2），從而無法啟動持續(xù)、有效的T細胞反應。隨后，第二代CARs出現(xiàn)，二代CARs受益于雙信號T細胞抗體，如CD28或4-1BB。當CAR識別腫瘤靶點時，共刺激分子可有效地增強IL-2的合成，增強抗腫瘤活性。第三代CARs增加了更多的共刺激分子，如：OX40（CD134）、CD28、CD27、DAP10等。由于胞內(nèi)區(qū)有2個共刺激信號分子，第三代CARs在體內(nèi)的增殖能力和對腫瘤細胞的殺傷力又得到了進一步提高。第四代CARs通過細胞因子分泌的額外轉基因(如IL-12)或額外的共刺激配體的修飾，使免疫反應更加激烈，從而使抗腫瘤活性得到增強。

2.2 CAR-T的制造方法

CAR-T細胞的制造是非常復雜、精心控制的程序。該程序包括三大步驟：T淋巴細胞的體外富集、CAR-T細胞的制備、大規(guī)模擴展。CAR-T細胞過繼治療是一種以自體細胞為基礎的治療，通過白細胞分離術收集患者的外周血單個核細胞，再分離出特定的T細胞亞群，如CD4+、CD8+、CD25+或CD62L+ T細胞[6]。

分離出的T細胞起始亞群需要持續(xù)和充分的激活才能實現(xiàn)體外擴增。這就需要通過T細胞受體（信號1）和CD28、4-1BB或OX40（信號2）等共刺激信號產(chǎn)生主要的特異性信號，從而激活T細胞。再通過電穿孔、慢病毒或逆轉錄病毒載體，將CAR基因導入激活的T細胞中進行基因修飾，從而得到可表達CAR基因的CAR-T細胞。其中，慢病毒載體比逆轉錄病毒載體提供了更安全的基因組整合概況，因此已被廣泛用于CAR-T細胞療法的臨床試驗中[7]。

對獲得的CAR-T細胞進行免疫分型、存活力、內(nèi)毒素等方面的檢測，在確保生產(chǎn)的CAR-T細胞純度和安全性達到要求后回輸給患者，實現(xiàn)CAR-T免疫治療。

3 目標抗原的選擇

嵌合抗原受體（CAR）通過識別抗原，激活T細胞，從而殺死腫瘤。由于相當一部分目標抗原在非腫瘤細胞上也有表達，由此在對抗腫瘤同時也對非腫瘤細胞產(chǎn)生損害，也就是脫靶效應。因此，理想的目標應該具有高覆蓋度和高特異性，以確保有效性和安全性。

3.1 血液腫瘤目標抗原

目前，大多數(shù)具有良好臨床效果的CAR-T療法都符合高覆蓋率的選擇標準，例如CD19，CD20，CD22，CD23和B細胞成熟抗原（BCMA）等[8]。

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以CD19為例，由于CD19在B細胞白血病和淋巴瘤中的高覆蓋率，它被選為CAR-T療法中使用最廣泛的靶標。靶向CD19的CAR-T細胞對兒童和成人難治復發(fā)性B-ALL、慢性淋巴細胞白血病、非霍奇金淋巴瘤都呈現(xiàn)出持續(xù)高效的抗腫瘤活性，總緩解率在不同研究中維持在70%-94%[9]。

但是，就特異性而言，CD19不是理想的靶標。CD19表達于B細胞，在靶向CD19的CAR-T療法的抗腫瘤作用下，正常的B細胞也將被清除。因此，CAR-T細胞療法常見的靶標事件便是B細胞發(fā)育不全。幸運的是，近年來隨著臨床管理的提升，大部分患者可耐受B細胞發(fā)育不全。

CD22在成熟的淋巴瘤以及急性B淋巴細胞白血病上高表達，臨床結果表明，靶向CD22 CAR-T治療已帶來可觀的療效[10]。CD23在慢性淋巴細胞白血?。–LL）上表達，但在正常B細胞 上不表達，臨床研究表明抗CD23 CAR-T細胞對CLL細胞的生長具有一定影響[11]。

CD20和BCMA也是如此。盡管它們并未在腫瘤細胞上嚴格表達，但由于其高覆蓋率和可耐受的脫靶效應，這些靶標已顯示出廣闊的臨床前景。

3.2 實體瘤目標抗原

與血液惡性腫瘤相比，實體瘤具有更加復雜的腫瘤微環(huán)境（TME），多種免疫抑制機制和多種生化因素構建的物理障礙使得CAR-T細胞難以找準準確的靶點攻擊腫瘤細胞，因此針對實體瘤的目標抗原的研發(fā)更加困難。

由于腫瘤特異性抗原（TSA）在實體瘤細胞中有著獨特而豐富的表達[12]，它被選為最合適的目標抗原。但是，這些抗原在患有相同類型腫瘤的患者中異質性很高，必須為每位患者確定合適的TSA，再生成特異性CAR-T細胞[13]。這是一個非常復雜且昂貴的過程，因此，盡管TSA可以作為CAR-T細胞的理想靶標，但臨床運用很少[14]。隨著基因工程領域的發(fā)展，另一種類型的腫瘤抗原——腫瘤相關抗原（TAA）的多項臨床試驗正在進行中。盡管抗原TAA過表達于腫瘤組織，但其在正常組織中仍有較低的表達水平，因此經(jīng)常會引起腫瘤外毒性[15]。盡管TSA和TAA是實體CAR-T療法的首選，但當這些療法不能滿足應用需求時，尋找其他類型的靶標就變得至關重要。

一類替代抗原如成纖維細胞活化蛋白（FAP）和血管內(nèi)皮生長因子受體2（VEGFR-2），已經(jīng)取得很好的研究。這類靶標在腫瘤細胞本身不表達，但在與FAP[16]或VEGFR-2[17]相關的腫瘤脈管系統(tǒng)中高表達，CAR-T細胞可通過識別這類抗原阻礙基質形成或血管生成來破壞腫瘤生長。除上述靶標外，雙唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂2（GD2）靶點治療神經(jīng)母細胞瘤、HER2靶點治療多形性膠質母細胞瘤[18]、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC3）靶點治療肝癌以及癌胚抗原（CEA）靶點治療腸癌的CAR-T細胞療法也已有相關研究。

開發(fā)針對實體瘤的CAR-T細胞療法的最大挑戰(zhàn)是尋找有效表達于腫瘤組織而不表達于健康組織的靶抗原。

4 CAR-T所面臨的挑戰(zhàn)

盡管CAR-T這項新技術取得了令人矚目的成果，但由于其嚴重且常見的不良反應以及與之相關的高昂費用，CAR-T細胞療法所面臨的挑戰(zhàn)已成為學術界討論的熱門話題。CAR-T細胞療法相關的毒性與傳統(tǒng)化療及其他靶向療法不同，CAR-T細胞治療最常見的毒性反應是細胞因子釋放綜合征(CRS)和免疫效應細胞相關的神經(jīng)毒性綜合癥（ICANS），其他不良反應包括脫靶效應、過敏反應、腫瘤復發(fā)等[19]。

4.1 細胞因子釋放綜合征

細胞因子釋放綜合征（CRS），也稱為“細胞因子風暴”，是由于細胞療法清除腫瘤時，激活了大量淋巴細胞導致細胞因子（如IL-6、IL-8、IL- 10、TNF-α和IFN-γ等）升高而引起的一系列炎癥癥狀，主要表現(xiàn)為持續(xù)高燒、惡心、肌痛、關節(jié)痛，并可演變成毛細血管滲漏、缺氧和低血壓，嚴重時可導致器官衰竭。

IL-6是一種具有抗炎和促炎特性的多效性細胞因子，已被認為是CRS毒性的主要介質[20]。DAVILA 等[21]利用CAR-T治療16例復發(fā)或難治性B細胞CLL，緩解率均為80%以上，在治療過程他們發(fā)現(xiàn)其中出現(xiàn)嚴重CRS反應的患者多數(shù)具有較高的IL-6水平。因此，阻斷或結合IL-6受體成為治療CRS的重要環(huán)節(jié)。目前，托珠單抗（Tocilizumab）和司托昔單抗（Siltuximab）已成為治療中重度CRS的首選藥物。2017年8月，托珠單抗已被FDA批準用于CAR-T細胞治療后發(fā)生的CRS[22-23]。

4.2 免疫效應細胞相關的神經(jīng)毒性綜合癥

神經(jīng)毒性是CAR-T細胞療法第二常見的嚴重不良反應，常發(fā)生在CAR-T細胞輸注后的第3或第4周[24]，可發(fā)展為中毒性腦病，伴有精神錯亂、失語、共濟失調(diào)、譫妄、癲癇發(fā)作和腦水腫[25]。這些神經(jīng)系統(tǒng)副作用的發(fā)生機制仍未完全了解，可能與CAR-T細胞進入腦脊液中相關，由此，研究者將CAR-T治療擴展到用于治療中樞系統(tǒng)白血病及其他腫瘤性疾病，目前相關研究需要進一步深入。

4.3 脫靶效應

CAR-T細胞在攻擊腫瘤時，由于其對應的腫瘤靶抗原也表達于正常組織中，故攻擊腫瘤時會同時攻擊表達目標抗原的正常細胞，造成臟器損傷，即脫靶效應。Morgan等[26]設計包含CD28、4-1BB和CD3ζ信號的CAR-T治療一名結腸癌轉移患者，注射1010個細胞，15 min后患者表現(xiàn)為呼吸困難且胸部X光顯示出現(xiàn)肺部浸潤現(xiàn)象，并于5天后死亡。死亡原因被認為是患者肺部上皮細胞低水平表達的ERBB2被CAR-T細胞識別，使得大量CAR-T細胞定位于肺部并攻擊肺部細胞所致。因此現(xiàn)階段尋找腫瘤特異性抗原是CAR-T治療癌癥的關鍵一步，以實現(xiàn)不同癌癥的特異性治療。

4.4 高耐藥率

經(jīng)過多項研究表明，經(jīng)CAR-T細胞治療難治性CD19陽性B細胞惡性腫瘤的患者表現(xiàn)出優(yōu)異的長期緩解，甚至可治愈。但是，在細胞療法后達到完全緩解的患者中，1年內(nèi)復發(fā)率高達30-50%，此外，約10-20%的患者在治療后未達到完全緩解[27-28]。

CAR-T細胞介導的免疫監(jiān)測在細胞治療后的持久緩解中起著重要作用[29]。CAR-T細胞持續(xù)性的喪失可能是抗原陽性復發(fā)的重要決定因素。最近，在CD19表達陰性的B-ALL中，接受CAR-T細胞治療的小兒和成年應答者均報告有腫瘤細胞[27-30]?；趯毎煼退幮詸C制的了解，現(xiàn)已開發(fā)出新穎的潛在治療策略，包括雙重靶向療法以及多方位CAR-T細胞療法。

除了以上幾個常見毒副反應，CAR-T治療需要大量預處理，但仍然不能獲得持久的反應。CAR-T細胞通過誘導凋亡來殺傷腫瘤細胞，將CAR-T細胞與凋亡抑制劑阻斷劑聯(lián)合使用，有可能提高其治療效果[31]。

鑒于CAR-T細胞療法存在致命的不良反應，且不能達到持久的抗腫瘤反應，因此，直到現(xiàn)在，CAR-T細胞療法僅對極少數(shù)晚期血液惡性腫瘤患者有效，對其他血液腫瘤、實體瘤的臨床應用仍面臨著極大的挑戰(zhàn)。

5 展望

經(jīng)過近三十年的發(fā)展，CAR-T才得以應用于少數(shù)晚期血液腫瘤，主要限于小劑量臨床試驗。對于難治性B細胞惡性腫瘤，其顯著的反應令人信服。但是，仍然有很多問題亟待解決。什么時候是使用CAR-T細胞的最佳時機？哪些患者從中受益最大？CAR-T細胞療法可以替代干細胞移植嗎？以上問題，需要進一步通過研究可反映療效的生物學標記來解答。

除了以上問題外，還需解決耐藥性，疾病復發(fā)，嚴重的副作用和持久性等各種問題。CAR-T細胞毒性的管理也處于早期階段。隨著越來越多的可用數(shù)據(jù)，毒性管理在未來幾年肯定會發(fā)生重大變化。研究重點包括更好地了解細胞因子和其他炎癥蛋白在介導毒性中的作用[32]，可以實時通過檢測細胞因子檢測某些患者的毒性嚴重程度并直接干預其免疫抑制。

迄今為止，盡管CAR-T療法在治療某些血液系統(tǒng)惡性腫瘤中獲得顯著進展，但在實體瘤中，尚需克服很多障礙。當然，對于CAR-T細胞，這些仍處于初期，但是如果在以后的臨床試驗中獲得陽性結果，這種革命性的免疫療法將適用于多種腫瘤。

總之：CAR-T細胞療法打響了新興的腫瘤免疫之戰(zhàn)。