二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)呼吸道非典型病原體應(yīng)用進(jìn)展

何靜 黃丹輝 董航明 蔡紹曦

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，慢性氣道疾病研究室（廣州510515）

呼吸道感染是臨床常見(jiàn)疾病，也是主要致死性疾病，根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）2018年發(fā)布的數(shù)據(jù)，2016年下呼吸道感染在全球造成300 萬(wàn)人死亡［1］。呼吸道感染的致病原復(fù)雜，除常見(jiàn)的細(xì)菌外，還有病毒、真菌、支原體、衣原體和軍團(tuán)菌等廣義上的非典型病原體［2］。傳統(tǒng)的非典型病原體檢測(cè)技術(shù)包括涂片鏡檢和培養(yǎng)，需要專業(yè)人員耗費(fèi)長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行分離和鑒定，且非典型病原體的培養(yǎng)條件往往較苛刻，致檢出陽(yáng)性率低。新興的免疫學(xué)檢測(cè)和核酸擴(kuò)增技術(shù)包括PCR 和基因芯片檢測(cè)等步驟復(fù)雜、操作要求高，且需要對(duì)樣本中可能存在的病原體進(jìn)行預(yù)判，無(wú)法準(zhǔn)確檢出混合病原體及未知病原體，難以滿足臨床及科研需求［3］。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，通量更高、敏感性更高、速度更快、成本更低的二代測(cè)序（next?genera?tion sequencing，NGS）技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用在微生物組學(xué)的研究中，并逐漸與臨床病原學(xué)診斷相結(jié)合，為檢測(cè)呼吸道非典型病原體提供了新的思路?，F(xiàn)將目前關(guān)于NGS 技術(shù)與呼吸道非典型病原體檢測(cè)的相關(guān)研究進(jìn)行綜述，并對(duì)NGS 的應(yīng)用提出問(wèn)題和展望。

1 NGS 技術(shù)簡(jiǎn)介

NGS 工作流程主要包括DNA 樣本制備、文庫(kù)構(gòu)建及驗(yàn)證、大規(guī)?？寺U(kuò)增和測(cè)序，使用了區(qū)別于Sanger 測(cè)序法的測(cè)序化學(xué)和單分子聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，使同時(shí)處理數(shù)十億個(gè)高質(zhì)量的堿基對(duì)成為可能。基于NGS 發(fā)展的感染性疾病病原體檢測(cè)技術(shù)主要包括宏基因組測(cè)序（metagenomics next?gen?eration sequencing，mNGS）、全基因組測(cè)序（whole genome sequencing，WGS）以及擴(kuò)增子測(cè)序（以16S rRNA和ITS測(cè)序?yàn)榇恚Ｄ壳俺Ｒ?jiàn)的NGS平臺(tái)主要有Roche 公司的454 技術(shù)、Illumina 公司的Solexa和Hiseq 技術(shù)、Helicos 公司的Heliscope 單分子測(cè)序儀和ABI 公司的Solid 技術(shù)，測(cè)序時(shí)間一般不超過(guò)48 h，最快可以在8 h 內(nèi)實(shí)現(xiàn)從DNA 樣本建庫(kù)到數(shù)據(jù)分析獲取全過(guò)程，充分體現(xiàn)其快速、高通量的優(yōu)點(diǎn)。

2 NGS 在感染性疾病中的應(yīng)用及優(yōu)勢(shì)

2014年WILSON 等［4］應(yīng)用NGS 技術(shù)檢出兒童腦脊液樣本中的鉤端螺旋體，這是世界上第一例臨床應(yīng)用NGS 技術(shù)診斷感染性疾病的報(bào)道，體現(xiàn)了NGS 技術(shù)在檢測(cè)非典型病原體等難分離、難培養(yǎng)致病原上的優(yōu)勢(shì)。MIAO 等［5］報(bào)道了目前中國(guó)最大規(guī)模的關(guān)于mNGS 檢測(cè)感染性疾病病原體的回顧性分析研究，共納入511 例樣本，其中255 例下呼吸道感染，發(fā)現(xiàn)mNGS 的敏感度和特異度分別為50.7%和85.7%，顯著高于傳統(tǒng)培養(yǎng)手段，尤其在檢測(cè)結(jié)核桿菌、病毒、真菌和厭氧菌等病原體上。

《中國(guó)成人醫(yī)院獲得性肺炎與呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎診斷和治療指南（2018 版）》［6］指出，NGS 等分子生物學(xué)技術(shù)可以提高病原檢測(cè)敏感度，縮短檢測(cè)時(shí)間，尤其對(duì)少見(jiàn)和罕見(jiàn)病原體的診斷有重要意義。綜上所述，基于NGS 的病原體檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)逐步在臨床診斷領(lǐng)域推廣并開(kāi)始獲得認(rèn)可，臨床工作者需要充分認(rèn)識(shí)并選擇性地利用這項(xiàng)技術(shù)解決臨床問(wèn)題。

3 NGS在呼吸道非典型病原體檢測(cè)中的應(yīng)用

3.1 NGS 在診斷呼吸道非典型病原體感染中的應(yīng)用病毒是呼吸道感染的常見(jiàn)病原體之一，具有種類多、變異快、難分離、培養(yǎng)條件復(fù)雜等特點(diǎn)，目前臨床上主要采用核酸檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。有研究表明，與基于PCR 的核酸檢測(cè)相比，NGS 對(duì)呼吸道病毒的檢出率更高，且能檢出被常規(guī)檢測(cè)手段遺漏的病毒［7］。YAN 等［8］報(bào)道了1 例經(jīng)mNGS 診斷的罕見(jiàn)人類鼻病毒（HRV）B91 呼吸道感染，該病例中多重實(shí)時(shí)PCR 技術(shù)也曾檢出HRV，但未能進(jìn)一步鑒定亞型，因此被誤認(rèn)為是非致病病原體。上述報(bào)道說(shuō)明PCR 方法對(duì)檢測(cè)罕見(jiàn)突變株有一定局限性，這與PCR 需要預(yù)先設(shè)計(jì)引物有關(guān)，而NGS可以直接對(duì)臨床樣本中的病原體進(jìn)行鑒定，提高了對(duì)罕見(jiàn)呼吸道病毒感染的診斷能力。NGS 技術(shù)鑒定新型呼吸道病毒感染的優(yōu)勢(shì)在2019年底中國(guó)武漢的新型冠狀病毒肺炎疫情中得到了充分體現(xiàn)，研究人員在五天內(nèi)完成了新型冠狀病毒的全基因組鑒定和分析，而2013年基于實(shí)時(shí)PCR 技術(shù)進(jìn)行的H7N9 流感病毒鑒定則耗時(shí)1月余［9］。綜上所述，實(shí)時(shí)PCR 技術(shù)檢測(cè)具有速度快、成本低和易獲取等優(yōu)點(diǎn)，適合大規(guī)模人群篩查；而NGS 對(duì)呼吸道病毒的檢出率高，能進(jìn)一步減少因?qū)崟r(shí)PCR 檢測(cè)假陰性導(dǎo)致的漏診，且能彌補(bǔ)PCR 檢測(cè)診斷罕見(jiàn)或新型病毒感染上的不足。

隨著廣譜抗生素和免疫抑制類藥物使用增加，呼吸道真菌感染的發(fā)病率不斷增高，而涂片鏡檢、培養(yǎng)和抗原抗體檢測(cè)等常規(guī)檢測(cè)手段陽(yáng)性率較低、難以區(qū)分菌種，容易造成漏診。XIAO 等［10］報(bào)道了首例經(jīng)NGS 檢出的尖端賽多孢子菌肺炎，該病例中NGS 在28 h 內(nèi)得到檢測(cè)結(jié)果，而傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)需要耗時(shí)數(shù)天。同時(shí)，尖端賽多孢子菌的鏡下群落形態(tài)與曲霉菌相似，容易造成混淆。因此，與傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)相比，NGS 可以更快速、準(zhǔn)確地為呼吸道真菌感染提供病原學(xué)證據(jù)。LI 等［11］對(duì)20 例可疑感染的肺活檢組織進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，與組織病理學(xué)檢測(cè)相比，NGS 可以檢出更多根霉、毛霉等結(jié)合菌，這可能與NGS 樣本不需經(jīng)過(guò)研磨加工有關(guān)，從而更真實(shí)地還原呼吸道真菌群落。

支原體和軍團(tuán)菌的培養(yǎng)要求較一般細(xì)菌高，培養(yǎng)陽(yáng)性率低，而衣原體甚至需要采用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，通常不通過(guò)培養(yǎng)進(jìn)行臨床診斷。隨著分子病原診斷技術(shù)的發(fā)展，以PCR 為基礎(chǔ)的肺炎支原體、衣原體核酸擴(kuò)增技術(shù)已被批準(zhǔn)用于臨床，為早期、快速診斷提供依據(jù)［12］，體現(xiàn)了核酸檢測(cè)技術(shù)在臨床診斷中的重要價(jià)值。而NGS 尚未用于呼吸道支原體、衣原體感染的常規(guī)檢測(cè)，其相關(guān)報(bào)道和研究較少。

李學(xué)青等［13］收集34 例重癥肺炎患兒的肺泡灌洗液進(jìn)行分析，其中20 例肺炎支原體感染的mNGS 結(jié)果與血清抗體檢測(cè)結(jié)果相符，肯定了NGS檢測(cè)肺炎支原體的能力。朱榕生［14］和邱崇榮［15］各報(bào)道了1 例經(jīng)NGS 診斷的鸚鵡熱衣原體肺炎，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)檢測(cè)手段在檢測(cè)少見(jiàn)病原體上的不足。NGS 理論上可以實(shí)現(xiàn)全面、無(wú)偏倚地檢測(cè)病原體，而PCR 技術(shù)也有其特異性高、省時(shí)等優(yōu)點(diǎn)，因此現(xiàn)階段在結(jié)合患者臨床癥狀初步考慮呼吸道支原體或衣原體感染可能的情況下，仍推薦使用常規(guī)檢測(cè)方法，將NGS 作為補(bǔ)充手段。

目前尚無(wú)NGS 用于呼吸道嗜肺軍團(tuán)菌臨床診斷的報(bào)道，HUANG 等［16］2019年報(bào)道了第一例mNGS 診斷的非嗜肺軍團(tuán)菌關(guān)節(jié)感染，而傳統(tǒng)培養(yǎng)手段未檢出軍團(tuán)菌感染，這一報(bào)道體現(xiàn)了NGS 在檢測(cè)軍團(tuán)菌屬中有很大潛力。

此外，非典型病原體容易合并細(xì)菌感染，常規(guī)檢測(cè)手段難以鑒別，而NGS 可以在單個(gè)樣本中同時(shí)鑒定多個(gè)病原體，在鑒別混合感染和多重感染中發(fā)揮重要作用。LANGELIER 等［17］在免疫功能受損的呼吸道感染病人的肺泡灌洗液中檢測(cè)出HCOV 229E、HRV?A、HHV?6、CMV、HSV、EBV、人乳頭瘤病毒及輸血傳播型病毒等多種病毒，還發(fā)現(xiàn)了罕見(jiàn)的輕型鏈球菌及丙酸棒桿菌，且病毒與細(xì)菌共存可明顯加重患者的臨床癥狀。王桂禎等［18］報(bào)道了1 例多重真菌與細(xì)菌混合呼吸道感染，傳統(tǒng)鏡檢和血清學(xué)檢查均為提示呼吸道真菌感染，痰培養(yǎng)示白念珠菌，但無(wú)法明確判斷病原菌，治療效果欠佳，NGS 技術(shù)成功檢出白念珠菌、曲霉菌、肺炎鏈球菌等多種病原體，為調(diào)整治療方案指明方向。這提示免疫功能受損或重癥呼吸道感染患者可能存在傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)遺漏的多重病原體感染，在抗感染治療效果欠佳的情況下可進(jìn)一步行NGS 檢測(cè)。另外，有研究者提出NGS 可用于快速鑒定肺炎支原體和細(xì)菌混合感染，并證實(shí)難治性肺炎支原體肺炎中合并細(xì)菌感染的情況較少，不應(yīng)常規(guī)聯(lián)用多種抗生素，從而減少耐藥機(jī)會(huì)［19］。

3.2 NGS 用于指導(dǎo)呼吸道非典型病原體感染治療NGS 可通過(guò)檢測(cè)呼吸道非典型病原體耐藥基因突變及動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)感染后氣道微生物組等方法指導(dǎo)臨床抗感染治療，也有研究者利用NGS 技術(shù)研究非典型病原體感染的致病機(jī)制，為探討新的治療方法提供思路。

PARKER 等［20］對(duì)含有流感病毒的鼻咽拭子進(jìn)行NGS 檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了抗病毒藥物耐藥性的基因組區(qū)域，結(jié)果與傳統(tǒng)PCR 法完全一致，體現(xiàn)了NGS 在檢測(cè)耐藥基因突變上的可靠性。TREBBIEN等［21］對(duì)一名免疫低下的甲型H1N1 pdm09 流感病毒感染患者進(jìn)行為期6 個(gè)月的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，在首次奧司他韋治療后NGS 檢測(cè)到H275Y 奧司他韋耐藥突變（60.3%），而在第二次扎那米韋治療過(guò)程中檢測(cè)到H275Y（65.1%）、I223R（9.2%）和E119G（89.6%）等混合耐藥突變。這項(xiàng)研究說(shuō)明免疫功能低下的流感患者在抗病毒治療過(guò)程中可能出現(xiàn)多重耐藥，而NGS 可以在檢測(cè)病原體的同時(shí)獲取耐藥信息，從而及時(shí)調(diào)整抗病毒治療方案。值得注意的是，由于目前仍缺少特定耐藥突變基因?qū)е履退幈硇偷南嚓P(guān)研究，不能關(guān)聯(lián)耐藥基因與相應(yīng)的病原微生物，臨床應(yīng)用NGS 獲取的耐藥基因信息時(shí)仍需要結(jié)合具體的臨床信息綜合判斷［22］。

HU 等［23］利用NGS 技術(shù)對(duì)一例致死性H7N9 流感病例的氣道微生物組進(jìn)行全程縱向研究，發(fā)現(xiàn)抗病毒治療3 d 后H7N9 病毒的復(fù)制受到抑制，證實(shí)了抗病毒藥物的敏感性。同時(shí)，鮑曼不動(dòng)桿菌和革蘭氏陰性菌主導(dǎo)了H7N9 病毒感染后的氣道微生物組，而發(fā)病9 d 后經(jīng)痰和血培養(yǎng)證實(shí)患者繼發(fā)鮑曼不動(dòng)桿菌感染。因此，NGS 的動(dòng)態(tài)檢測(cè)可以評(píng)價(jià)呼吸道感染的抗病毒治療效果，并揭示未來(lái)可能出現(xiàn)的繼發(fā)感染，充分解讀這些信息可能對(duì)臨床醫(yī)生選擇抗病毒藥物和優(yōu)化抗生素聯(lián)用方案有重要意義，改善患者預(yù)后。

因?yàn)镹GS 的測(cè)序深度更高、覆蓋度更廣，所以與傳統(tǒng)PCR 檢測(cè)相比，基于NGS 的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可以在樣本量更少的情況下，更全面地描述個(gè)體或單細(xì)胞在某一特定生理?xiàng)l件下的基因表達(dá)情況，有助于研究疾病分子水平上的變化和發(fā)現(xiàn)新治療靶點(diǎn)［24］。MAN 等［25］運(yùn)用NGS 技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)兒童支原體肺炎患者的NK 細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞有過(guò)度增殖和活化的現(xiàn)象，且IFNγ、PRF1、GZMB、FASL 和GNL 等細(xì)胞因子表達(dá)上調(diào)，可能在兒童支原體肺炎的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。對(duì)呼吸道肺炎支原體感染后的這種免疫功能失調(diào)和細(xì)胞因子變化進(jìn)行干預(yù)，可能是新的治療思路，但是仍需要更多研究證實(shí)。

3.3 NGS 用于呼吸道非典型病原體感染暴發(fā)監(jiān)控和調(diào)查KOTHARI 等［26］發(fā)現(xiàn)某腫瘤病區(qū)有呼吸道副流感病毒感染聚集性病例，利用NGS 技術(shù)鑒定了病毒株的親緣關(guān)系信息，追蹤傳播途徑，判斷出院內(nèi)發(fā)生了副流感病毒傳播，而這可能是通過(guò)醫(yī)護(hù)人員的互相接觸發(fā)生的。CHARPENTIER等［27］在一次卡氏肺孢子菌肺炎爆發(fā)中利用NGS 聯(lián)合多位點(diǎn)序列分型進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)NGS 可以對(duì)卡氏肺孢子菌株準(zhǔn)確分型，描述傳播網(wǎng)絡(luò)，并提出這項(xiàng)技術(shù)有可能進(jìn)一步確定病原體感染的可能日期及地點(diǎn)。綜上所述，因病毒和真菌等非典型病原體的分離培養(yǎng)要求苛刻，限制了利用菌株分型進(jìn)行疫情跟蹤和分析的能力，而NGS 不依賴分離培養(yǎng)的特點(diǎn)使它可以更快捷、更全面地鑒定不同病原體基因型，對(duì)管理院內(nèi)感染、預(yù)防傳染等有重要意義。

由于NGS 在病毒株特征分型上的優(yōu)越性，WHO 已將全球流感病毒的NGS 數(shù)據(jù)納入監(jiān)控，作為預(yù)測(cè)下一季節(jié)流感病毒特征的參考，并在2019年基于這些數(shù)據(jù)分析結(jié)果調(diào)整了甲型H3N2 流感病毒疫苗的組分［28］。

此外，NGS 還用于環(huán)境病原體檢測(cè)。自然水環(huán)境是軍團(tuán)菌的主要來(lái)源，對(duì)淡水系統(tǒng)的軍團(tuán)菌監(jiān)測(cè)、危害預(yù)測(cè)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估與人類健康密切相關(guān)，NGS 目前也用于評(píng)估環(huán)境軍團(tuán)菌群，有研究表明其準(zhǔn)確度優(yōu)于實(shí)時(shí)PCR 檢測(cè)技術(shù)［29］。

4 問(wèn)題和挑戰(zhàn)

NGS 的推廣應(yīng)用仍有許多問(wèn)題需要解決。第一，NGS 缺乏大樣本規(guī)范化研究證實(shí)其可靠性和優(yōu)越性。第二，缺乏統(tǒng)一的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范的測(cè)序流程。第三，目前暫無(wú)完善的臨床應(yīng)用指南對(duì)解讀NGS 報(bào)告進(jìn)行指導(dǎo)，檢測(cè)出微生物并不等于病原體感染，鑒別致病原和背景菌仍是一大難題。NGS 檢測(cè)呼吸道非典型病原體也有其局限性，如病毒往往具有較小的核酸序列，且極不穩(wěn)定、易變異、易降解，尤其是RNA 病毒，需要更高質(zhì)量的樣本儲(chǔ)存和運(yùn)輸條件以及更精密的富集策略。而支原體、衣原體、軍團(tuán)菌等胞內(nèi)感染致病原和真菌等厚壁微生物的DNA 提取效率低，使序列數(shù)和覆蓋率偏低，最終導(dǎo)致檢測(cè)敏感度下降。因此，為了在臨床推廣應(yīng)用，NGS 及其相關(guān)配套技術(shù)和條件仍需繼續(xù)優(yōu)化［30］。

盡管NGS 的臨床應(yīng)用面臨著許多問(wèn)題和挑戰(zhàn)，但它的發(fā)展前景是廣闊的。已經(jīng)有研究者提出了更精密的富集目標(biāo)微生物核酸和去除宿主核酸策略，可以選擇性裂解宿主細(xì)胞并從臨床樣本中分離出特定生物［31］。而MYCROBIOTA 等處理平臺(tái)的開(kāi)發(fā)，逐步減少了嵌合體和DNA 污染等造成的偏差，并提供了一個(gè)易于使用的生物信息學(xué)管道，可以在不需要高級(jí)生物信息學(xué)技能的情況下實(shí)現(xiàn)NGS 結(jié)果的自動(dòng)化解釋［32］。新的測(cè)序儀器極大地縮短了測(cè)序流程的實(shí)際操作時(shí)間，可以在24 h 內(nèi)提供測(cè)序結(jié)果，而單個(gè)樣本的測(cè)序成本也從70 美元降低到28 美元［33］。因此，未來(lái)NGS 技術(shù)也將繼續(xù)提高測(cè)序準(zhǔn)確度、簡(jiǎn)化工作流程、優(yōu)化分析報(bào)告和降低成本，實(shí)現(xiàn)在臨床上的廣泛應(yīng)用。

5 結(jié)語(yǔ)與展望

目前NGS 檢測(cè)呼吸道非典型病原體的研究主要以病例報(bào)道和小樣本臨床研究為主，仍有待進(jìn)一步的大樣本臨床研究對(duì)比分析其與傳統(tǒng)檢測(cè)手段的敏感度和特異度。NGS 技術(shù)在檢測(cè)呼吸道非典型病原體中有著巨大的潛力，目前已逐步應(yīng)用到臨床診斷、治療指導(dǎo)以及暴發(fā)調(diào)查等方面，對(duì)改善患者預(yù)后和預(yù)防易感人群感染有重要意義。雖然NGS 仍不能完全取代目前常規(guī)的非典型病原體檢測(cè)技術(shù)，但是隨著技術(shù)不斷革新和臨床應(yīng)用逐步規(guī)范，NGS 可以作為一種有效的補(bǔ)充手段［34］，為傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)難以診斷或治療效果欠佳的病人提供參考，減少不必要的抗生素使用并改善患者預(yù)后。同時(shí)，NGS 在鑒定新型病原體、指導(dǎo)防疫工作上發(fā)揮著不可或缺的作用。在分子病原學(xué)診斷技術(shù)不斷發(fā)展的時(shí)代，NGS 將成為精準(zhǔn)抗感染治療的關(guān)鍵技術(shù)。