多指標(biāo)綜合評分法優(yōu)選甘草抗氧化活性成分閃式提取工藝

闞俊明，雷岱虹，宗 穎，查榮博，張 輝*，孫佳明*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱150000;2.長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春130117;3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長春130118)

甘草(Glycyrrhiza)為多年生草本植物，屬豆科，主要有烏拉爾甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)、脹果甘草(Glycyrrhiza inflataBatal.)和光果甘草(Glycyrrhiza glabraL.)。甘草味甘甜，性平，歸心、肺、脾、胃經(jīng)，具有補(bǔ)脾益氣，清熱解毒，緩急止痛，祛痰止咳，調(diào)和諸藥的功效［1］。研究［2-7］表明，甘草具有抗炎、抗菌、抗過敏、抗氧化、抗疲勞、抗焦慮和抗心律失常等生理功能。尤其甘草中黃酮類成分能夠明顯的清除或抑制體內(nèi)自由基，并且對食用油脂也具有良好的抗氧化效果，所以甘草除藥用外，也多應(yīng)用于食品和化妝品行業(yè)。目前，甘草活性成分的提取方法有快速溶劑萃取法、超聲波法、微波法、超臨界CO2萃取法、高速逆流色譜法、超高壓法、回流提取法等［8-13］。閃式提取法是在適當(dāng)溶劑條件下，利用內(nèi)外刀刃間形成的超速動(dòng)態(tài)分子的滲透作用和強(qiáng)力振動(dòng)作用，從而破壞植物細(xì)胞組織，使組織細(xì)胞內(nèi)部的有效成分迅速達(dá)到組織內(nèi)外平衡，進(jìn)而達(dá)到快速提取目的的一種方法，具有高效節(jié)能、操作簡便、節(jié)能經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)［14-15］。本實(shí)驗(yàn)采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，利用閃式提取法提取甘草抗氧化活性成分，以甘草總黃酮含量、DPPH自由基清除率和浸膏得率的綜合評分為指標(biāo)，考察甘草抗氧化活性成分閃式提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 甘草藥材購于吉林大藥房，均經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)張輝教授鑒定為甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch)的干燥根;蘆丁對照品(中國藥品生物制品檢定所);DPPH自由基(美國Sigma公司);甲醇、無水乙醇、NaNO2、Al(NO3)3、NaOH等均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 儀器與設(shè)備 閃式提取器(北京金鼐科技發(fā)展有限公司);BP211D型電子天平(德國賽多利斯股份公司);紫外可見分光光度計(jì)(Cary 50 UV-VIS)(美國瓦里安公司);KQ5200型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);酶標(biāo)儀Bio-Rad;數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司);DZF-6050型真空干燥箱(上海一恒科技有限公司);電熱恒溫水浴鍋(北京華恒萬儀儀器有限公司);旋轉(zhuǎn)式恒溫振蕩器(蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 浸膏得率的測定 定量量取甘草提取液，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后，置真空干燥箱內(nèi)干燥24 h，將干燥后的提取物取出，精密稱定質(zhì)量。

1.3.2 甘草總黃酮含量測定 取蘆丁對照品40 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加入甲醇5 mL，置水浴上微熱使溶解加甲醇至刻度，搖勻，精密量取5 mL，置50 mL量瓶中，加水至刻度，制得蘆丁對照品溶液(0.40 mg/mL)。精密量取對照品溶液0、1、2、3、4、5 mL置于25 mL 容量瓶中，加水至5 mL，各加入5%NaNO2溶液1 mL混勻，放置等待6 min，再加入10%Al(NO3)3溶液1 mL，搖勻后放置等待6 min后，此時(shí)溶液顏色加深，最后加入濃度為4%NaOH溶液10 mL，加水至刻度，搖勻，放置等待15 min。以70%的乙醇為空白，用紫外分光光度法于510 nm波長處測定不同濃度蘆丁對照品溶液的吸光度。以吸光度(Y)為縱坐標(biāo)，蘆丁對照品溶液的濃度(X)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行直線回歸，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線［16］，回歸方程為A=10.010 2 C+0.012 6(r=0.999 9，n=5)，結(jié)果表明蘆丁在0.008～0.040 mg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。吸取相應(yīng)的甘草閃式提取液適量，分別置于容量瓶中，按以上方法，于510 nm處測定吸光度，以不加供試品的平行樣為空白。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出供試品中總黃酮的含量。

1.3.3 對DPPH自由基清除活性的測定 運(yùn)用抑制DPPH的方法［17］，對甘草提取物進(jìn)行體外抗氧化活性評價(jià)。精密量取濃度為26.4 mg/L的DPPH 70%乙醇溶液2 mL，分別加入至2 mL以70%乙醇為溶劑已配制好的不同濃度的樣品液中，充分混勻，避光條件下反應(yīng)30 min，在517 nm測定其吸光度。同時(shí)以2 mL 70%乙醇溶液作為空白對照A0，以樣品溶液2 mL與2 mL7 0%乙醇溶液混合作為樣品對照Aj，并以VitE作為陽性對照，以樣品液對DPPH溶液清除率Y計(jì)算公式。

1.3.4 正交試驗(yàn) 以乙醇為提取溶媒，以提取時(shí)間、醇濃度、提取次數(shù)、固液比為考察因素，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，并以甘草總黃酮含量、DPPH自由基清除率和浸膏得率為評價(jià)指標(biāo)，篩選最佳工藝條件，結(jié)果見表1。評分時(shí)以各指標(biāo)的最大值為參照將數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化，再給出不同的權(quán)重。從生物活性和化學(xué)成分兩個(gè)角度來分析，將DPPH自由基清除率的權(quán)重系數(shù)設(shè)為0.5，總黃酮含量的權(quán)重系數(shù)設(shè)為0.3，浸膏得率的權(quán)重系數(shù)設(shè)為0.2。以綜合值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見表2和表3。其中綜合評分Y=0.3X1×100/7.16+0.5X2×100/55.77+0.2X3×100/29.00。

表1 因素水平表

表2 工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 方差分析表

2 結(jié)果與分析

直觀分析表明，以綜合評分為標(biāo)準(zhǔn)，在所選因素水平范圍內(nèi)，醇濃度對甘草抗氧化有效成分的提取效果影響最大。方差分析表明，因素B(醇濃度)為主要影響因素，具有顯著性，因素A、C、D不顯著。故選取最佳提取條件為A2B1C3D2，即90%乙醇，料液比為1∶20(g/mL)，提取次數(shù)3次，每次2 min。

為進(jìn)一步考察優(yōu)選工藝的可靠性及穩(wěn)定性，取3分藥材按上述最佳提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，甘草生藥量總黃酮含量為7.24%;DPPH自由基清除活性為60.26%;對浸膏得率為16.30%。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該優(yōu)選工藝穩(wěn)定、可靠。

3 小結(jié)

本文針對甘草中抗氧化有效成分的提取，重點(diǎn)考察了其DPPH自由基清除能力，并結(jié)合總黃酮含量、浸膏得率綜合評分，從而得到富含抗氧化活性成分的甘草閃式提取工藝，更有效地控制生產(chǎn)過程，從根本上保證甘草在食品、藥品方面的質(zhì)量。

［1］中華人民共和國國家藥典委員會.中國藥典［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2010.

［2］張明發(fā)，沈雅琴.甘草及其活性成分抗炎與抗炎機(jī)制的研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代藥物與臨床，2011，26(4):261-268.

［3］吳碧華，楊得本，龍存國，等.甘草總黃酮的體外抗氧化作用［J］.中國臨床康復(fù)，2004，8(36):8262-8263.

［4］果嘉，趙偉鴻，樊紫周，等.甘草總黃酮抗抑郁作用研究［J］.中藥藥理與臨床，2012，28(6):59-62.

［5］胡小鷹，彭國平，陳法炎.甘草總黃酮抗心律失常作用研究［J］.中草藥，1996，27(12):733-735.

［6］劉俊峰，郭雪峰，劉永宏.甘草提取物對卡拉庫爾綿羊血液抗氧化性能的影響［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，41(2):25-29.

［7］崔永明，余龍江，敖明章，等.甘草總黃酮對油脂抗氧化作用研究［J］.食品科學(xué)，2007，28(11):119-121.

［8］王鐸，王晶，劉春明，等.甘草總黃酮提取方法的對比及工藝優(yōu)化［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(6):3272-3273.

［9］張海燕，李偉，范彩玲，等.超聲波法提取甘草中的甘草酸［J］.河南科學(xué)，2009，27(9):1069-1071.

［10］闞微娜，譚天偉.微波法提取甘草中有效成分的研究［J］.中草藥，2006，37(1):61-64.

［11］趙德勝，趙艷玲，王海峰.超臨界CO2萃取甘草黃酮工藝的研究［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40(2):213-215.

［12］王偉明，朱文全，張志波.甘草有效成分提取分離方法的研究進(jìn)展［J］.黑龍江醫(yī)藥，2010，23(1):93-94.

［13］ECONOMOU K D，OREOPOULOU V，THOMPOULOS C D.Antioxidant activity of Some plant extracts of the family labitae［J］.JAOCS，1991，68(2):109-113.

［14］王玥，杜守穎，戴俊東，等.黃柏中鹽酸小檗堿的閃式提取工藝研究［J］.中國藥業(yè)，2013，22(6):72-73.

［15］武艷梅，趙航，李淑燕，等.閃式提取法提取黃芪活性成分工藝研究［J］.食品科學(xué)，2011，24(32):98-101.

［16］丁宗保，李強(qiáng)，佟麗，等.過山風(fēng)總黃酮抗氧化作用研究［J］.中藥材，2011，34(3):435-437.

［17］胡緒喬，原菲，嚴(yán)春艷，等.銀杏多糖的分離鑒定和體外抗氧化活性測試［J］.中藥材，2011，34(12):1950-1953.