多發(fā)性硬化的干細(xì)胞治療進(jìn)展

徐艷芳，張金文

1 多發(fā)性硬化簡介

多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）是一種由 T細(xì)胞介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥性疾病，主要累及脊髓和大腦白質(zhì)，伴有神經(jīng)脫髓鞘、軸突喪失并導(dǎo)致不可逆殘疾，以年輕群體多發(fā)。作為最為常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，MS是年輕患者非創(chuàng)傷性神經(jīng)性殘疾的首要病因。

1.1 MS發(fā)病機(jī)制 MS涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的慢性炎癥性脫髓鞘、少突膠質(zhì)細(xì)胞的喪失、髓鞘再生。MS的主要病理過程包括炎癥階段和退行性病變階段。

神經(jīng)病理學(xué)證據(jù)表明，MS病變中最早的病理變化是在沒有淋巴細(xì)胞浸潤情況下的少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡和小膠質(zhì)細(xì)胞激活，伴有繼發(fā)性脫髓鞘［1］。MS患者的殘疾是由抗原特異性免疫應(yīng)答介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)引起的。而脫髓鞘病變中存在炎癥細(xì)胞及其分泌的分子，髓鞘抗原反應(yīng)的致病性T細(xì)胞在MS中起關(guān)鍵作用，導(dǎo)致神經(jīng)元退化?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）［2］介導(dǎo)自身反應(yīng)性T細(xì)胞向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的遷移導(dǎo)致中樞神經(jīng)元及其髓鞘的破壞。氧化應(yīng)激、缺氧和腦的低灌注可導(dǎo)致MS中脫髓鞘病變增加［3，4］。 MS 具有遺傳易感性。 遺傳學(xué)研究證實，MHC classⅡHLA-DRB1基因 HLA-DRB1＊15：01是MS發(fā)展的最重要危險因素，使疾病風(fēng)險增加3 倍［5］。

1.2 MS動物模型 MS動物模型包括實驗性自身免疫/過敏性腦脊髓炎（EAE）模型、病毒誘導(dǎo)的慢性脫髓鞘疾病模型［主要為Theiler小鼠腦脊髓炎病毒（TMEV）感染模型］、毒素誘導(dǎo)脫髓鞘模型三種。單一的動物模型不能完全復(fù)制人類MS的整個異質(zhì)性及其在臨床和放射學(xué)表現(xiàn)中的多樣性，也不可能充分表現(xiàn)MS的所有臨床、放射學(xué)、病理學(xué)和遺傳學(xué)特征。目前開發(fā)出的MS動物模型僅代表MS的某個或某些方面，需要根據(jù)具體的研究問題，合理選擇動物模型。

2 MS與自體造血干細(xì)胞（I/AHSCT）

I/AHSCT治療MS是利用免疫清除劑 （預(yù)處理方案）耗盡自身反應(yīng)性效應(yīng)細(xì)胞，然后輸注自體造血干細(xì)胞重建正常免疫功能系統(tǒng)。I/AHSCT治療后，循環(huán)自身反應(yīng)性效應(yīng)T細(xì)胞Th17減少，新的胸腺T細(xì)胞出現(xiàn)，調(diào)節(jié)環(huán)境恢復(fù)［6］。重建的T細(xì)胞譜系變異程度與預(yù)處理方案的強(qiáng)度有關(guān)。

2.1 患者選擇 I/AHSCT治療受益對象，早期認(rèn)為是患有長期嚴(yán)重進(jìn)行性MS的患者，其炎癥特征不突出且神經(jīng)退行性變是主要的潛在機(jī)制。這類患者一般是受益的，但很少見到神經(jīng)功能改善［7，8］。此外，神經(jīng)功能障礙嚴(yán)重的患者發(fā)生不良事件的風(fēng)險增加［9］。最近研究則側(cè)重于復(fù)發(fā)緩解型MS患者，其中具有活性炎癥特征的患者受益最大［9］。因此，目前認(rèn)為I/AHSCT治療對象是復(fù)發(fā)緩解型MS患者。

2.2 移植流程 I/AHSCT治療步驟包括外周血造血干細(xì)胞的動員，通過施用預(yù)處理方案免疫消融，然后輸注造血干細(xì)胞以促進(jìn)血液重建。在MS治療中，最常用的方法是環(huán)磷酰胺（Cy）+G-CSF作為動員劑，這有助于消耗淋巴細(xì)胞并減少自體反應(yīng)性T細(xì)胞再輸注的概率。

目前預(yù)處理方案的最佳強(qiáng)度仍未確定。最常用的預(yù)處理方案是BEAM與抗胸腺細(xì)胞球蛋白（ATG）相結(jié)合［8，13，14］的中等強(qiáng)度方案，高強(qiáng)度方案因為毒性太強(qiáng)而被詬病。Atkins等［15］使用了高強(qiáng)度方案——高劑量白消安和Cy（Bu/Cy）輸注方案［15］并對白消安方案進(jìn)行了幾項修改以提高耐受性。相反，Burt及其同事［7］提倡抗胸腺細(xì)胞球蛋白治療后給予Cy的低強(qiáng)度方案，效果良好、毒性降低且無病死率。

2.3 結(jié)果量化 MS臨床試驗中最常發(fā)生的不良結(jié)果是復(fù)發(fā)、殘疾加重，量化工具包括擴(kuò)展殘疾狀態(tài)量表（EDSS）、多發(fā)性硬化功能組合、MRI病變活動性、標(biāo)準(zhǔn)化的全腦容量［7，8，13-15］以及殘疾的改善［16］。

2.4 臨床試驗 I/AHSCT是MS中研究最多的干細(xì)胞治療策略。最近一項回顧性分析表明，I/AHSCT治療達(dá)到“沒有臨床癥狀”的多發(fā)性硬化患者比例（2 年時為 78%～83%）高于現(xiàn)有試驗（13%～46%）［12］。I/AHSCT治療后2年，腦容量損失顯著減慢達(dá)到接近正常老化的水平［17］。與I/AHSCT相關(guān)的死亡率在過去二十年中有所下降［18］。最近研究顯示死亡率＜5%［9］，一些試驗報告死亡率為零［7］。選擇合適的調(diào)節(jié)強(qiáng)度、患者人群、移植手術(shù)、移植時間和移植后護(hù)理有助于最大限度地降低移植相關(guān)死亡率的風(fēng)險。

3 MS與間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）

MSC存在于大多數(shù)組織中，其旁分泌功能在一些疾病中比傳統(tǒng)細(xì)胞替代更有治療作用，在許多組織修復(fù)中發(fā)揮重要作用。MSC移植的潛在治療益處具有自限性，需要重復(fù)給藥。

不同來源的MSC之間可能存在重要差異，這些差異影響組織來源選擇。多發(fā)性硬化的潛在生物學(xué)特點可能影響MSC功能。一些研究發(fā)現(xiàn)，從MS患者和非MS患者中分離MSC的培養(yǎng)、分化潛能、表面抗原表達(dá)和免疫調(diào)節(jié)性能差異較大［19-22］，表明自體細(xì)胞移植可能不合適。

MSC治療的最佳劑量仍然是未知的，但目前認(rèn)可的劑量是每千克體重（1～2）×106個細(xì)胞，因此初級MSC不可用于臨床，需要廣泛使用擴(kuò)增細(xì)胞方案。但是，擴(kuò)增循環(huán)顯著減弱了修復(fù)和神經(jīng)保護(hù)特性。此外，產(chǎn)量低限制了重復(fù)給藥。因此，需要探索新的擴(kuò)增方法。

細(xì)胞制劑的類型包括混合單核細(xì)胞制劑、純化的培養(yǎng)擴(kuò)增MSC、MSC衍生的神經(jīng)祖細(xì)胞。骨髓單核制劑包括許多細(xì)胞類型，這種混合制劑在修復(fù)脫髓鞘和抑制炎癥以及對中風(fēng)和其他疾病患者有益。一些研究使用混合/非分離細(xì)胞；也有使用純化和培養(yǎng)擴(kuò)增的MSC［28］。細(xì)胞生產(chǎn)中需要保證嚴(yán)格的質(zhì)量和安全控制，并進(jìn)行表型和核型的評估、誘變測試和微生物分析。

3.1 輸注途徑 最佳的輸注途徑仍然不確定。將細(xì)胞直接注射到特定病變中對彌漫性灰質(zhì)和白質(zhì)受累益處不大，這是多發(fā)性硬化癥的特征。靜脈輸注更安全，大多數(shù)MSCs研究采用靜脈注射［23］。靜脈注射后，許多細(xì)胞被困在肺部，但是仍有顯著數(shù)量進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，分布廣泛，并且可以保持?jǐn)?shù)十年。

3.2 臨床試驗 目前研究認(rèn)可MSC治療MS的可行性和安全性，并且沒有異位組織形成。不良反應(yīng)有：短暫的無菌性腦膜炎常見于鞘內(nèi)輸注；有鞘內(nèi)注射MSC后急性播散性腦脊髓炎的病例報告；鞘內(nèi)注射間充質(zhì)、胚胎和胎兒神經(jīng)干細(xì)胞組合后的膠質(zhì)增生性脊髓腫瘤；3例年齡相關(guān)性黃斑變性患者的玻璃體內(nèi)注射脂肪組織來源干細(xì)胞后嚴(yán)重視力喪失［27］。

MSC治療最終可能會讓位于分子治療。如果MSC治療的主要有益效果是旁分泌，那么直接使用沖擊細(xì)胞中的主要效應(yīng)物可以達(dá)到治療效果。MSC治療可降低促炎細(xì)胞因子如 IFN-γ［26，31］，TNF-α［30］，IL-1［31］，IL-2［32］，IL-12［33］和 IL-17［26，35，36］的 水平 ，增加抗炎因子 IL-4［28，35］，IL-5［33］和 IL-10［31］的水平。 在一些研究中發(fā)現(xiàn)促炎和抗炎細(xì)胞因子IL-6的水平增加［27，32］，而一些研究中該細(xì)胞因子水平降低［36］。 此外，一些研究表明，MSC的免疫調(diào)節(jié)特性可部分歸因于具有免疫調(diào)節(jié)功能的分子的表達(dá)，如LIF［27］，PDL-1［34］，COX-2［34］，TGF-β1［34］，TSG-6［34］，CD200［34］，HGF［34，35］，IDO-1［29，34］，VEGF［35］，HLA-G［34］，HLA-E［34］和 HO-1［34］。 另一項研究［34］報道神經(jīng)營養(yǎng)因子如BDNF，CNTF，GDNF，NGF 和 NTF3也由 MSC 表達(dá)，證明了這種干細(xì)胞在神經(jīng)退行性疾病中支持旁分泌的潛力。另一項研究［35］證明了MSC通過抑制實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠脊髓中的MMP-2和MMP-9活性而起作用。

免疫細(xì)胞的增殖和分化顯著受到MSC給藥的影響。用MSC治療MS導(dǎo)致B細(xì)胞和T細(xì)胞［34］的增殖受到抑制，并減少炎癥細(xì)胞進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)和脊髓［35］。 具體而言，MSC 治療會抑制 CD4+IFN-γ+Th1［33］和 CD4+IL-17+Th17［31］細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的克隆擴(kuò)增和侵入。此外，一些研究報道，MSC治療導(dǎo)致 CD4+IL-4+Th2［33］和 CD4+CD25+FOXP3+Treg［31］細(xì)胞克隆擴(kuò)增的刺激。部分研究發(fā)現(xiàn)［27］，給予MSC后，CD44+和CD45RO+記憶T-淋巴細(xì)胞的增殖減少，先天免疫系統(tǒng)的細(xì)胞也受到MSC治療影響。MSC處理的實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠的細(xì)胞中，CD11b+Ly6G+中性粒細(xì)胞和CD11b+Ly6C+炎癥單核細(xì)胞的百分比均降低。用MSC處理的實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠中也檢測到CD4+細(xì)胞中較低的RORγT和較高的GATA-3轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平，這表明MSC處理后，Th17表型受到抑制而Th2亞群受益。Donders等［30］發(fā)現(xiàn)用MSC處理的實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠，其樹突細(xì)胞的分化和成熟，抑制了抗原呈遞，并因此啟動T細(xì)胞免疫。Tafreshi等［34］發(fā)現(xiàn)磷酸化 GSK3β的損失可以在用MSC處理的實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠的神經(jīng)元中恢復(fù)。

MSC治療后臨床條件改善，原因在于干細(xì)胞抑制了B細(xì)胞、Th1和Th17淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的增殖和侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)和脊髓。促炎細(xì)胞因子和生長因子IFNγ，IL-2和TGF-β分泌的減少，以及MSC分泌的抗炎因子如GM-CSF，PGE2和IL-6，也可以抑制促炎細(xì)胞如中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞的聚集及其向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的侵入。MSC中促炎性細(xì)胞因子和生長因子水平的降低以及抗炎因子的分泌也可抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)中星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，并刺激促炎細(xì)胞分化成M2巨噬細(xì)胞和具有免疫調(diào)節(jié)作用的Breg細(xì)胞。位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的促炎細(xì)胞分泌TNF-α，蛋白酶，一氧化氮和髓鞘特異性抗體也受到抑制，減少了少突膠質(zhì)細(xì)胞的死亡和軸突中髓鞘的破壞。最后，通過MSC分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子如 BDNF、CNTF、GDNF、NGF 和 NTF3 也可作用于少突膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元，進(jìn)一步抑制疾病的進(jìn)展。

4 MS與少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞、多能干細(xì)胞（OPC）

少突膠質(zhì)細(xì)胞的主要功能是包繞軸突、形成絕緣的髓鞘結(jié)構(gòu)、協(xié)助生物電信號的跳躍式高效傳遞并維持和保護(hù)神經(jīng)元的正常功能。其異常會導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘病變和神經(jīng)元損傷?；谀z質(zhì)細(xì)胞的髓鞘再生策略一直被認(rèn)為是進(jìn)行性MS的潛在治療方法。給髓鞘發(fā)育不良的顫抖小鼠腦內(nèi)注射表達(dá)A2B5的膠質(zhì)祖細(xì)胞后，導(dǎo)致髓鞘的廣泛形成和臨床表型逆轉(zhuǎn)。

4.1 細(xì)胞來源、移植處理 OPC主要來源于胎兒組織，由于增殖能力有限，所以能提供細(xì)胞的數(shù)量有限。誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞（iPSC）可以作為少突膠質(zhì)細(xì)胞的來源，因此少突膠質(zhì)細(xì)胞具有使用自體細(xì)胞的可能［37］。通過CD140a和血小板衍生的生長因子α受體表型選擇，可以進(jìn)一步純化這些細(xì)胞，從而產(chǎn)生更有效的髓鞘碎片。因為是同種異體輸注，所以需要對受體進(jìn)行免疫抑制。免疫抑制劑皮質(zhì)類固醇、干擾素-β和硫唑嘌呤不會影響OPC的增殖、存活或遷移能力。

4.2 臨床試驗 OPC不能從血液或腦脊液進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)實質(zhì)，需要直接注射到中樞神經(jīng)系統(tǒng)特定位置，其中一些細(xì)胞能夠在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)遷移相當(dāng)長距離，因此雖然將細(xì)胞注射到限定位置，但仍然能夠獲得廣泛的髓鞘修復(fù)。Thiruvalluvan等［37］在動物模型中進(jìn)行的研究表明，人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（hiPSC）衍生的OPC向胼胝體中的MS樣病變遷移，并使裸露的軸突髓鞘化；這種新方法表明hiPSC衍生的OPC可用于進(jìn)展期的MS［37］。通過將iPSC衍生的特異性細(xì)胞移植到不同的動物疾病模型中，已經(jīng)廣泛證明了iPSC的治療潛力。iPSC臨床研究需要關(guān)注的是安全性和有效性，因為某些來源于iPSC的細(xì)胞自體移植后具有引發(fā)抗原特異性免疫排斥反應(yīng)的傾向。目前正在進(jìn)行一期臨床試驗，以評估在繼發(fā)進(jìn)展型MS患者單一時間點內(nèi)注射逐步增加劑量的OPC到多個腦內(nèi)位置的可行性和安全性［38］。

5 展望

現(xiàn)有證據(jù)表明I/AHSCT在抑制MS的炎癥性疾病活動方面具有實質(zhì)性和持續(xù)的效果。但仍然不確定I/AHSCT治療復(fù)發(fā)緩解型MS的確切機(jī)制。受益患者應(yīng)該是相對年輕的，疾病持續(xù)時間相對較短的，或者有活躍的復(fù)發(fā)緩解型MS和累積殘疾，但仍然能夠活動者。因此病例選擇也很重要。

不同組織來源的MSC特性是否相同決定了MSC的選擇。需要尋求足夠證據(jù)證明MSC不會在組織中持續(xù)存在以確定MSC移植的治療益處是自限性的，為重復(fù)給藥確立依據(jù)。如果MSC治療的主要有益效果是旁分泌，那么MSC治療最終可能會讓位于分子治療。

缺乏OPC很可能不是MS中髓鞘再造不足的原因，支持和維持髓鞘再生所必需的因子缺乏或者M(jìn)S病變環(huán)境中存在抑制因子，以及退化軸突不能支持髓鞘再生可能是主要障礙。因此，外源性O(shè)PC的應(yīng)用可能無法滿足需要，這是未來需要解決的問題。