大鼠潰瘍性結(jié)腸炎中醫(yī)證候動物模型研究進展

劉金響，史 英，劉海濤，袁敏惠，杜曉泉

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,陜西 咸陽 712000；3.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,陜西 咸陽 712000)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是世界公認(rèn)的難治性疾病之一，其臨床癥狀易反復(fù)發(fā)作，病情嚴(yán)重者，可發(fā)展成腸道癌癥。在目前的《潰瘍性結(jié)腸炎的治療:基于歐洲共識和中國共識》[1]中，推薦的首選治療藥物是美沙拉嗪。該藥短期療效不容置疑，但長期服用，會有較嚴(yán)重的不良反應(yīng)，降低患者的生活質(zhì)量，而中醫(yī)藥辨證治療UC，具有不良反應(yīng)小、療效顯著的優(yōu)勢。但由于中醫(yī)證候具有一定的抽象性，基礎(chǔ)實驗中常難以復(fù)制證候模型，導(dǎo)致中醫(yī)藥基礎(chǔ)研究陷入瓶頸。為探索UC中醫(yī)證候的復(fù)制方法，遂整理分析現(xiàn)有的中醫(yī)證候模型復(fù)制方法的文獻，以供以后的研究者參考。

1 模型復(fù)制方法概述

根據(jù)《潰瘍性結(jié)腸炎中醫(yī)診療專家共識意見(2017)》[2]，UC共分為以下7種類型：大腸濕熱證、熱毒熾盛證、脾虛濕蘊證、寒熱錯雜證、肝郁脾虛證、脾腎陽虛證、陰血虧虛證。經(jīng)總結(jié)文獻發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有的研究包括寒熱錯雜證、肝郁脾虛證、脾腎陽虛證以及脾虛濕困(蘊)證UC動物模型復(fù)制方法，且均采用“病證結(jié)合”的方式，即分別復(fù)制中醫(yī)證候動物模型、UC動物模型，形成“病證結(jié)合”的UC模型。

2 UC模型復(fù)制方法

UC的模型復(fù)制方法共有5種[3-6]：化學(xué)法、免疫法、復(fù)合法、基因模型、細(xì)菌感染模型。在已有的中醫(yī)證候UC模型中，以部分化學(xué)法和復(fù)合法為主要的模型復(fù)制方法，模型的具體復(fù)制方法[3,7]如下。

2.1 葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium，DSS)喂養(yǎng)法 調(diào)整DSS濃度、飲用時間，可誘導(dǎo)出急性和慢性兩種模型。將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，給予5% DSS溶液喂養(yǎng)7 d，可復(fù)制急性UC模型。之后換成雙純水喂養(yǎng)14 d，可轉(zhuǎn)為慢性UC模型。

2.2 乙酸灌腸法 乙酸濃度為3%～8%，需要提前利用冰乙酸配制，灌腸時間無具體限制，可每日灌腸，直至模型復(fù)制成功。①大鼠禁食不禁水24 h后，將大鼠麻醉。②用內(nèi)徑為2 mm的聚乙烯管，插入距離肛門8 cm的位置，先用肥皂水灌腸，注入1～3 mL乙酸。使大鼠保持頭低腳高的狀態(tài)，持續(xù)30～60 s。③用生理鹽水沖洗3次。

2.3 三硝基苯磺酸(trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS)/乙醇聯(lián)合灌腸法 TNBS與乙醇按2∶1的容積比進行混合。①大鼠禁食不禁水24 h，然后將大鼠麻醉。②用內(nèi)徑為2 mm的聚乙烯管，插入距離肛門8 cm的位置，灌入配制好的TNBS/乙醇溶液，給藥劑量為100～150 mL/kg。③將大鼠保持頭低腳高的姿態(tài)30～60 s，然后將大鼠放回籠中，保暖至自然蘇醒。也可以采用二硝基苯磺酸(dinitrobenzene sulfonic acid，DNBS)替代TNBS。

2.4 UC模型評價指標(biāo) UC模型的評價指標(biāo)主要包括疾病活動指數(shù)(disease activity index，DAI)和結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)(colon mucosal damage index, CMDI)，具體評分標(biāo)準(zhǔn)如下。

2.4.1 DAI評分標(biāo)準(zhǔn) DAI評分標(biāo)準(zhǔn)見文獻[8]。①大便性狀正常，無糞便隱血時，體質(zhì)量下降率為0%，計0分；若體質(zhì)量下降1%～5%，計1分；②大便呈軟便，并不成形，糞便隱血陽性，體質(zhì)量下降5%～10%，計2分；若體質(zhì)量下降10%～15%，計3分；③腹瀉，并可見肉眼血便，計4分。DAI=(體質(zhì)量減少百分比評分+大便性狀評分+隱血或血便評分)/3。

2.4.2 CMDI評分標(biāo)準(zhǔn) CMDI評分標(biāo)準(zhǔn)見文獻[9]。腸黏膜無損傷，計0分；腸黏膜充血、無潰瘍，計1分；腸黏膜充血和腸壁增厚，沒有潰瘍，計2分；腸黏膜一個部位潰瘍，不伴腸壁增厚，計3分；腸黏膜可見2個或2個以上潰瘍/炎癥，計4分；結(jié)腸黏膜可見2個或2個以上主要部位的潰瘍和炎癥，或一個部位潰瘍和(或)炎癥沿著結(jié)腸的長度延伸1 cm，計5分；若腸黏膜損傷沿著結(jié)腸的長度延伸2 cm以上，計6分，損傷每增加1 cm，就增加1分，最高記錄10分。

3 UC中醫(yī)證候動物模型復(fù)制方法

3.1 脾腎陽虛型UC動物模型復(fù)制方法

3.1.1 番瀉葉灌胃+肌肉注射氫化可的松+TNBS/乙醇灌腸法 文獻[10,14]采用這種方法。首先，大鼠每日用10 mL 番瀉葉浸出液灌胃；同時以氫化可的松注射液腹腔注射，每日1次，持續(xù)14～28 d。

3.1.2 大黃水煎液灌胃+肌肉注射氫化可的松+TNBS/乙醇灌腸法 文獻[15]采用這種方法。先復(fù)制脾虛模型。上午給予大鼠2 mL大黃水煎液灌胃，下午予以同容積蒸餾水灌胃，持續(xù)14 d。再復(fù)制腎陽虛模型。第15天開始，按25 mg/kg的劑量，左右臀部隔日交替注射氫化可的松，持續(xù)10 d。

3.1.3 腺嘌呤灌胃+冰番瀉葉溶液灌胃法 文獻[13,16]采用這種方法。先以腺嘌呤灌胃10 mL/kg，每日灌胃，連續(xù)2周。從第3周開始，每日予冰番瀉葉溶液10 mL/kg灌胃，連續(xù)2周。在每次灌胃后0.5 h，用4 ℃冰水50 mL均勻噴灑大鼠全身，濕潤皮毛，然后將大鼠置于電風(fēng)扇(轉(zhuǎn)速1 400 r/min)前吹干。以上方法在脾腎陽虛模型復(fù)制成功后，再通過TNBS灌腸復(fù)制UC模型。

3.2 肝郁脾虛型UC動物模型復(fù)制方法 肝郁脾虛模型UC復(fù)制方法共有2種。其中朱亞珍等[17]采用限食限動法復(fù)制肝郁脾虛證模型。先模擬饑飽失常，即束縛大鼠四肢，限制其自由活動, 每次8 h左右, 隔日禁食，持續(xù)2周。2周后，用TNBS/乙醇溶液灌腸，復(fù)制UC模型。劉喜平等[18]、顧立剛等[19]采用乙酸灌腸+限食限動法復(fù)制肝郁脾虛證UC模型。第一步，將大鼠每天不定時放入特制圓形箱內(nèi)限制活動和飲食，并用膠布束綁大鼠后肢，每天約8 h，持續(xù)3周。第二步，3周后用一定濃度醋酸灌腸誘導(dǎo)UC模型，并繼續(xù)重復(fù)第一步操作，疊加導(dǎo)致肝郁脾虛的因素，直至UC模型復(fù)制成功。

3.3 脾虛濕困型UC動物模型復(fù)制方法 文獻[20-24]采用豬油灌胃+強迫游泳法復(fù)制脾虛濕困證動物模型。大鼠單日禁食不禁水，并予2 mL的4 ℃純凈水灌胃1次；雙日自由飲食,并予2～4 mL精煉豬油灌胃1次；強迫大鼠每日站立于深2 cm的水中8 h,連續(xù)20 d。第21天開始，將大鼠禁食不禁水24 h后麻醉，用內(nèi)徑為2 mm左右的聚乙烯管從大鼠肛門插入8 cm,注入5% TNBS+50%乙醇[V(TNBS)∶V(乙醇)=12∶5]0.65～0.8 mL或給予DNBS和乙醇混合溶液(DNBS 30 mg溶解于0.25 mL 50%乙醇中)0.25 mL。再提起大鼠尾巴，捏住肛門，保持頭低腳高的狀態(tài)30～60 s。待其自然蘇醒，自由飲食飲水。第2天處死大鼠，取組織用于檢測相關(guān)指標(biāo)。

3.4 寒熱錯雜型UC動物模型復(fù)制方法 根據(jù)石磊等[12]的研究，寒熱錯雜型UC模型動物最終無寒證或熱證的臨床表現(xiàn)，且作者未給出明確的判斷標(biāo)準(zhǔn)，模型可能不成功。宋捷民等[25]、周堯等[26]采用寒涼藥物灌胃+皮下注射干酵母法復(fù)制“寒熱錯雜”模型。先復(fù)制虛寒模型：每天上午以丙硫氧嘧啶灌胃，劑量為100 mg/kg,灌胃30 min后放入4 ℃冰柜中冷凍6 h。下午以知母、石膏水煎液[m(知母)∶m(石膏)=3∶4]4 mL灌胃。第26天起加用番瀉葉灌胃，持續(xù)3 d。第29天皮下注射20%干酵母混懸液,使大鼠發(fā)熱。最后才復(fù)制UC模型。

3.5 UC中醫(yī)證候模型評價

3.5.1 脾腎陽虛證 ①大便溏泄，甚則脫肛；②消瘦、食欲下降、體質(zhì)量降低；③畏寒、弓背、蜷縮聚堆；④神態(tài)萎靡，毛色枯槁無光澤；⑤易疲勞乏力、嗜臥。第①～③項為主癥，第④～⑤項為兼癥，具備兩項主癥及兩項兼癥即可認(rèn)為脾腎陽虛證模型復(fù)制成功。

3.5.2 脾虛濕困證 ①倦怠、懶動、蜷縮聚堆；②神態(tài)萎靡，毛色枯槁、疏散、豎立，易脫毛；③小便量減少，大便軟或溏，浮便率升高，拉尾排便實驗呈陽性，排便時可出現(xiàn)肛門紅腫，甚至脫肛；④行動緩慢，甚至行走歪斜；⑤體質(zhì)量不增或增加緩慢明顯不及正常組，甚或降低；⑥飲食減少；⑦胃腸脹氣明顯。①～④項為主癥，⑤～⑦項為兼癥，出現(xiàn)上述癥狀中3項主癥或2項主癥加2項兼癥即可認(rèn)為脾虛濕困證模型復(fù)制成功。

3.5.3 肝郁脾虛證 ①一般狀態(tài)觀察:精神萎靡,毛發(fā)凌亂,色澤晦暗,喜蜷伏角落,耳尖明顯向背部方向靠攏；煩躁,警惕性高,容易激惹,目光焦灼,稍有聲響即成防御姿態(tài)；對束縛反應(yīng)劇烈,反抗、撕咬束縛帶,嘶叫,極力掙脫；挑逗大鼠表現(xiàn)為明顯煩躁、易于被激怒、防御姿態(tài)明顯；大便稀溏。②曠場實驗：運動總距離、中央?yún)^(qū)停留時間及進入次數(shù)明顯較少。③高架十字迷宮實驗：5 min內(nèi)進入開放臂、封閉臂的次數(shù)、時間明顯少于閉合臂。④新環(huán)境進食抑制實驗：5 min中大鼠進食明顯減少。

3.5.4 寒熱錯雜證 出現(xiàn)毛發(fā)無澤、爪甲顏色變淺、體質(zhì)量下降、大便較軟現(xiàn)象。第3周出現(xiàn)大便稀軟、弓背蜷縮、愛扎堆、懶動嗜臥、行動遲緩無力、形體消瘦、尾巴變涼、毛發(fā)枯槁無華。第4周模型組大鼠上述狀態(tài)較第3周更甚。第26天起加灌番瀉葉后,大便性狀改變。

4 討論

由于不同種屬的動物、不同模型復(fù)制方法、不同模型復(fù)制周期，不同喂養(yǎng)方式的動物模型均對實驗結(jié)果造成影響[27]。為了盡可能全面地總結(jié)中醫(yī)證型UC模型的復(fù)制方法，所納入的研究中，模型復(fù)制周期為14～28 d，所用大鼠種類主要為Wistar大鼠及SD大鼠，其中以Wistar大鼠最多。在大鼠性別選擇方面，多為雌雄各半或是雄鼠，雌雄各半鼠更符合臨床流行病學(xué)特征。所用大鼠體質(zhì)量為180～220 g。

中西醫(yī)理論體系中“病”的概念各不相同。而“病證結(jié)合”的本質(zhì)是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的“病”與中醫(yī)學(xué)的“證”相結(jié)合[28]。此種模型復(fù)制方法雖然同時兼顧了UC的西醫(yī)病理和中醫(yī)病機特征，是目前中醫(yī)證候動物模型復(fù)制方法較為合理的一種，但仍不夠嚴(yán)謹(jǐn)。目前UC病證結(jié)合動物模型復(fù)制方法基本分為兩種：第一種是先復(fù)制UC模型，再復(fù)制中醫(yī)證型模型；第二種是先復(fù)制中醫(yī)證型，再復(fù)制UC模型。兩種方法均可以一定程度地體現(xiàn)疾病和中醫(yī)證候的特征。在中醫(yī)藥理論中，可有多個疾病對應(yīng)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的一種“病”，并且中醫(yī)理論中疾病和證候本應(yīng)同時出現(xiàn)，不存在先后順序。在動物模型復(fù)制過程中，僅可復(fù)制一部分證候的臨床表現(xiàn)，舌象、脈象等重要指征無法在動物模型中體現(xiàn)。

在模型評價指標(biāo)中，中醫(yī)證候的辨別需要采集“四診”資料，動物模型中無法采集舌象、脈象等重要信息，僅以中醫(yī)證候的臨床表現(xiàn)為判定依據(jù)，使得中醫(yī)證候模型的評價標(biāo)準(zhǔn)不夠科學(xué)和客觀。因此，有學(xué)者[13，28]提出，在中醫(yī)證候模型的基礎(chǔ)上，依據(jù)辨證論治的原則，以經(jīng)典方藥干預(yù)，觀察實驗動物各項指標(biāo)恢復(fù)情況，以“反證”的方法驗證動物模型復(fù)制是否成功。同時，需引入更加客觀的指標(biāo)，如肝郁脾虛證模型引入了“曠場試驗”“高架十字迷宮實驗”“新環(huán)境進食抑制實驗”等，以完善中醫(yī)證候模型評價標(biāo)準(zhǔn)。

“病證結(jié)合”方法復(fù)制中醫(yī)證候動物模型雖然有很多缺陷，但目前仍是較合理的一種模型復(fù)制方法，對中醫(yī)藥的基礎(chǔ)研究起到重要作用。目前，除了基于“病證結(jié)合”原則復(fù)制UC的中醫(yī)證候動物模型之外，尚需繼續(xù)探索更科學(xué)合理的模型復(fù)制方法。