橋接蛋白PALB2在乳腺癌發(fā)生機(jī)制中的研究現(xiàn)狀

孫沙沙, 馬金柱, 布日古德

0 引言

乳腺癌是全世界女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤。2017年我國(guó)乳腺癌發(fā)病占女性惡性腫瘤的17.07%，居第一位[1-3]。現(xiàn)有研究提示，絕大部分腫瘤在分子水平上都會(huì)有基因異常變化,包括某些癌基因的激活、抑癌基因的失活及相關(guān)凋亡蛋白的異常,導(dǎo)致細(xì)胞的增殖分化異常,最終累積而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。PALB2被鑒定為一種BRCA2相互作用蛋白，被認(rèn)為是通過同源重組進(jìn)行DNA修復(fù)的細(xì)胞機(jī)制中的一個(gè)齒輪。PALB2與BRCA1相互作用，被BRCA1定位，并在BRCA1下游發(fā)揮作用，且從機(jī)制上來說，PALB2通過介導(dǎo)BRCA2和RAD51重組酶向DNA損傷位點(diǎn)的募集而為HR所必需?，F(xiàn)對(duì)PALB2結(jié)構(gòu)、生物學(xué)功能及其與乳腺癌的相關(guān)性作一綜述,以期對(duì)乳腺癌的基因研究提供一定幫助。

1 PALB2的結(jié)構(gòu)及其在HR中的生物學(xué)功能

PALB2基因位于16號(hào)染色體短臂(16p12.2)，包含13個(gè)外顯子，編碼的PALB2蛋白包含1 186個(gè)氨基酸殘基，分子量為131 kDa[4]，主要作為連接BRCA復(fù)合體(BRCA1-PALB2-BRCA2-RAD51)的橋接分子，并促進(jìn)RAD51的功能，同時(shí)可與多個(gè)同源重組相關(guān)蛋白結(jié)合(BRCA1、BRCA2、RAD51、RAD51C、MRG15 等)，在DNA損傷修復(fù)過程中發(fā)揮著重要作用。PALB2在HR中的作用已經(jīng)被證明涉及到幾個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，包括卷曲的螺旋結(jié)構(gòu)域、WD40結(jié)構(gòu)域和染色質(zhì)結(jié)合基序(ChAM)。

卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域位于PALB2(殘基9-42)的N末端，負(fù)責(zé)其與BRCA1的相互作用。除了積極調(diào)節(jié)HR外，BRCA1-PALB2相互作用還需要防止單鏈退火(Single strand annealing,SSA)，這是一種導(dǎo)致DSB修復(fù)的缺失途徑。Anantha等[5]使用U2OS/DR-GFP和U2OS/SA-GFP報(bào)告細(xì)胞，證明PALB2或BRCA2的耗竭導(dǎo)致HR活性受損，SSA顯著增加，而BRCA1的耗竭則導(dǎo)致HR和SSA活性的降低。這些結(jié)果證實(shí)BRCA1是DSB修復(fù)的關(guān)鍵，而PALB2則是引導(dǎo)DSB修復(fù)走向切除后的HR通路。在電離輻射后發(fā)現(xiàn)PALB2(S59、S157和S376)的三個(gè)N端S/Q位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，磷酸化事件由共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張突變蛋白和Rad3相關(guān)激酶介導(dǎo)[6]。磷酸化缺陷的PALB2未能促進(jìn)RAD51病灶的形成，導(dǎo)致HR受損和基因組不穩(wěn)定。

WD40域位于PALB2 C端，形狀為WD40型β-螺旋槳，有7個(gè)葉片[7]。該結(jié)構(gòu)域與BRCA2、DNA聚合酶η、RAD51、RAD51C和泛素連接酶RNF168相互作用[8]。即使WD40區(qū)域內(nèi)的單核苷酸變化也會(huì)干擾PALB2-BRCA2相互作用并導(dǎo)致HR缺乏[9]。PALB2的WD40結(jié)構(gòu)域?qū)τ谂cDNA聚合酶η的相互作用也很重要。最近，在PALB2的WD40結(jié)構(gòu)域中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)隱藏的核輸出序列，乳腺癌相關(guān)的PALB2截短突變W1038X暴露于此，導(dǎo)致PALB2易位到細(xì)胞質(zhì)并導(dǎo)致HR[10]缺陷。

ChAM是一個(gè)位于PALB2中部的進(jìn)化保守的結(jié)構(gòu)域。ChAM缺失的PALB2在支持MMC誘導(dǎo)的RAD51病灶形成中起著折衷的作用，提示ChAM通過染色質(zhì)聯(lián)合促進(jìn)PALB2的功能。染色質(zhì)結(jié)合被認(rèn)為是PALB2生物學(xué)功能不可或缺的組成部分，除了ChAM，MRG15是參與PALB2染色質(zhì)結(jié)合的另一個(gè)PALB2相互作用，MRG15屬于高度保守的MRG蛋白家族[11]，具有兩個(gè)功能域：一個(gè)是與PALB2和多個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子結(jié)合的MRG域；另一個(gè)是與賴氨酸36-三甲基化組蛋白H3結(jié)合的N-末端色域，由賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶集域介導(dǎo)。MRG15結(jié)合區(qū)大致定位于PALB2的中間區(qū)域(殘基611-764)，與兩個(gè)高度保守的區(qū)域(殘基611-629)和MBD-II(殘基724-737)完全匹配[12]。Bleuyard等[11]提出MRG15-PALB2復(fù)合物可能是活性基因中的一種基因組穩(wěn)定劑，使PALB2在DNA損傷后立即可用，并保證對(duì)復(fù)制脅迫的快速反應(yīng)，從而維持基因組的穩(wěn)定性。除了MRG15-PALB2相互作用外，PALB2在復(fù)制應(yīng)激期間也被磷酸化復(fù)制蛋白A募集。Murphy等[13]揭示了在復(fù)制應(yīng)激期間RPA的磷酸化刺激PALB2的募集并增加PALB2染色質(zhì)結(jié)合的穩(wěn)定性，使PALB2可用于緩解復(fù)制應(yīng)激并促進(jìn)停滯的復(fù)制分叉的恢復(fù)。ChAM與核小體結(jié)合并參與染色質(zhì)上PALB2-BRCA2-RAD51復(fù)合物的形成，在DSBs后迅速轉(zhuǎn)化為活性BRCA復(fù)合物。

除了BRCA復(fù)合物的形成，PALB2還直接與RAD51相互作用，增強(qiáng)其侵入鏈活性[14]。最近，Deveryshetty等[14]表明，PALB2的主要DNA結(jié)合域(DBD)位于其N-末端(N-DBD，殘基1-200)。N-DBD中只有4種氨基酸突變顯著干擾PALB2的HR活性。令人驚訝的是，作者發(fā)現(xiàn)PALB2的N-DBD增強(qiáng)了RAD51介導(dǎo)的鏈交換，并且在沒有RAD51的情況下也促進(jìn)了類似的反應(yīng)。利用鏈交換熒光分析，他們進(jìn)一步證明PALB2 N-DBD促進(jìn)了以DNA或RNA為底物的正向和反向鏈交換。

2 PALB2與BRCA1、BRCA2的相互關(guān)系

PALB2作為BRCA2細(xì)胞核內(nèi)定位、轉(zhuǎn)移和穩(wěn)定的協(xié)同因子，PALB2末端的WD40重復(fù)序列介導(dǎo)其與BRCA2相結(jié)合，再通過卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域直接與BRCA1相互作用，來修復(fù)DNA損傷。在DNA損傷修復(fù)過程中，PALB2綁定BRCA1和BRCA2，形成BRCA1-PALB2-BRCA2分子支架，促進(jìn)intraS端DNA損傷檢測(cè)點(diǎn)和同源重組功能的發(fā)揮[15]。

許多研究證明了BRCA1在HR途徑中的直接作用，因?yàn)锽RCA1缺陷細(xì)胞顯示出嚴(yán)重受損的HR介導(dǎo)的DSB修復(fù)[16]。繼DSB之后，BRCA1通過abraxas-RAP 80大復(fù)合體與DSB結(jié)合，從而誘導(dǎo)組蛋白在脫氧核糖核酸雙鏈體上的泛素化[16]。BRCA1-abraxas-RAP 80復(fù)合物的形成依賴于組蛋白H2AX的磷酸化，組蛋白H2AX是DNA損傷檢查點(diǎn)蛋白1和環(huán)指蛋白8的介體[17]。隨后，BRCA1通過與Mre11、Rad50、Nbs1的協(xié)同作用與CtIP形成復(fù)合物，以在HR的合成依賴性鏈退火途徑的早期步驟中促進(jìn)5’末端切除[18-19]。雖然BRCA1-CTIp復(fù)合物已被證明對(duì)雞DT40細(xì)胞中的HR途徑至關(guān)重要，但另一項(xiàng)研究報(bào)告稱，這種相互作用對(duì)于切除介導(dǎo)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的DNA修復(fù)或腫瘤抑制不是必需的[20]。接下來，BRCA1與PALB2和BRCA2相互作用，招募RAD51，RAD 51是HR修復(fù)途徑中的一種重要介質(zhì)。BRCA1-PALB2- BRCA2復(fù)合物的形成依賴于CHK2介導(dǎo)的BRCA1上S988的磷酸化作用[21]。BRCA1在HR中的功能不同于其在DNA損傷修復(fù)應(yīng)答(DNA damage response,DDR)中的其他功能。表達(dá)BRCA1突變體S988A的細(xì)胞具有缺陷的HR修復(fù)途徑，盡管檢查點(diǎn)調(diào)節(jié)或?qū)﹄婋x輻射的抗性保持完整[22]。此外，研究發(fā)現(xiàn)，T1394磷酸化殘基對(duì)BRCA1-PALB2的相互作用有影響，該位點(diǎn)的任何突變都會(huì)部分損害HR途徑的活性。

BRCA1-BACH1復(fù)合物也有助于HR途徑。該復(fù)合物不受心率限制，涉及許多DNA修復(fù)途徑，如細(xì)胞周期檢查點(diǎn)和DNA鏈間交聯(lián)修復(fù)[23]。BACH1是一種范可尼貧血(Fanconi貧血，F(xiàn)A-N)蛋白，通過磷酸絲氨酸與BRCA1的BRCT結(jié)構(gòu)域相互作用[24]。BACH1或BRCT結(jié)構(gòu)域中的突變可能破壞BRCA1和BACH1之間的相互作用，影響HR途徑，延遲DNA修復(fù)，并最終增加乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)[25]。

BRCA2通過實(shí)現(xiàn)基于同源重組的無錯(cuò)誤DNA雙鏈斷裂修復(fù)和S期DNA損傷檢查點(diǎn)控制，充當(dāng)基因組完整性的“看護(hù)者”。而PALB2，一種BRCA2結(jié)合蛋白，與核病灶中的BRCA2共聚焦，促進(jìn)其在關(guān)鍵核結(jié)構(gòu)中的定位和穩(wěn)定性(例如染色質(zhì)和核基質(zhì))，并使其發(fā)揮重組修復(fù)和檢查點(diǎn)功能。此外，在乳腺癌患者中發(fā)現(xiàn)的多個(gè)種系BRCA2錯(cuò)義突變，似乎破壞了PALB2與BRCA2的結(jié)合并使BRCA2-HR/DSBR功能失效。因此，PALB2維持BRCA2關(guān)鍵細(xì)胞的生化特性，并確保其腫瘤抑制功能。

3 PALB2與乳腺癌

大量研究表明，PALB2的雙等位基因突變導(dǎo)致范可尼貧血，而PALB2的單等位基因突變使攜帶者易患多種癌癥，如乳腺癌、胰腺癌和卵巢癌[26]。

乳腺癌是最常見的癌癥，也是全世界女性癌癥死亡的主要原因[27]。大約10%～15%的乳腺癌病例是由家族和遺傳因素引起的，這突出了遺傳易感性在乳腺癌發(fā)展中的重要意義。以前的研究已經(jīng)確定了廣泛的乳腺癌易感基因，包括BRCA1、BRCA2和TP53[28]。然而，家族性乳腺癌的易感基因(如乳腺癌的家族性外顯率為13%，僅占乳腺癌總患病率的13%)。最近對(duì)多基因面板測(cè)試的大規(guī)模分析證實(shí)了PALB2是一個(gè)高危的乳腺癌易感基因[29]，并且PALB2突變對(duì)乳腺癌的優(yōu)勢(shì)比(OR)與BRCA2突變的比值比相當(dāng)[30]。因此，全面了解PALB2的生物學(xué)功能對(duì)于乳腺癌的治療和精確的醫(yī)學(xué)治療至關(guān)重要。

PALB2與乳腺癌密切相關(guān)，并與乳腺癌的易患性、臨床病理特征和預(yù)后有關(guān)。研究測(cè)定了家族性乳腺癌隊(duì)列中BRCA突變陰性的PALB2單等位基因截?cái)嘧儺惖念l率(10/923，1.1%)，對(duì)照組(0/1 084，0%；P=0.000 4)。同時(shí)，具有單等位基因PALB2突變的個(gè)體患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)增加了2.3倍(95%CI:1.4～3.9；P=0.002 5)。隨后，多個(gè)基于人群的PALB2截?cái)嗤蛔兒Y查報(bào)告顯示，PALB2截?cái)嗤蛔償y帶者患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)增加了2～30倍[31-33]。

男性乳腺癌是一種罕見的疾病，占所有乳腺癌病例的1%以下。然而，20%的男性乳腺癌患者有乳腺癌家族史，突出了遺傳易感基因與男性乳腺癌之間的強(qiáng)相關(guān)性。迄今為止，在男性乳腺癌患者中已報(bào)道了許多PALB2的致病變異體[34-36]。2017年，Pritzlaff等[35]發(fā)現(xiàn)PALB2變異顯著增加了男性乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)(OR=6.6；P=0.01)。Rizzolo等[36]發(fā)現(xiàn),在非BRCA1/2改變的男性乳腺癌患者中，PALB2是最常見的突變基因(1.2%)，而有害的PALB2變異使男性乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)增加了9.63～17.30倍。最近，Yang等[33]通過分析來自21個(gè)國(guó)家的524個(gè)PALB2的致病變異體家族的數(shù)據(jù)，進(jìn)一步顯示PALB2的致病變異體攜帶者的男性乳腺癌相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)估計(jì)為7.34(95%CI:1.28～42.18；P=0.026)。

一些研究還發(fā)現(xiàn)，PALB2突變?nèi)橄侔┡c侵襲性臨床病理特征有關(guān)。Heikkinen等[37]報(bào)道乳腺癌患者PALB2 c.1592delT突變更易出現(xiàn)三重陰性表型(54.5%，P<0.000 1)。此外，與其他家族性或散發(fā)性乳腺癌患者相比，PALB2突變的乳腺癌患者更易出現(xiàn)在晚期疾病階段(分別為P=0.002 7和P=0.001 7)，Ki67水平更高(分別為P=0.000 4和P=0.049 0)。

在研究中，PALB2突變的女性乳腺癌患者10年生存率為48.0%(95%CI：36.5～63.2)，顯著低于PALB2突變陰性的女性乳腺癌患者(74.7%；95%CI：73.5～75.8)。最近，中國(guó)一項(xiàng)基于人群的乳腺癌易感基因篩查進(jìn)一步證實(shí)了PALB2在乳腺癌中的預(yù)后價(jià)值，PALB2突變的患者與非攜帶者相比，總體生存期更短(校正危險(xiǎn)比：8.38；95%CI：2.19～32.11；P=0.002)[38]。

4 PALB2缺陷的治療

PALB2是與遺傳性乳腺癌相關(guān)的基因突變。與普通人群相比，PALB2突變的女性患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)增加了5倍。目前，對(duì)此突變的婦女的外科治療缺乏研究。目前還沒有專門針對(duì)PALB2突變攜帶者手術(shù)的研究。乳腺癌的高風(fēng)險(xiǎn)使得雙側(cè)預(yù)防性乳房切除術(shù)成為PALB2突變婦女的潛在選擇。在推薦預(yù)防性乳房切除術(shù)之前，根據(jù)家族史采取逐案調(diào)查的方法，在這組患者中是合理的[39]。

聚ADP核糖聚合酶[poly(AD-P-ribose)polymerase,PARP]作為DNA損傷的傳感器和調(diào)節(jié)器，在單鏈DNA的修復(fù)中起著重要作用，突破了堿基切除修復(fù)途徑[40]。PARP抑制劑治療可阻止單鏈DNA斷裂的修復(fù)，并導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)DSB的形成。BRCA1/2缺陷細(xì)胞不能通過HR途徑修復(fù)DSBs，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[41]。Rodrigue等[42]利用siRNA介導(dǎo)的RNA干擾產(chǎn)生PALB2缺失的HeLa細(xì)胞，并在PARPi敏感性試驗(yàn)前補(bǔ)充外源siRNA抗性的PALB2變異體。表達(dá)PALB2的細(xì)胞變異株p.T1030I或p.W1140G顯示出明顯高于表達(dá)野生型PALB2的olaparib敏感性。Boonen等[43]開發(fā)了一個(gè)基于cDNA的PALB2變異體功能分析系統(tǒng)。通過評(píng)估PALB2變異體挽救PALB2基因敲除小鼠胚胎干細(xì)胞PARPi敏感性的能力，他們鑒定出12個(gè)PALB2變異體(p.Y28C，p.L35P，p.W912G，p.G937R，p.I944N，p.L947S，p.L961P，p.L972Q，p.A1025R，p.T1030I，p.G1043D，p.L1172P)顯示對(duì)PARPi過敏。

兒科進(jìn)行的BMN673的臨床前研究表明，PARPi對(duì)PALB2缺陷腫瘤具有綜合致死作用。這些數(shù)據(jù)表明，為了獲得最佳的臨床結(jié)果，應(yīng)該評(píng)估PALB2的狀態(tài)，并將其納入遺傳咨詢和患者治療方案中。

5 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，在HR過程中，PALB2在BRCA1和BRCA2之間起著重要的橋梁作用，促進(jìn)RAD51重組酶向DNA損傷位點(diǎn)的募集并將其組裝成核絲以啟動(dòng)DSB修復(fù)。PALB2突變的患者與非攜帶者相比，患病率增加、三陰性乳腺癌病理幾率大，預(yù)后差、總體生存期更短。雖眾多研究者對(duì)PALB2的具體結(jié)構(gòu)、多方面功能和復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)已經(jīng)進(jìn)行了多方面的研究，但為了提供個(gè)體化的臨床管理，需要進(jìn)一步的長(zhǎng)期、基于人群的PALB2突變研究和系統(tǒng)的功能驗(yàn)證，以積極應(yīng)對(duì)乳腺癌治療中所遇到的挑戰(zhàn)。