結(jié)構(gòu)新型促胰島素分泌肽的聚乙二醇修飾及生物活性研究

劉 東，任崇飛，楊欣茹，李鐵健，張貴民,2*

0 引言

糖尿病(Diabetes mellitus，DM)已成為嚴(yán)重威脅人類健康的內(nèi)分泌疾病[1]。目前，世界上2型糖尿病患者已超過4億，預(yù)計到2045年2型糖尿病患者將增加到6億。長期以來，DM患者主要通過注射胰島素及口服4大類降糖藥來控制血糖。胰高血糖素樣肽(GLP-1)類多肽藥物是治療2型糖尿病的重要藥物，GLP-1受體激動劑類藥物不良反應(yīng)小，可彌補(bǔ)口服降糖藥物不良反應(yīng)較大的不足[2]。

PEG是以-CH2CH2O-為基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)的大分子線性或分枝狀多聚物。PEG修飾又稱PEG化，影響蛋白質(zhì)或多肽的空間結(jié)構(gòu)，改變其各種生物和化學(xué)性質(zhì)，包括化學(xué)穩(wěn)定性增加，抵抗酶水解的能力提高，免疫原性和毒性降低，體內(nèi)半衰期延長等。PEG修飾可實現(xiàn)蛋白質(zhì)藥物在體內(nèi)的長效性，是現(xiàn)代生物制藥的發(fā)展趨勢之一。GLP-l類多肽的PEG修飾已成為開發(fā)長效糖尿病藥物的重要途徑。聚乙二醇化促胰島素分泌肽類似物屬于新一代的GLP-1類似物藥物，具有降低免疫原性、提高多肽活性保留率、減小給藥量、長效、安全性高的特點，在作用機(jī)制上優(yōu)于傳統(tǒng)糖尿病藥物，為2型糖尿病治療帶來創(chuàng)新性發(fā)展[3-4]。

本研究依據(jù)艾塞那肽(Exenatide)的39肽結(jié)構(gòu)設(shè)計，將其C端的非活性中心的剛性氨基酸結(jié)構(gòu)替換為柔性的氨基酸交聯(lián)區(qū)和1個半胱氨酸，得到了一種新的GLP-1類似物氨基酸序列多肽(代號：DT1)，實現(xiàn)了免疫原性降低(DT1不含剛性氨基酸結(jié)構(gòu))，同時保留了生物活性，柔性結(jié)構(gòu)的氨基酸連結(jié)肽又可提高PEG修飾后多肽與受體的結(jié)合能力[5]。以篩選得到的GLP-1類似物DT1為活性結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，選擇20 kDa分子量單馬來酰亞胺單甲氧基PEG(20k-mPEG-MAL)、40 kDa分子量單馬來酰亞胺單甲氧基PEG(40k-mPEG-MAL)和35 kDa分子量雙馬來酰亞胺無單甲氧基PEG(35k-PEG-Di-MAL)3種修飾劑對DT1進(jìn)行PEG修飾化研究。使用SP陽離子交換柱和C18柱分離純化3種修飾物[6]，純化后色譜純度大于99.0%。此外，通過體內(nèi)外活性測定，初步研究不同PEG修飾化對活性的影響，分析PEG化促胰島素分泌肽類似物同源二聚體PEG-Di-DT1的特性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Thermo Ultimate3000高效液相色譜儀，美國賽默飛世爾科技;AKTE Purifier純化系統(tǒng)，GE Health公司;制備高效液相色譜儀，北京創(chuàng)新通恒科技有限公司;MCO175-CO2培養(yǎng)箱，SANYO公司;MAX190酶標(biāo)儀，MOLECULAR DEVICES公司;Safire2多功能酶標(biāo)儀，瑞士TECAN公司;Hofer Mighty Slim電泳系統(tǒng)，美國GE公司;PL5234純水儀，美國Pall公司;Mini-Protein 蛋白電泳儀和電泳槽，美國Bio-Rad公司;ChampGel5000凝膠分析系統(tǒng)，北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司。

1.2 試劑 GLP-1類似物氨基酸序列多肽(代號：DT1)和艾塞那肽(Exenatide)為本公司自制，純度在98.0%以上;20 kDa、40 kDa的MAL-mPEG(單馬來酰亞胺活化PEG)，35 kDa的Di-MAL-PEG(雙馬來酰亞胺活化PEG)購于北京鍵凱科技有限公司;小鼠胰島瘤細(xì)胞RIN-m5F購于美國菌種保藏中心ATCC;胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)液，美國HyClone公司;3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)，阿拉丁公司;胰蛋白酶，BIC BASIC公司;cAMP-ELISA試劑盒，美國R&D公司;其他試劑購于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

6～8周齡，SPF級db/db小鼠，雌雄各半;6～8周齡，SPF級db/m小鼠，雌雄各半。所有小鼠均由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC檢測色譜條件[7]色譜柱型號為資生堂CAPCELL PAK C18(4.6 mm×150 mm，5 μm);流動相：以0.045%三氟乙酸-水溶液為流動相A，0.036%三氟乙酸-乙腈溶液為流動相B，梯度洗脫程序見表1。柱溫30 ℃，檢測波長214 nm;進(jìn)樣量為2 μl;流速1 ml/min。

表1 梯度洗脫程序

2.2 GLP-1類似物多肽的結(jié)構(gòu)設(shè)計和制備

2.2.1 多肽的結(jié)構(gòu)設(shè)計 多肽的氨基酸序列系參照上市Exenatide的39肽結(jié)構(gòu)，設(shè)計將Exenatide的C端8個剛性結(jié)構(gòu)氨基酸(SSGAPPPS)替換，通過計算機(jī)輔助設(shè)計對比分析GLP-1類似物多肽和Exenatide與受體之間的相互作用。

經(jīng)計算機(jī)模擬分析，篩選得到Exenatide的C端8個剛性結(jié)構(gòu)氨基酸(SSGAPPPS)替換為6個柔性的氨基酸Linker和1個半胱氨酸(GGTGGSC)，成為由38個氨基酸組成的促胰島素分泌肽類似物(DT1)(圖1)。

圖1 多肽結(jié)構(gòu)設(shè)計圖

2.2.2 DT1多肽的制備 DT1多肽采用Fmoc固相合成法合成。利用HOBt法活化氨基酸，按照序列連接到氨基樹脂上，共進(jìn)行38步合成。合成結(jié)束后，得到帶側(cè)鏈保護(hù)基的多肽樹脂。按13 ml/g肽樹脂，加入裂解試劑TFA/水/TIS/EDT=94∶2∶2∶2(V/V)，恒溫25 ℃下，攪拌反應(yīng)4 h，過濾、合并收集液。攪拌下滴加冰乙醚(-10 ℃)，得到白色沉淀，過濾，用少量冰乙醚洗滌粗品，并將粗品放入真空干燥器中干燥過夜，得DT1粗肽。

DT1粗肽經(jīng)HPLC反相純化，采用梯度洗脫，收集主峰純度大于98.0%的流出液，得制備洗脫液。收集的制備洗脫液經(jīng)濃縮凍干，得到DT1產(chǎn)品，純度大于98.0%(圖2)。

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圖2 DT1純化檢測圖

2.3 PEG對DT1的Cys定點修飾及純化[8-11]

PEG修飾劑選擇:20 kDa、40 kDa的MAL-mPEG，35 kDa的Di-MAL-PEG，分別按20.0 mg/ml溶解于50 mmol/L醋酸銨緩沖液中(pH 6.5)，室溫攪拌條件下，分別逐漸加入純度高于98%的DT1多肽，結(jié)合HPLC檢測，調(diào)整DT1∶PEG兩者的摩爾比。反應(yīng)4 h后，HPLC檢測PEG偶聯(lián)DT1達(dá)到85% 以上(圖3)，加入l% 的TFA終止反應(yīng)。

圖3 DT1多肽35k-PEG-Di-MAL修飾檢測圖

修飾反應(yīng)終止液用SP柱除去未修飾的多肽和使用C18柱純化分離除去游離的PEG修飾劑、PEG-mono-DT1和其他雜質(zhì)，20k-mPEG-DT1、40k-mPEG-DT1和PEG-Di-DT1經(jīng)非還原型SDS-PAGE純度測定和MALDI-TOF法測定分子量，均與理論分子量一致。圖4為MALDI-TOF法測定PEG-Di-DT1的質(zhì)譜分子量為42 613 Da，與修飾物的理論分子量43 kDa一致。3種PEG修飾物非還原SDS-PAGE純度均大于99.0%，僅含有0.5%左右的高分子蛋白雜帶。將純化后的20k-mPEG-DT1、40k-mPEG-DT1和PEG-Di-DT1分別凍干保存。

2.4 樣品體外生物活性測定與結(jié)果

2.4.1 DT1、Exenatide樣品配制 精確稱取DT1、Exenatide干粉各10 mg，用無菌注射用水分別溶解精確配成0.1 mg/ml;乘以定氮法測定的多肽百分含量后，用樣品稀釋液逐步稀釋至100 ng/ml，再按2倍倍比稀釋，共設(shè)8個稀釋度：100、50、25、12.5、6.25、3.12、1.56、0.78 ng/ml。

圖4 PEG-Di-DT1純化檢測圖

2.4.2 待測PEG修飾樣品的配制 精確稱取20k-mPEG-DT1、40k-mPEG-DT1和PEG-Di-DT1各10 mg，用無菌注射用水溶解精確配成0.5 mg/ml;用樣品稀釋液逐步稀釋至2 600 ng/ml，再按2倍倍比稀釋，共8個稀釋度：2 600、1 300、650、325、162.5、81.2、40.6、20.3 ng/ml。

2.4.3 生物活性測定方法[12]取生長狀態(tài)良好的RIN-m5F細(xì)胞消化后，細(xì)胞計數(shù)5×105～8×105個/ml，37 ℃培養(yǎng)18～36 h;用0.25%胰酶消化，按3.5×105個/ml，接種入24孔細(xì)胞板，每孔0.5 ml，置37 ℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)24～36 h。棄細(xì)胞液，加入細(xì)胞維持液，即含5 mg/ml牛血清白蛋白的RPMI 1640培養(yǎng)液，1.0 ml/孔，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)15 min。棄上清液，加入含1 mM的IBMX細(xì)胞維持液，0.9 ml/孔，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)15 min。盡可能快地加入0.1 ml/孔待測樣品，輕振蕩混勻后，37 ℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)15 min。取出細(xì)胞培養(yǎng)板置于冰上，棄上清液，加入1.0 ml/孔預(yù)冷的PBS洗2次，棄PBS。每孔加入300 μl細(xì)胞裂解液，-80 ℃和37 ℃反復(fù)凍融2次，每次30 min。吸出細(xì)胞裂解液，12 000 r/min離心10 min，參照cAMP-ELISA試劑盒檢測說明書，取上清液用于OD值測定。

2.4.4 體外生物活性結(jié)果 體外活性檢測結(jié)果顯示，DT1和Exenatide具有相似的促RIN-m5F細(xì)胞產(chǎn)生cAMP作用。在相同濃度下，測定其刺激RIN-m5F細(xì)胞中cAMP的ED50分別為0.39、0.56 ng/ml。見圖5。

圖5 DT1和Exenatide促RIN-m5F細(xì)胞產(chǎn)生cAMP作用

待測PEG修飾樣品的體外活性測定結(jié)果顯示(圖6)：20k-mPEG-DT1、40k-mPEG-DT1和PEG-Di-DT1在相同濃度下，其刺激RIN-m5F細(xì)胞中cAMP的ED50分別為20.65、87.49、14.76 ng/ml，按定氮法測定的肽含量計，分別為3.51、7.97、2.74 ng/ml。隨著PEG修飾分子量的增加(20 kDa至40 kDa)，生物活性保留從12%降低為5%;而PEG同源二聚體PEG-Di-DT1比單修飾40k-mPEG-DT1活性高3倍，活性保留率為15%[13]，與20k-mPEG-DT1活性相近，半衰期約為14 h，與Exenatide半衰期(約2 h)相比具有明顯優(yōu)勢。

圖6 PEG修飾物促RIN-m5F細(xì)胞產(chǎn)生cAMP作用

2.5.1 動物分組、給藥及血糖測定 將100只db/db自發(fā)性糖尿病小鼠，隨機(jī)分為5組：①模型組;②Exenatide組，5 μg/kg;③高劑量樣品組，45 μg/kg;④中劑量樣品組，15 μg/kg;⑤低劑量樣品組，5 μg/kg。每組20只，雌雄各半。20只db/m小鼠作為正常對照組小鼠[14]。

6組小鼠經(jīng)皮下注射給藥1次，按照10 ml/kg體積注射，對照組和模型組使用生理鹽水，Exenatide組以5 μg/kg量注射Exenatide，樣品組按設(shè)計量注射PEG-Di-DT1樣品給藥后，對所有小鼠采血，檢測空腹(0.5～12 h)和正常進(jìn)食后(24～72 h)血糖。測定受試藥及陽性藥單次給藥后的降糖作用強(qiáng)度和持續(xù)時間。

2.5.2 單次給藥對血糖影響的時效關(guān)系 以時間為橫坐標(biāo)，血糖值為縱坐標(biāo)，繪制各組的血糖平均值-時間效應(yīng)曲線(樣品組為高劑量組)，確定藥物降糖作用峰值時間(圖7)。

圖7 血糖-時間效應(yīng)曲線

試驗結(jié)果顯示，與模型組相比，陽性藥Exenatide及PEG-Di-DT1皮下注射給藥0.5 h后即可顯著降低血糖水平，Exenatide單次給藥的降糖作用可維持6 h，而PEG-Di-DT1高、中劑量組單次給藥72 h后，血糖水平仍明顯低于模型組(P<0.05)[15]。與模型組相比，PEG-Di-DT1低劑量組自給藥2～36 h內(nèi)具有明顯的降低血糖作用(P<0.01)。PEG-Di-DT1的降血糖作用具有明顯的劑量依賴性。DT1多肽的質(zhì)量和體內(nèi)外活性不低于上市藥物Exenatide，且有明顯提高。

2.6 PEG-Di-DT1修飾劑條件研究與結(jié)果

2.6.1 修飾比例優(yōu)化 本研究中，PEG-Di-DT1采用的修飾劑為mal-PEG-35k-mal(圖8)，能單一定向與DT1多肽C末端Cys的游離巰基發(fā)生共價偶聯(lián)反應(yīng)。DT1多肽與mal-PEG-35k-mal不同的修飾摩爾比，對修飾率及修飾終產(chǎn)物比例都有較大影響。

DT1多肽用50 mmol/L CH3COONa-CH3COOH緩沖液(pH 6.0)溶解為1.0 mg/ml，按摩爾比3∶1～1∶1(DT1多肽∶mal-PEG-35k-mal修飾劑)分別補(bǔ)入mal-PEG-35k-mal修飾劑，25 ℃反應(yīng)4 h，取各修飾產(chǎn)物進(jìn)行RP-HPLC分析。

圖8 PEG-Di-DT1修飾圖

理論上DT1多肽與mal-PEG-35k-mal的飽和偶聯(lián)反應(yīng)摩爾比為2∶1。分析結(jié)果見表2，當(dāng)DT1與mal-PEG-35k-mal反應(yīng)摩爾比為2.5∶1～2∶1時，達(dá)到75%以上修飾，反應(yīng)摩爾比為2.2∶1時，雙修飾目標(biāo)產(chǎn)物PEG-Di-DT1的產(chǎn)物比例達(dá)到85%以上。

表2 修飾比例與結(jié)果

2.6.2 修飾緩沖pH條件 mal-PEG-35k-mal修飾劑的最適偶聯(lián)反應(yīng)pH范圍為4.0～7.0[16]。當(dāng)pH過高時，mPEG-mal有非特異性與Lys的ε氨基偶聯(lián)反應(yīng)的風(fēng)險，造成修飾位點不均一。此外，DT1多肽在pH大于7.0的緩沖中易形成自身二聚體，該二聚體不能與mal-PEG-35k-mal發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)。DT1多肽分別用pH值為4.0、5.0、6.0、7.0的50 mmol/L CH3COONa-CH3COOH緩沖液溶解為1.0 mg/ml，按摩爾比2.2∶1(DT1多肽∶mal-PEG-35k-mal修飾劑)分別補(bǔ)入mal-PEG-35k-mal修飾劑，25 ℃反應(yīng)4 h，取各修飾產(chǎn)物進(jìn)行RP-HPLC分析。由表3可見，修飾反應(yīng)緩沖的pH值為4.0、5.0時的修飾率低于pH值為6.0、7.0時，研究發(fā)現(xiàn)，PEG-Di-DT1在高pH緩沖條件下不穩(wěn)定，從提高修飾率、增加PEG-Di-DT1的穩(wěn)定性以及防止非特異性偶聯(lián)產(chǎn)物這三方面綜合考慮，選擇pH 6.0的緩沖液作為修飾反應(yīng)緩沖。

表3 pH值與修飾結(jié)果

2.6.3 修飾緩沖鹽條件 考察在pH 6.0時具有較強(qiáng)緩沖能力的緩沖體系，包括：NaH2PO4-Na2HPO4緩沖體系、CH3COONa-CH3COOH緩沖體系，對DT1多肽與mal-PEG-35k-mal修飾劑偶聯(lián)反應(yīng)的影響。DT1多肽用pH 6.0的50 mmol/L CH3COONa-CH3COOH緩沖液和50 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4溶解為1.0 mg/ml，按摩爾比2.2∶1(DT1多肽∶mal-PEG-35k-mal修飾劑)分別補(bǔ)入mal-PEG-35k-mal修飾劑，25 ℃反應(yīng)4 h，取各修飾產(chǎn)物進(jìn)行RP-HPLC分析。結(jié)果顯示，在50 mmol/L CH3COONa-CH3COOH修飾體系中，主要修飾產(chǎn)物色譜峰為雙修飾目的產(chǎn)物PEG-Di-DT1占80.7%。在50 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4修飾體系，主要修飾產(chǎn)物色譜峰同樣為雙修飾目的產(chǎn)物PEG-Di-DT1占78.6%。結(jié)合PEG-Di-DT1穩(wěn)定性研究和下游制備純化需要，最終選擇pH 6.0的CH3COONa-CH3COOH緩沖作為修飾反應(yīng)的緩沖液體系。

2.6.4 修飾濃度條件 除了多肽與PEG的修飾比例可影響PEG修飾效率外，偶聯(lián)反應(yīng)時多肽的濃度同樣影響PEG修飾效率。一般情況下，在固定修飾摩爾比例的前提下，多肽濃度越高，PEG修飾效率越高。優(yōu)化修飾時DT1多肽的濃度，達(dá)到提高修飾效率、降低修飾成本的目的。DT1多肽用pH 6.0的50 mmol/LC H3COONa-CH3COOH緩沖液分別溶解為1.0、2.0、3.0 mg/ml，按摩爾比2.2∶1(DT1多肽:mal-PEG-35k-mal修飾劑)分別補(bǔ)入mal-PEG-35k-mal修飾劑，25 ℃反應(yīng)4 h，取各修飾產(chǎn)物進(jìn)行RP-HPLC分析。結(jié)果表明，DT1多肽濃度為1.0、2.0、3.0 mg/ml的修飾體系中，主要修飾產(chǎn)物均為雙修飾物PEG-Di-DT1，修飾產(chǎn)物比例基本一致，分別為85.2%、84.5%、83.9%。隨著DT1多肽濃度的增加，其修飾產(chǎn)物的黏度明顯增加，雙修飾產(chǎn)物比例下降，最終選擇1.0 mg/ml作為DT1多肽PEG修飾反應(yīng)的濃度。

3 討論

本研究在設(shè)計篩選的DT1基礎(chǔ)上，對其C末端半胱氨酸進(jìn)行定向PEG修飾，并測定了修飾物的生物活性，最終得到新型聚乙二醇化同源二聚體偶聯(lián)的促胰島素分泌肽類似物PEG-Di-DT1。PEG-Di-DT1為DT1經(jīng)35k-PEG-Di-MAL同源雙肽修飾純化而得。PEG-Di-DT1屬于PEG化長效藥物，作為親水性大分子的PEG，能夠屏蔽DT1多肽的免疫位點，可降低其免疫原性，DT1多肽中改造了艾塞那肽的8個非活性中心非天然的剛性序列，同樣可減少多肽引入的免疫原性，同時，雙活化無單甲氧基PEG修飾劑的使用和獨特的修飾方式，產(chǎn)品的體內(nèi)外生物活性保留率高，結(jié)構(gòu)中PEG-Di-MAL分子不含有單甲氧基，也具有更低的免疫原性。預(yù)計比已上市3種同類產(chǎn)品Byetta、Bydureon和Victoza在人體內(nèi)抗體產(chǎn)生率和滴度更低。

雙馬來酰亞胺無單甲氧基PEG修飾方式獨特新穎，未見其他研究文獻(xiàn)。PEG修飾樣品的活性測試表明，隨著修飾PEG分子質(zhì)量的增加，雖然偶聯(lián)物的半衰期延長，活性保留卻降低，但新型 PEG修飾同源二聚體35k-PEG-Di-DT1比單修飾40k-mPEG-DT1活性高3倍，活性保留率還高于20k-mPEG-DT1。在同等給藥劑量(以多肽計)下，PEG-Di-DT1和Exenatide皮下注射給藥0.5 h后即可顯著降低血糖水平。在長效性對方面，Exenatide單次給藥的降糖作用只維持6 h，PEG-Di-DT1組單次給藥72 h后，仍可降低db/db小鼠的血糖水平。PEG-Di-DT1具有良好的體內(nèi)外生物活性和更低的免疫原性，有潛力成為治療人2型糖尿病的長效藥物，至少可實現(xiàn)人體內(nèi)皮下7 d給藥1次的治療目的。