基于藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)體表觀遺傳學(xué)逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的研究進(jìn)展

鄭小麗，汪佳琪，余露山，曾 蘇*

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院深圳醫(yī)院（廣東深圳 518116）

2.浙江大學(xué)藥物代謝和藥物分析研究所（杭州 310058）

3.浙江省抗腫瘤藥物臨床前研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（杭州 310058）

耐藥性在細(xì)菌對某些抗生素產(chǎn)生抗性時(shí)首次被提出，是指疾病對藥物治療出現(xiàn)耐受的一種常見現(xiàn)象。耐藥性是癌癥治療的最大障礙之一，包含原發(fā)性耐藥和繼發(fā)性耐藥，兩者的區(qū)別是前者未接觸藥物就已存在，后者是接觸藥物后才產(chǎn)生的。雖然許多類型的腫瘤最初對化療敏感，但隨著時(shí)間的推移，可能會(huì)出現(xiàn)對一種藥物的耐藥的同時(shí)，對其他結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制完全不同的藥物也產(chǎn)生耐藥，這種現(xiàn)象稱為多藥耐藥（Multidrug resistance，MDR），是造成腫瘤化療失敗的主要原因。近年來表觀遺傳改變逐漸用于癌癥檢測、診斷和預(yù)后的特異性標(biāo)志物和主要候選物，并提出了腫瘤表觀遺傳組學(xué)，表觀遺傳修飾可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生藥物抗性，使其不被常規(guī)癌癥療法殺死，而逆轉(zhuǎn)該異常修飾可以為治療耐藥性腫瘤提供新的治療策略?，F(xiàn)就藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)體表觀遺傳修飾與腫瘤耐藥的研究進(jìn)展作一綜述[1-2]。

1 表觀遺傳調(diào)控

1.1 DNA甲基化

DNA甲基化是研究最深入的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制，通常與靶基因的表達(dá)丟失相關(guān)。哺乳動(dòng)物基因組上大部分CpG二核苷酸丟失，僅有3%-5%成簇形成CGI，該區(qū)域DNA甲基化形成5-甲基胞嘧啶（5mC）[3]。DNA甲基化抑制轉(zhuǎn)錄的途徑為直接干擾轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到基因啟動(dòng)子上的特定位點(diǎn)[4]或者直接與特異性轉(zhuǎn)錄阻抑物結(jié)合[5]。

體內(nèi)DNA甲基化是個(gè)可逆動(dòng)態(tài)的過程，包括主動(dòng)去甲基化和被動(dòng)去甲基化。主動(dòng)去甲基化酶包括TET、AID/APOBEC、TDG/SMUG1[6]，其中TET蛋白可以將5mC代謝成5-羥甲基化胞嘧啶（5hmC）[7]，已經(jīng)有研究結(jié)果表明TET2對于正常骨髓生成是重要的，TET2酶失活有利于髓樣腫瘤的發(fā)生，提示檢測骨髓惡性腫瘤患者的5hmC水平可能作為證明診斷和預(yù)后的工具[8]。被動(dòng)去甲基化是由甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）的活性被抑制或濃度過低造成，DNMTs的抑制劑是最早開發(fā)的表觀遺傳藥物，逆轉(zhuǎn)腫瘤中異常的DNA甲基化，如已經(jīng)被FDA和EMA批準(zhǔn)用于治療骨髓增生異常綜合癥的地西他濱和阿扎胞苷。

1.2 組蛋白修飾

染色質(zhì)基本結(jié)構(gòu)單位是核小體，由DNA和組蛋白組成。組蛋白的N端游離在核小體之外，富含各種化學(xué)修飾，如甲基化、乙?；?、泛素化、磷酸化等。其中甲基化和乙?；难芯渴艿綇V泛關(guān)注，這些不同化學(xué)修飾的組合被稱作“組蛋白密碼”。

組蛋白甲基化發(fā)生在H3、H4和H2B組蛋白N端精氨酸或者賴氨酸殘基上，精氨酸的甲基化通常與基因轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)，而賴氨酸甲基化比較復(fù)雜，也是近年來研究的熱點(diǎn)。其中H3K4通常與基因激活和轉(zhuǎn)錄延長相 關(guān)， 并 由 HMTs（SET1，MLL1-4和 SET7/ 9等）介導(dǎo)[9-11]。而H3K9則通常與基因抑制相關(guān)，并由SUV39H1，G9a和SETDB1 /ESET等HMTs催化[9]，其中SUV39蛋白是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶[12]。

組蛋白乙?；梢灾泻唾嚢彼釟埢恼姾?，以減弱組蛋白與負(fù)電荷的DNA之間的相互作用，使得染色質(zhì)構(gòu)象更為松散，通常組蛋白高乙?；龠M(jìn)基因轉(zhuǎn)錄。組蛋白在進(jìn)化中是保守的,但在腫瘤中這種平衡經(jīng)常被打破，出現(xiàn)組蛋白修飾紊亂。因此組蛋白修飾的改變也有望成為的治療靶標(biāo)，近年來HDACs的抑制劑相繼上市用于治療腫瘤，如伏立諾他、羅米地辛、貝利司他、西達(dá)本胺和帕比司他，其中西達(dá)本胺是中國首個(gè)也是唯一獲CFDA批準(zhǔn)上市的HDAC藥物。

1.3 非編碼RNA

非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）是指不編碼蛋白質(zhì)，但具有某些功能的RNA。非編碼RNA按長度劃分為snoRNA、microRNA、siRNA，piRNA及片段大于200bp的lncRNA等。ncRNA參與基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控與許多疾病，包括各種癌癥和神經(jīng)疾病等相關(guān)，可以提供非常豐富的生物學(xué)信息[13]。

miRNA（microRNA）是一類從內(nèi)源轉(zhuǎn)錄物加工的非編碼RNA，通過轉(zhuǎn)錄后抑制基因表達(dá)[14]，是研究最為深入的一類小RNA。多個(gè)生物系統(tǒng)中鑒定含有miRNA，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過1 500個(gè)成熟的人miRNA[15]，并且參與調(diào)節(jié)至少60%的蛋白質(zhì)編碼基因[16]。而lncRNA在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后修飾均扮演重要的角色，且與miRNA存在相互作用，有研究發(fā)現(xiàn)其可以直接作用于miRNA發(fā)揮“海綿作用”，同時(shí)又可以構(gòu)成miRNA-lncRNA負(fù)反饋調(diào)節(jié)環(huán)路。miRNA和lncRNA負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)參與細(xì)胞生長、增殖、分化、凋亡等多種信號通路[17-18]，因此， ncRNA的失調(diào)與腫瘤發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移等相關(guān)。

2 表觀遺傳學(xué)參與腫瘤MDR

腫瘤產(chǎn)生的耐藥性，與藥物代謝相關(guān)的分子機(jī)制包括藥物滅活，藥物外排，藥物攝取減少等密切有關(guān)，而藥物代謝酶和藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體的表觀遺傳修飾，如DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA調(diào)控等則可以開發(fā)新型抗腫瘤藥物和設(shè)計(jì)新的臨床治療方案，逆轉(zhuǎn)腫瘤產(chǎn)生的耐藥性。

2.1 藥物的滅活

藥物在體內(nèi)的活化是個(gè)很復(fù)雜的過程，許多抗腫瘤藥物必須經(jīng)歷代謝活化成活性代謝產(chǎn)物以獲得臨床治療效果，而參與這過程的某些重要蛋白可以改變，部分降解或使藥物與其他分子或蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，最終導(dǎo)致其激活。介導(dǎo)藥物活化或者失活的代謝酶包括細(xì)胞色素P450（CYP）系統(tǒng)，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）超家族和尿苷二磷酸-葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（UGT）超家族。GST超家族是一組能夠保護(hù)細(xì)胞大分子免受親電化合物影響的解毒酶，GST通過直接解毒和抑制有絲分裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑改善腫瘤的耐藥性[19]。UGT超家族具有催化葡糖醛酸化的功能，且在很多癌癥中UGT1A1轉(zhuǎn)錄水平被下調(diào)[20]，在結(jié)腸癌中DNA甲基化參與調(diào)控UGT1A1的轉(zhuǎn)錄抑制。伊立替康可用于轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌的一線治療， UGT1A1能夠失活伊立替康的活性代謝物7-乙基-10-羥基喜樹堿（SN-38）。有趣的是結(jié)腸癌中UGT1A1的表達(dá)沉默能增強(qiáng)伊立替康的療效[21]，而當(dāng)DNA甲基化改變時(shí)，就可能造成結(jié)腸癌對伊立替康產(chǎn)生抗性。因此可以適當(dāng)合用表觀遺傳藥物，提高抗腫瘤藥物的化療作用。

2.2 細(xì)胞內(nèi)藥物外排增加

由ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的藥物外排增加是最常見的藥物流出引起的多藥耐藥機(jī)制[22]，其中研究最深入的三種外排轉(zhuǎn)運(yùn)體為多藥耐藥蛋白1（MDR1，P-glycoprotein，Pgp）、多藥耐藥相關(guān)蛋白1（MRP1）和乳腺癌耐藥蛋白（BCRP），它們涉及多種癌癥的耐藥性。目前發(fā)現(xiàn)的ABC家族有49個(gè)成員，按照高度保守的核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域和更可變的跨膜結(jié)構(gòu)域分類[23]。藥物可以與跨膜結(jié)合域結(jié)合，核苷酸結(jié)合位點(diǎn)的ATP水解促使藥物外排到細(xì)胞外，該機(jī)制在防止細(xì)胞內(nèi)毒素的過度蓄積中發(fā)揮重要作用[24]，然而在腫瘤細(xì)胞中外排轉(zhuǎn)運(yùn)體過度表達(dá)，則會(huì)增加抗腫瘤藥物外排，細(xì)胞內(nèi)藥物濃度減少，導(dǎo)致MDR。見表1。

MDR1是第一個(gè)被識別和廣泛研究的外排轉(zhuǎn)運(yùn)體，在肝癌、結(jié)腸癌和腎癌中，均表現(xiàn)出高表達(dá)，與MDR相關(guān)，而不表達(dá)MDR1的組織，例如肺，乳腺和前列腺細(xì)胞，相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MRP1或BCRP的高表達(dá)能介導(dǎo)MDR[25]。有趣的是在肺癌中，多柔比星單灌注肉瘤肺轉(zhuǎn)移患者50 min后能夠誘導(dǎo)腫瘤組織中MDR1的表達(dá)上升3-15倍，但對正常肺細(xì)胞卻沒有影響，表明肺癌中MDR1基因可以在瞬時(shí)暴露于化療藥物后快速激活[26]。

表1 藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體的異常表觀遺傳修飾Table 1.Abnormal epigenetic modifications of drug transporters

最早的研究始于急性骨髓性白血病中的MDR表型，使用甲基化敏感性和甲基化不敏感性限制酶的Southern分析，在人類T細(xì)胞白血病細(xì)胞系中MDR1表達(dá)與MDR1基因啟動(dòng)子區(qū)的脫甲基密切相關(guān)。用5'-氮雜環(huán)氧胞苷處理慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞后，能夠誘導(dǎo)MDR1 mRNA的表達(dá)，同時(shí)脫甲基化治療后增加細(xì)胞系對表柔比星的抗性和降低道諾霉素蓄積，推測DNA甲基化與MDR現(xiàn)象的相關(guān)性[27]。接著通過亞硫酸氫鹽基因組測序技術(shù)檢測前髓細(xì)胞白血病細(xì)胞系HL60中MDR1的啟動(dòng)子區(qū)域，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)TSS上游和下游的多個(gè)位點(diǎn)均出現(xiàn)了高甲基化，而高表達(dá)MDR1的耐藥細(xì)胞系HL60 / E8在兩個(gè)區(qū)域中基本上所有位點(diǎn)都未甲基化，更直接驗(yàn)證了耐藥細(xì)胞系的產(chǎn)生與DNA甲基化相關(guān)。因此某些作為藥物治療后發(fā)生脫甲基化作用可能是多藥耐藥細(xì)胞系中MDR1活化的原因[28]。另外隨著深入研究發(fā)現(xiàn)MDR1啟動(dòng)子區(qū)受到DNA高甲基化調(diào)控后出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄抑制，且CHIP實(shí)驗(yàn)證明缺乏轉(zhuǎn)錄阻遏物MBD2和MBD3的小葉卵母細(xì)胞中，MeCP2富集在MDR1啟動(dòng)子區(qū)，且HDAC1能夠MeCP2結(jié)合從而定位到MDR1啟動(dòng)子區(qū)。最終引起MDR1的沉默。用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑地西他濱和組蛋白脫乙酰酶抑制劑曲古菌素A合用處理后能夠通過釋放MeCP2顯著上調(diào)MDR1的蛋白表達(dá)，但單給曲古菌素A因不能從甲基化染色質(zhì)釋放MeCP2而不影響MDR1的表達(dá)[29]，提示我們組蛋白脫乙?；赡苁且餗DR1激活的原因之一。用丁酸鈉處理耐阿霉素K562和耐長春新堿K562株系后，觀察到MDR1的mRNA表達(dá)量增加是劑量依賴性的[30]，而用曲古抑菌素A處理人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞，可將MDR1 mRNA水平提高20倍[31]，說明組蛋白乙?；_實(shí)參與了MDR1的調(diào)控，但在DNA高甲基化狀態(tài)下，組蛋白乙?；瘎t不能單獨(dú)起到活化MDR1的作用。

基于表觀遺傳調(diào)控MDR1的機(jī)制，尋找解決DNA脫甲基化及組蛋白乙?；脑?，能夠更好地控制化療過程中MDR1的不當(dāng)激活引起多藥耐藥現(xiàn)象。比如多柔比星、蒽環(huán)類及其類似物[32]等能夠快速誘導(dǎo)MDR1，使用這些藥物就要重點(diǎn)監(jiān)控藥物對MDR1的激活作用。為了有效控制這些抗腫瘤藥物引起的表觀遺傳修飾的改變，他們可以和其他藥物合用，緩解因藥物引起的獲得性多藥耐藥。

2.3 細(xì)胞內(nèi)藥物攝取減少

除了由ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的藥物外排外，由SLC轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的藥物攝取減少也是常見的多藥耐藥機(jī)制[2,33-34]。奧沙利鉑是SLC22A2基因編碼的有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體2（OCT2）的底物，對腎細(xì)胞癌（RCC）原發(fā)性耐藥。研究發(fā)現(xiàn)DNA甲基化導(dǎo)致RCC中OCT2表達(dá)異常沉默[2]。采用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑地西他濱（DAC）能顯著提高RCC中OCT2的表達(dá)，而奧沙利鉑的外排轉(zhuǎn)運(yùn)體MAKE 2K的低表達(dá)則是由組蛋白H3K4和K 27三甲基化, K 27乙?；鹋cDNA甲基化無關(guān)[35]。因此，提出通過誘導(dǎo)攝取型藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體，增加抗癌藥物細(xì)胞內(nèi)濃度的逆轉(zhuǎn)耐藥新策略[2,33]。依據(jù)該機(jī)制DAC和奧沙利鉑序貫使用，在細(xì)胞和荷瘤鼠模型上獲得了顯著的效果[36]。實(shí)體瘤局部缺氧是一種常見的現(xiàn)象，研究發(fā)現(xiàn)50%-60%的實(shí)體瘤存在缺氧現(xiàn)象，而且越往實(shí)體瘤中心缺氧越嚴(yán)重。RCC在缺氧條件下腎癌細(xì)胞中一些藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)明顯被抑制，如ENT1、OCT1、OCT3、OAT4、PHT2等， 同 時(shí) 與 DNA甲 基化相關(guān)的DNA甲基羥化酶TET1/2/3也顯著下調(diào)，特別是原本在常氧下高表達(dá)攝取DAC的轉(zhuǎn)運(yùn)體ENT1在低氧下低表達(dá)、常氧下能被DAC誘導(dǎo)的OCT2，在低氧條件下不但不能被誘導(dǎo)甚至抑制程度更加嚴(yán)重。上述因素加劇了腎癌耐藥，進(jìn)一步增加了耐藥逆轉(zhuǎn)的難度。因此，提出應(yīng)用調(diào)控藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體表觀遺傳動(dòng)態(tài)修飾機(jī)制和改善腫瘤微環(huán)境的雙管齊下策略，逆轉(zhuǎn)實(shí)體瘤的低氧耐藥[37]。首先通過一種基于血紅蛋白的腎靶向攜氧納米粒提高低氧下腫瘤組織部位DAC和O2的濃度，從而在提高癌細(xì)胞表面ENT1表達(dá)的同時(shí)增加DAC的攝取，最終誘導(dǎo)OCT2表達(dá)增加，促進(jìn)奧沙利鉑的攝取，顯示出更優(yōu)的抑瘤效果。

與癌旁組織相比，結(jié)腸癌組織中的有機(jī)溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白β（OSTβ）表達(dá)較低。其表觀遺傳機(jī)制是p300通過調(diào)節(jié)OSTβ啟動(dòng)子區(qū)域的H3K27Ac狀態(tài)來控制OSTβ的表達(dá)，從而導(dǎo)致OSTβ在大腸癌中低表達(dá)[38]。

CNT2基因在CRC腫瘤組織中的表達(dá)幾乎完全丟失。轉(zhuǎn)錄水平的抑制是CNT2轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白表達(dá)丟失的重要原因之一。研究發(fā)現(xiàn)[39]，腫瘤組織和配對正常組織中CNT2基因啟動(dòng)子區(qū)的DNA甲基化水平無顯著性差異，且腫瘤組織中與轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)的組蛋白修飾H3K9Ac、H3K18Ac和H4Ac水平降低，與轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān)的組蛋白修飾H3K9me3水平升高。組蛋白去乙?；敢种苿┣乓志谹（TSA）可以降低CNT2基因啟動(dòng)子區(qū)去乙?；?，并且能夠誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞中CNT2基因的轉(zhuǎn)錄，增強(qiáng)CRC細(xì)胞對CNT2轉(zhuǎn)運(yùn)體底物的攝取。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，HDAC7的活性水平與CNT2的表達(dá)抑制密切相關(guān)。通過HDAC抑制劑TSA和FK228與CNT2底物類化療藥物克拉屈濱分別聯(lián)合用藥可以協(xié)同增強(qiáng)化療藥物對結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT15和HT29的抗腫瘤效應(yīng)。

2.4 ncRNA調(diào)控

臨床腎癌組織中一些miRNA的表達(dá)異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和耐藥密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)[40]，miR-489-3p和miR-630在腎癌組織中顯著上調(diào)，而且它們對OCT2的表達(dá)具有顯著的抑制作用,我們猜測其表達(dá)與腎癌對OCT2底物奧沙利鉑的耐藥相關(guān)。采用OCT2和miR-630或miR-489-3p共表達(dá)腎癌細(xì)胞荷瘤鼠為模型，研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)這兩條miRNA后奧沙利鉑的藥效作用消失。此外特別值得關(guān)注的是，在外泌體中含有高濃度的miR-630或miR-489-3p，該結(jié)果提示這兩條miRNA是臨床腎癌采用奧沙利鉑療效的潛在生物標(biāo)志物。

另一個(gè)研究表明[41]，一條新的lncRNA SANT1與SLC47A2存在順式調(diào)節(jié)關(guān)系。在正常腎細(xì)胞中，高表達(dá)的lncRNA SANT1可靶向于SLC47A2的SFPQ/E2F1/HDAC1復(fù)合物形成RNA-蛋白復(fù)合體，介導(dǎo)E2F1/HD AC1的脫靶，進(jìn)而引起SLC47A2啟動(dòng)子區(qū)H3K27ac修飾水平和S-5-P RNAP II結(jié)合的顯著上調(diào)，激活基因的轉(zhuǎn)錄。而在腎癌中l(wèi)ncRNA SANT1調(diào)控消失最終導(dǎo)致MATE2K轉(zhuǎn)錄抑制，MATE2K由SLC47A2基因編碼，能介導(dǎo)許多內(nèi)源性和外源性物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，我們猜測其表達(dá)水平對腎癌細(xì)胞中抗癌藥物的代謝和相關(guān)內(nèi)源性物質(zhì)的外排產(chǎn)生重要影響。

3 基于表觀遺傳學(xué)逆轉(zhuǎn)MDR的意義

腫瘤的MDR是相當(dāng)復(fù)雜的過程，還需要借助生物醫(yī)學(xué)大數(shù)據(jù)深入研究耐藥機(jī)制，從而鑒定出新靶標(biāo)、生物標(biāo)志物、對藥物不敏感的耐藥性癌細(xì)胞等，開發(fā)逆轉(zhuǎn)耐藥的新藥和新治療策略[42-43]。未來腫瘤的治療應(yīng)該更加具有靶向性，而表觀遺傳的動(dòng)態(tài)修飾性質(zhì)，使得表觀遺傳藥物與常規(guī)化療藥物的聯(lián)合用藥策略能夠增強(qiáng)耐藥性癌細(xì)胞對抗腫瘤藥物的敏感性，因此對逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥具有臨床治療意義。