阿司匹林聯(lián)合褪黑素治療骨質(zhì)疏松癥的實(shí)驗(yàn)研究*

陳宣煌，高小強(qiáng)，吳 峰，黃漫為，鄭錦清，陳金輝

(1.莆田學(xué)院附屬醫(yī)院骨科，福建 莆田 351100；2.莆田學(xué)院附屬醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科；3.莆田學(xué)院附屬醫(yī)院中醫(yī)骨傷科)

在中國，骨質(zhì)疏松癥是一種常見病、多發(fā)病，其發(fā)病率也因?yàn)樯鐣饾u老齡化而逐年不斷升高，尤其是絕經(jīng)后的婦女，其骨質(zhì)疏松癥和骨折并發(fā)癥發(fā)病率更高，是男性的8倍，原發(fā)性骨質(zhì)疏松已經(jīng)成為世界性健康問題[1-3]。目前臨床多采用藥物治療，但大部分藥物均存在較大不良反應(yīng)及價格昂貴等缺點(diǎn)，百年老藥阿司匹林近幾年被研究證明有顯著改善老年人骨質(zhì)密度的新功能，且作為一種長期臨床應(yīng)用的藥物，副作用小，價格低[4]。最近有學(xué)者研究[5]發(fā)現(xiàn)褪黑素不僅能夠參與機(jī)體生物體溫、免疫功能、心血管發(fā)育等，還具有抗衰老抗氧化的作用，且還能促進(jìn)骨的形成，增加骨量。尤其是女性，隨著年齡的增長，血清中的褪黑素水平明顯下降，骨質(zhì)疏松的發(fā)生率也明顯升高[6-7]。本研究通過將阿司匹林、褪黑素單獨(dú)和聯(lián)合應(yīng)用于大鼠骨質(zhì)疏松癥治療，觀察其治療效果，從而為臨床治療提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)組別

選擇100只3月齡SD雌性大鼠，按照隨機(jī)生成數(shù)字的方法分成A組：假手術(shù)組(Sham組)，B組：卵巢切除組(OVX組)，C組：單純阿司匹林組(OVXa組)，D組：單純褪黑素組(OVXm組)，E組：阿司匹林+褪黑素組(OVXam組)；每組20只。分術(shù)后8周、12周兩個時間段，每個時間段每組各10只。

1.2 動物模型建立和干預(yù)方法

骨質(zhì)疏松模型建立[8]和鑒定：B、C、D、E組大鼠在無菌狀態(tài)下行雙側(cè)卵巢切除術(shù)：大鼠腹腔內(nèi)注射40mg/kg戊巴比妥鈉，麻醉生效后，俯臥位固定在動物手術(shù)操作臺上。背部雙側(cè)季肋區(qū)剃毛，碘酒、酒精消毒后，取后背正中縱行切口長約1.5cm，分離軟組織及肌層尋找卵巢，其標(biāo)志是卵巢周圍的脂肪組織，顯露并結(jié)扎、切除卵巢。逐層縫合至皮膚，同法處理對側(cè)卵巢。為了鑒定模型制備是否成功，在卵巢切除術(shù)時切取的組織進(jìn)行HE染色光鏡觀察鑒定分析。動物飼養(yǎng)條件符合國家級衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，自然光照周期，自由進(jìn)食水。室溫17℃～21℃，12～12h間隔照明，定期紫外線消毒與排風(fēng)。Sham組除未行結(jié)扎切除卵巢外，其它步驟同OVX組。干預(yù)方法：確認(rèn)模型建立成功后給藥途徑阿司匹林、生理鹽水為灌胃，褪黑素為靜脈注射。藥物治療組劑量分別為C組：單純阿司匹林8.93mg/(kg·d)，D組：單純褪黑素10mg/(kg·d)，E組：阿司匹林 8.93mg/(kg·d)+褪黑素10mg/(kg·d)，每天灌胃1次，OVX及Sham組每天予等量生理理鹽水灌胃，藥物干預(yù)至動物處死。

1.3 檢查指標(biāo)及檢驗(yàn)方法

1.3.1 骨代謝指標(biāo)檢測

進(jìn)行大鼠腹主動脈抽血收集血標(biāo)本，血清骨轉(zhuǎn)化標(biāo)志物檢測均是采用酶聯(lián)免疫法，指標(biāo)包括I型膠原C端交聯(lián)肽(C-terminal cross-linked telopeptides of type I collagen，CTX)和骨鈣素(osteocalcin，OC)。檢測前所有的大鼠均采用2%戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，麻醉方式是通過腹腔注射，麻醉后進(jìn)行心臟穿刺然后采集6～8mL血液，然后靜置1h后，離心獲得上清，離心條件為：溫度4℃，轉(zhuǎn)速3000rpm，時間為10min，將血清放置在-80℃冰箱中進(jìn)行保存，統(tǒng)一檢測。

1.3.2 骨密度檢測

切取大鼠腰椎標(biāo)本，將肌肉、韌帶等非骨質(zhì)部分刮除干凈后，以生理鹽水紗布圍裹、密封，保存于-20℃冰柜中。用雙能X線吸收骨密度測量儀(DXA)測量第三腰椎骨密度。

1.3.3 骨生物力學(xué)測試

標(biāo)本處理：麻醉下將大鼠處死，右脛骨取材以生理鹽水紗布圍裹，封存于-20℃冰柜內(nèi)。采用三點(diǎn)彎曲力學(xué)測試，獲取脛骨近端骨的最大彎曲應(yīng)力(F max N)。

1.3.4 骨結(jié)構(gòu)檢測

左側(cè)脛骨標(biāo)本進(jìn)行Micro-CT分析骨微細(xì)結(jié)構(gòu)：大鼠麻醉處死后，取大鼠左側(cè)脛骨，用濃度為80%的酒精固定。調(diào)節(jié)Micro-CT至大鼠脛骨標(biāo)本近端骺板下2mm和遠(yuǎn)端2mm之間感興趣區(qū)域的松質(zhì)骨進(jìn)行掃描。獲得斷層掃描圖像后，進(jìn)行三維重建，注意把骨皮質(zhì)影像去除，然后采用軟件進(jìn)行自動定量分析。獲得并記錄骨小梁數(shù)量(trabecular number，Tb.N)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)、骨小梁間隔(trabecular separation/spacing，Tb.Sp)、結(jié)構(gòu)模型指數(shù)(structure model Index，SMI)、連接密度(connective density，Conn.D.)、相對骨體積(BV/TV)各參數(shù)數(shù)值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 21.0軟件統(tǒng)計分析所得數(shù)據(jù)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差記錄計量資料，應(yīng)用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩獨(dú)立樣本統(tǒng)計比較，應(yīng)用單向方差分析(One-way ANOVA)進(jìn)行多組間獨(dú)立樣本統(tǒng)計比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 骨代謝指標(biāo)檢測

與Sham組比較，OVX組里在本實(shí)驗(yàn)不同時間點(diǎn)OC減低、CTX指標(biāo)顯著性提高；OVXa、OVXm、OVXam組的OC較OVX逐漸升高，每組組內(nèi)術(shù)后12周又比術(shù)后8周有所升高，OC指標(biāo)OVX、OVXa、OVXm、OVXam各組逐漸增高，有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。OVXa、OVXm、OVXam組的CTX較OVX逐漸降低，每組組內(nèi)術(shù)后12周又比術(shù)后8周有所降低，OVX、OVXa、OVXm、OVXam各組逐漸減低，有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。見表1。

表1 不同組骨代謝指標(biāo)比較

2.2 骨密度檢測

術(shù)后8周及術(shù)后12周，5組之間兩兩均有差異，骨密度均OVX

表2 不同組術(shù)后8周及術(shù)后12周骨密度檢測

2.3 骨的生物力學(xué)檢測

術(shù)后8周及術(shù)后12周，5組之間兩兩均有差異，均OVX

表3 不同組術(shù)后8周及術(shù)后12周骨的生物力學(xué)檢測

2.4 骨結(jié)構(gòu)檢測

術(shù)后12周后，5組骨結(jié)構(gòu)各項(xiàng)指標(biāo)均為OVX

表4 術(shù)后12周不同組骨結(jié)構(gòu)檢測

3 討 論

骨質(zhì)疏松作為一種嚴(yán)重威脅人類生命健康的疾病，發(fā)病率逐年增加，且骨質(zhì)疏松癥還會引起骨折。在我國，老年女性占絕大部分，且更年期后，女性骨量流失出現(xiàn)加快。加之雌激素降低、生長因子減少、糖尿病、甲亢、濫用激素類藥物等均會引起骨質(zhì)疏松，因此，預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松尤為重要[9-11]。

國外學(xué)者[12]研究顯示每天服用300mg的阿司匹林，12個月后采用CT檢查顯示骨密度較治療前明顯提高，且其研究認(rèn)為長期規(guī)律性服用阿司匹林可以明顯改善婦女骨密度。褪黑素作為松果體分泌的吲哚類激素，在機(jī)體生理過程中扮演著重要角色，譬如增加免疫力、清除自由基、抗炎和抗衰老等。目前臨床多采用阿司匹林治療骨質(zhì)疏松，但單一用藥對患者的改善有限，因此，本研究考慮聯(lián)合用藥，觀察聯(lián)合用藥在骨質(zhì)疏松癥中的治療效果，結(jié)果顯示骨代謝指標(biāo)與Sham組比較，OVX組里在本實(shí)驗(yàn)不同時間點(diǎn)OC減低、CTX指標(biāo)顯著性提高；OVXa、OVXm、OVXam組的OC較OVX組逐漸高，每組組內(nèi)術(shù)后12周又比術(shù)后8周有所升高，OC指標(biāo)OVX、OVXa、OVXm、OVXam各組逐漸增高，有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。OVXa、OVXm、OVXam組的CTX較OVX組逐漸降低，每組組內(nèi)術(shù)后12周又比術(shù)后8周有所降低，OVX、OVXa、OVXm、OVXam各組逐漸減低，有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。骨密度及骨的生物力學(xué)檢測結(jié)果顯示術(shù)后8周及術(shù)后12周，5組之間兩兩均有差異，均OVX

綜上所述，阿司匹林和褪黑素聯(lián)合應(yīng)用治療骨質(zhì)疏松癥，可以明顯改善骨代謝、骨密度、骨的生物力學(xué)和骨結(jié)構(gòu)指標(biāo)。