丁酸鈉對1型糖尿病模型小鼠血糖、血清胰島素水平和腸道菌群的影響*

徐海軍，李 丹，王 磊，平東萍，爨淑楠，蔣 平，佘德勇

(1.皖西學院生物與制藥工程學院，安徽 六安 237012；2.安徽省中藥資源保護與持續(xù)利用工程實驗室)

糖尿病是一種胰島素分泌缺陷(1型糖尿病)或胰島素作用障礙(2型糖尿病)所致的、以高血糖為特征的代謝性疾病。1型糖尿病是一種先天家族遺傳的自體免疫性疾病，其特征是T細胞介導的分泌胰島素的胰島β-細胞破壞，導致高血糖，患者需要終生胰島素治療。1型糖尿病多發(fā)于兒童和青少年，治療不當或不及時極易引起并發(fā)癥，嚴重時可導致患者死亡[1]。

糖尿病的治療方法目前主要依靠藥物治療，同時配合飲食治療和運動治療。Zhao等[2]研究發(fā)現通過提供豐富多樣的膳食纖維，可以使人體腸道內特定有益菌群升高，進而改善2型糖尿病的臨床癥狀。該研究鑒定出來自3個門的15株產丁酸菌與2型糖尿病的改善密切相關[2]。另有研究表明1型糖尿病患者糞便中產丁酸菌數量減少[3]。已有大量研究表明日糧中添加丁酸鈉可以改善動物的腸道菌群結構[4-6]。因此，本項目研究了在日糧中添加丁酸鈉對1型糖尿病模型小鼠血糖、血清胰島素水平和腸道菌群的影響，以評估該方法對1型糖尿病的治療效果及可能機理。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

昆明種雄性小鼠，體質量18～22g，由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供，實驗動物合格證號：皖醫(yī)實動準第01號。小鼠飼養(yǎng)在23℃有空調的房內，自然光照，自由采食和飲水。

1.2 藥品與試劑

鏈脲佐菌素(上海麥克林生化科技有限公司)；丁酸鈉(純度99%)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；BBL瓊脂培養(yǎng)基(青島海博生物技術有限公司)；疊氮鈉—結晶紫—七葉苷瓊脂(北京華威銳科化工有限公司)；胰月示—亞硫酸鹽—環(huán)絲氨酸瓊脂基礎和環(huán)絲氨酸、MRS瓊脂(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)；小鼠胰島素ELISA試劑盒(北京安迪華泰科技有限公司)、醫(yī)用血糖測試紙(三諾生物傳感股份有限公司)。

1.3 主要儀器

三諾血糖測試儀(三諾生物傳感股份有限公司)；FA1204 B型電子分析天平(上海越平科學儀器有限公司)；JW-3021HR型高速臺式冷凍離心機(安徽嘉文儀器裝備有限公司)；立式壓力蒸汽滅菌器(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)；DGT-G250型電熱恒溫鼓風干燥箱、SPT-P250C型智能生化培養(yǎng)箱(合肥華德利科學器材有限公司)；SW-CJ-2D型雙人單面凈化工作臺(蘇州凈化設備有限公司)；Synergy H1多功能酶標儀(美國伯騰儀器有限公司)；XK-97A型菌落計數器(杭州齊威儀器有限公司)。

1.4 分組與給藥

參照文獻[7]方法，造模前將小鼠禁食12h，然后腹腔注射200mg/kg鏈脲佐菌素[鏈脲佐菌素溶解在預冷的0.1mol/L檸檬酸鈉緩沖液(pH4.2～4.5)中，配制成2%溶液，經0.22μm濾菌器過濾除菌，避光保存，現配現用，在30min內注射完畢]。注射后小鼠自由攝食及飲水，期間觀察造模小鼠的飲水量、攝食量、排尿量等情況。5d后，小鼠尾靜脈采血并使用血糖儀檢測空腹血糖濃度，血糖濃度大于11.1mmol/dL的小鼠認定為糖尿病造模成功。將造模成功的20只小鼠隨機分為糖尿病模型組和糖尿病模型+丁酸鈉組，每組10只。另設同批購買的10只小鼠為正常對照組。對照組、糖尿病模型組小鼠飼喂正常小鼠日糧。糖尿病模型+丁酸鈉組小鼠在日糧中添加3%丁酸鈉。實驗持續(xù)7周。

1.5 指標測定

1.5.1 血糖和胰島素水平測定

實驗結束時小鼠禁食12h后摘除眼球法采血。采出的全血立即用醫(yī)用血糖測試紙和三諾血糖測試儀測定血糖水平。其余全血凝固析出血清后，3 000r/min離心5min分離血清，置于-70℃冰箱中保存，用小鼠胰島素ELISA試劑盒測定胰島素含量。

1.5.2 盲腸內容物中腸桿菌、腸球菌、產氣莢膜梭菌、雙歧桿菌和乳酸菌數量測定

采完血后頸椎脫臼處死小鼠，剖開腹腔，無菌采集盲腸內容物用于培養(yǎng)腸道細菌。腸道細菌培養(yǎng)計數的具體操作：無菌取盲腸內容物0.1g，加入0.9mL無菌生理鹽水，用移液器吸吹混勻后用無菌生理鹽水連續(xù)10倍稀釋至10-9。每次稀釋不同濃度時更換吸頭，稀釋時吸頭不要碰到試管及試管內的液體。分別選擇合適的稀釋度對腸桿菌、腸球菌、產氣莢膜梭菌、雙歧桿菌和乳酸菌用各自的選擇性培養(yǎng)基(分別為伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基、疊氮鈉—結晶紫—七葉苷瓊脂、胰月示—亞硫酸鹽—環(huán)絲氨酸瓊脂培養(yǎng)基、BBL瓊脂培養(yǎng)基和MRS培養(yǎng)基)進行培養(yǎng)計數。其中雙歧桿菌和產氣莢膜梭菌采用平板夾心法厭氧培養(yǎng)[8]，其它細菌采用需氧培養(yǎng)。腸桿菌和產氣莢膜梭菌37℃培養(yǎng)24h，其他菌37℃培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結束后用細菌計數器進行細菌計數，最終以每克盲腸內容物中細菌個數的對數 lg(CFU/g) 表示。

1.6 統計學方法

用DPS數據處理系統對所測數據進行單因素方差分析，并用Ducan's進行多重比較。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 丁酸鈉對1型糖尿病模型小鼠血糖和血清胰島素水平的影響

各組血糖和血清胰島素水平測定結果見圖1。從圖1可見，與對照組相比，糖尿病模型組小鼠的血糖水平極顯著升高(P<0.01)，血清胰島素水平極顯著低于對照組(P<0.01)，說明模型制作和維持成功。糖尿病模型+丁酸鈉組血糖水平極顯著高于對照組(P<0.01)，胰島素水平顯著降低低于對照組(P<0.05)，但血糖水平極顯著低于糖尿病模型組(P<0.01)，血清胰島素水平極顯著高于糖尿病模型組(P<0.01)。說明日糧中添加丁酸鈉對治療糖尿病有一定作用，但尚不能完全恢復到正常狀態(tài)。

2.2 丁酸鈉對糖尿病模型小鼠盲腸內容物腸桿菌、腸球菌、產氣莢膜梭菌、雙歧桿菌和乳酸菌數量的影響

從圖2可見，糖尿病模型組雙歧桿菌和乳酸菌數量均顯著低于對照組(P<0.05)，腸桿菌和腸球菌數量極顯著高于對照組(P<0.01)，產氣莢膜梭菌數量顯著高于對照組(P<0.05)。說明糖尿病模型小鼠腸道菌群組成發(fā)生了異常，有益菌數量減少，有害菌數量增加。與模型組相比，丁酸鈉能顯著增加盲腸中乳酸菌(P<0.05)、雙歧桿菌數量(P<0.05)，降低盲腸中腸桿菌(P<0.01)、產氣莢膜梭菌數量(P<0.05)，對盲腸中腸球菌有降低趨勢(P>0.05)。說明丁酸鈉對糖尿病模型小鼠的腸道菌群組成有一定的恢復作用，但同樣未能恢復到正常狀態(tài)。

A：腸桿菌 B：腸球菌 C：產氣莢膜梭菌 D：雙歧桿菌 E：乳酸菌

3 討 論

研究表明一次性大劑量注射或連續(xù)多次小劑量注射鏈脲佐菌素時，由于鏈脲佐菌素直接引起胰島β細胞的廣泛破壞，可造成1型糖尿病動物模型[9]；而注射較少量鏈脲佐菌素，同時在造模前就開始給予高熱量飼料喂養(yǎng)，可誘導出2型糖尿病動物模型[10]。本研究采用大劑量一次性腹腔注射鏈脲佐菌素，采用常規(guī)日糧飼喂，因此制備的模型屬于1型糖尿病模型。從實驗結果看，模型組小鼠血糖顯著升高，胰島素水平顯著降低，并且表現出多飲多尿的臨床癥狀，符合1型糖尿病的特點，說明模型制備非常成功。

雖然目前普遍認為1 型糖尿病是一種多基因遺傳缺陷相關的代謝紊亂疾病，但有研究表明同卵雙胞胎共同患病的機率只有約 50%[11]，說明有已知的和未知的環(huán)境因素對該病的觸發(fā)起重要作用。不良飲食習慣可能是觸發(fā)糖尿病發(fā)生的重要環(huán)境因素之一。而腸道菌群可能是連接飲食觸發(fā)糖尿病的橋梁。飲食對腸道菌群組成有非常強烈的影響。腸道菌群不僅影響機體的能量代謝，也影響機體的免疫系統特別是腸道免疫系統的發(fā)育和成熟[12-13]。近年來的研究發(fā)現，腸道菌群紊亂可能通過改變腸壁通透性及機體免疫功能參與了1型糖尿病的發(fā)展進程[14]。關于1型糖尿病時腸道菌群的變化，目前報道尚不一致。Murri等[15]采用PCR-DGGE和熒光定量PCR法發(fā)現在屬水平上，1型糖尿病兒童中梭菌屬、擬桿菌屬和韋榮球菌屬的數量顯著增加，乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、Blautia coccoides/Eubacterium rectale 和普雷沃氏菌屬的數量顯著降低。齊翠娟[16]通過對糞便細菌16S rDNA V3-V4區(qū)擴增和高通量測序，發(fā)現1型糖尿病兒童腸道菌群中在屬水平上，嗜血桿菌屬、毛螺菌屬、小類桿菌屬和氨基酸球菌屬、Defluviitaleaceae科下的未分類屬的豐度顯著降低，而Blautia屬的豐度顯著升高。徐靈筠[17]用糞便細菌16S rDNA V3區(qū)-DGGE法研究了健康小鼠、鏈脲佐菌素致1型糖尿病模型小鼠和模型未成功小鼠腸道菌群的區(qū)別，發(fā)現羅伊氏乳桿菌和腸乳桿菌的數量下降與發(fā)生糖尿病有關。任曉燕[18]采用熒光定量PCR法比較1型糖尿病兒童和健康兒童糞便中5個菌屬(大腸桿菌屬、腸球菌屬、乳桿菌屬、擬桿菌屬、雙歧桿菌屬)的差異，發(fā)現1型糖尿病兒童雙歧桿菌屬數量顯著減少；大腸桿菌屬、腸球菌屬、乳桿菌屬、擬桿菌屬的數量沒有顯著變化。朱華等[19]給大鼠連續(xù)5d腹腔注射鏈脲佐菌素[劑量為30mg/(kg·BW)]制備1型糖尿病模型，通過糞便細菌16S rDNA-V3區(qū)測序技術，發(fā)現造模4周時，模型組乳桿菌屬相對豐度顯著降低、擬桿菌屬相對豐度顯著增高；造模12周，模型組乳桿菌屬、瘤胃球菌屬、擬桿菌屬相對豐度顯著增高，雙歧桿菌屬相對豐度顯著降低。本研究發(fā)現糖尿病模型組雙歧桿菌和乳酸菌數量均顯著低于對照組，腸桿菌和腸球菌數量極顯著高于對照組，產氣莢膜梭菌數量顯著高于對照組。上述這些差異可能與采用的實驗對象、研究方法不同有關。但比較一致的結果是多數研究表明1型糖尿病發(fā)病后會降低腸道中有益菌(如乳桿菌和雙歧桿菌)的數量。

雖然1型糖尿病 患者顯示腸道微生態(tài)失衡，但目前還不清楚這是觸發(fā)1型糖尿病的原因還是1型糖尿病所導致的結果[20]。本研究中，采用腹腔注射鏈脲佐菌素破壞胰島快速引起糖尿病，與自然發(fā)病過程慢慢發(fā)展而成的糖尿病相比，其對腸道菌群的影響可能會存在一些差異。雖然在自然發(fā)生的糖尿病和藥物引起的糖尿病中，糖尿病與腸道菌群之間的因果關系可能存在差異，但在兩種不同因素導致的糖尿病發(fā)展一段時間后，兩者的腸道菌群組成可能會出現趨同。這是因為糖尿病也會對腸道菌群產生影響。一方面，糖尿病患者飲食量增加，從而通過增加營養(yǎng)物質攝入量影響腸道菌群的組成；另一方面，糖尿病時的高血糖會降低腸上皮細胞的胞外谷胱苷肽水平，上調一氧化氮合成酶的表達水平，導致腸道環(huán)境的氧化應激水平上升，這將會給腸道菌群的定植產生壓力，導致乳桿菌數量顯著減少[17]。

丁酸是腸粘膜上皮細胞的首要能量來源，是維持腸道內環(huán)境穩(wěn)定、調節(jié)基因表達及調節(jié)腸道炎癥反應的主要成分[21]。表達轉錄因子Foxp3的調節(jié)性T細胞(regulatory T cell，Treg細胞)在限制腸道炎癥反應中起關鍵作用[22]。丁酸能調節(jié)結腸Treg細胞池的大小和功能，從而減輕腸道炎癥[23]。丁酸鈉可以預防和治療飲食誘導的小鼠胰島素抵抗(即2型糖尿病)，其機制與促進能量消耗和改善線粒體功能有關[24]。Tian等[25]研究發(fā)現飼料中添加丁酸鈉可以使草魚腸道內大腸桿菌數量明顯下降，而乳酸桿菌數量顯著增加，從而改善了腸道菌群組成。本研究也發(fā)現添加丁酸鈉可以增加1型糖尿病模型小鼠腸道乳酸菌和雙歧桿菌數量，減少有害菌數量。有較多研究表明服用短乳桿菌、乳酸菌、雙歧桿菌等益生菌可以改善1型糖尿病[26]。說明通過日糧添加丁酸鈉可以彌補1型糖尿病模型腸道中產丁酸菌減少的不良后果，并通過改善腸道菌群結構和降低腸道炎癥反應等途徑緩解1型糖尿病的病情。

4 結 論

鏈脲佐菌素誘導的1型糖尿病模型小鼠腸道菌群組成會發(fā)生紊亂，表現為有益菌數量減少，有害菌數量增多。丁酸鈉對1型糖尿病有一定的治療作用，其機制是否與改善腸道菌群組成有關需要進一步研究。今后有必要對丁酸鈉的適宜劑量、包被后的使用效果進行研究，以便為將其用于1型糖尿病患者的輔助治療和保健提供實驗依據。