基于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK-ATF4-CHOP信號(hào)通路探討白藜蘆醇對(duì)AD大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響①

李 彪 臺(tái) 勇 遲正鎖 許 超

(武漢市精神衛(wèi)生中心精神科，武漢430030)

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一種發(fā)病率高、危害性大的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，高發(fā)于老年群體，尚無(wú)有效方法[1,2]。AD病理特征為大腦皮層和海馬區(qū)β淀粉樣蛋白(Aβ)聚集形成老年斑、Tau蛋白異常聚集形成神經(jīng)纖維纏結(jié)以及大腦皮層和海馬區(qū)神經(jīng)元缺失，病理機(jī)制復(fù)雜[3-5]。受年齡、基因及環(huán)境等因素影響，AD神經(jīng)元中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)錯(cuò)誤折疊導(dǎo)致蛋白質(zhì)增多、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失衡，進(jìn)而誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，在AD病理形成以及神經(jīng)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[6]。白藜蘆醇(resveratrol，RESV)是從葡萄屬、花生屬、藜蘆屬等植物中提取的天然活性成分，具有強(qiáng)大的抗氧化及抗炎作用，可促進(jìn)Aβ水解，抑制Aβ形成和聚集，發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)、心臟及抗衰老作用，被稱為神經(jīng)保護(hù)劑[7]。本研究探討RESV基于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like ER kinase，PERK)-轉(zhuǎn)錄活化因子4(activating transcription factor 4，ATF4)-C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)信號(hào)通路對(duì)AD大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響，以期為AD早期預(yù)防與診治提供新的分子靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，24月齡，體質(zhì)量180～220 g，喂養(yǎng)于(22±2)℃、相對(duì)濕度(55±5)%，12 h光照和12 h暗處理，自由攝食飲水。

1.1.2試劑與儀器 RESV(湖南洪江華光生物有限公司)；一抗、抗鼠IgG辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記抗體(美國(guó)CST公司)；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)；免疫組化試劑盒(廣州鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(廣州吉迪儀器有限公司)；Bio-Rad電泳儀、成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1建模與分組 健康大鼠雙側(cè)海馬區(qū)注射Aβ1～40，構(gòu)建AD大鼠模型，隨機(jī)分為AD模型組、RESV低劑量組、RESV中劑量組、RESV高劑量組，分別腹腔注射RESV(10、20、40 mg/kg)，另設(shè)假手術(shù)組，每組10只。

1.2.2免疫法組化檢測(cè)Aβ1～40細(xì)胞表達(dá) 取各組大鼠腦海馬組織進(jìn)行石蠟包埋切片，常規(guī)脫臘水化，0.3% H2O2室溫孵育35 min，PBS清洗5 min，滴加血清封閉40 min，加入PERK、ATF4、CHOP抗體4℃孵育過(guò)夜，次日于37℃放置30 min，PBS漂洗3次，每次5 min，甩干水分，滴加二抗，37℃孵育 35 min，PBS洗去二抗，滴加SP復(fù)合物，37℃孵育35 min，PBS漂洗3次，每次5 min，顯色劑顯色，脫水至透明，中性樹(shù)膠封片。

1.2.3原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)法(TUNEL)檢測(cè)海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡水平 取各組大鼠腦海馬組織切片脫臘脫水，PBS漂洗，加入0.3% H2O237℃孵育40 min，PBS漂洗，加入蛋白酶K孵育10 min，PBS漂洗。將TUNEL混合物置于切片，37℃孵育 60 min，PBS漂洗，添加轉(zhuǎn)化劑POD，37℃孵育30 min，漂洗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水至透明，封片。圖像分析系統(tǒng)分析病理圖片，在400倍光鏡視野下，隨機(jī)選取2個(gè)視野，凋亡細(xì)胞核染成棕黃色，正常細(xì)胞染成藍(lán)色，陽(yáng)性表達(dá)率=陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)/核染數(shù)目×100%。

1.2.4Western blot檢測(cè)Caspase-3、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78 kD，GRP78)、PERK、ATF4、CHOP蛋白表達(dá) 取各組大鼠腦海馬組織100 mg 提取蛋白，沖洗后破碎，置于干冰上加入裂解液，12 000 r/min、4℃離心20 min，取上清，測(cè)定蛋白濃度，-80℃保存?zhèn)溆谩?0 μg/孔，電泳，一抗、二抗孵育，電子凝膠成像系統(tǒng)顯影、拍照，Image J軟件進(jìn)行蛋白條帶定量分析，以β-actin為內(nèi)參，以目的蛋白灰度值/β-actin蛋白灰度值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠腦組織免疫組化情況 免疫組化結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)完整、結(jié)構(gòu)清晰、數(shù)量較多，基本無(wú)Aβ1～40陽(yáng)性表達(dá)，與假手術(shù)組相比，AD模型組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞有明顯老年斑形成，Aβ1～40陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞顯著增多(P<0.05)；與AD模型組相比，RESV低、中、高劑量組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞Aβ1～40陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞顯著減少(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠腦組織免疫組化染色情況(×400)

圖2 各組大鼠腦組織TUNEL染色情況(×400)

圖3 各組大鼠腦組織中Caspase-3蛋白表達(dá)水平比較Fig.3 Comparison of Caspase-3 protein expression level in cerebral tissue of rats in each groupNote:Compared with sham group，**.P<0.01；compared with AD model group，#.P<0.05.

圖4 各組大鼠腦組織GPR78、PERK、ATF4、CHOP蛋白表達(dá)水平Fig.4 Protein expression levels of GPR78,PERK,ATF4 and CHOP in cerebral tissue of rats in each groupNote:1.Sham group；2.AD model group；3.RESV low-dose group；4.RESV medium-dose group；5.RESV high-dose group.Compared with sham group，**.P<0.01；compared with AD model group，#.P<0.05.

2.2各組大鼠腦組織TUNEL染色情況 TUNEL染色結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，AD模型組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞可見(jiàn)大量棕黃色顆粒，凋亡率顯著升高(P<0.05)；與AD模型組相比，RESV低、中、高劑量組大鼠海馬細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

2.3各組大鼠腦組織中Caspase-3蛋白表達(dá)水平比較 Western blot結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，AD模型組大鼠腦組織中Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與AD模型組相比，RESV低、中、高劑量組Caspase-3蛋白表達(dá)水平不同程度降低(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

2.4各組大鼠腦組織GPR78、PERK、ATF4、CHOP蛋白表達(dá)水平 Western blot結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，AD模型組大鼠腦組織中GPR78、PERK、ATF4、CHOP蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與AD模型組相比，RESV低、中、高劑量組GPR78、PERK、ATF4、CHOP蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

3 討論

AD是由多種原因?qū)е碌哪X組織損傷，主要表現(xiàn)為進(jìn)行性認(rèn)知障礙及記憶力減退，世界范圍內(nèi)AD發(fā)病人數(shù)高達(dá)4 600萬(wàn)，我國(guó)AD患病人數(shù)位居世界第一，嚴(yán)重增加家庭及國(guó)家經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[8-10]。目前認(rèn)為AD病理機(jī)制主要包括蛋白質(zhì)的折疊與聚集、金屬離子穩(wěn)態(tài)失衡、線粒體損傷、ERS及神經(jīng)炎癥等，且各病理因素聯(lián)系密切，因此闡明AD病理分子機(jī)制對(duì)開(kāi)發(fā)更有效的治療藥物具有重要意義[11,12]。目前AD治療方式只能延緩疾病發(fā)展進(jìn)程，并不能完全根治，一線治療藥物療效尚未取得突破性進(jìn)展，因此中藥延緩AD的作用及機(jī)制研究備受關(guān)注[13]。RESV是廣泛存在于葡萄屬、花生屬、藜蘆屬、藜屬等植物中的天然非黃酮類多酚化合物，具有抗氧化、抑制血小板聚集、抗炎等生理藥理作用[14]。研究表明，適當(dāng)飲用含有RESV的紅酒可降低AD及心血管疾病發(fā)病率，因此推測(cè)RESV具有神經(jīng)保護(hù)作用[15]。既往研究顯示，RESV可通過(guò)抗Aβ毒性作用、類雌激素作用、神經(jīng)元保護(hù)作用及抗氧化應(yīng)激作用等途徑治療AD[13]。

本研究顯示，假手術(shù)組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞基本無(wú)Aβ1～40陽(yáng)性表達(dá)，而AD模型組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞老年斑明顯，Aβ1～40陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞顯著增多；但與AD模型組相比，RESV各劑量組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞Aβ1～40陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞顯著減少，表明RESV可顯著降低AD大鼠腦內(nèi)Aβ1～40沉積，參與神經(jīng)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，保護(hù)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和完整性。TUNEL染色與Western blot結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，AD模型組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞可見(jiàn)大量棕黃色顆粒，凋亡率、Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高；與AD模型組相比，RESV各劑量組大鼠海馬細(xì)胞凋亡率、Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著降低，表明RESV可通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡，保護(hù)AD大鼠腦神經(jīng)受損，與閆雯等[16]研究結(jié)論一致。Caspase-3是參與哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵蛋白酶，機(jī)體細(xì)胞凋亡將導(dǎo)致Caspase-3活化、裂解，活化的Caspase-3進(jìn)一步導(dǎo)致蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)放大，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[17]。因此，本研究對(duì)RESV通過(guò)何種途徑參與AD大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡的機(jī)制進(jìn)行了進(jìn)一步探討。

ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可促發(fā)糖尿病、AD等多種疾病[18,19]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白質(zhì)修飾、折疊的重要場(chǎng)所，可調(diào)節(jié)細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)受多種因素影響，將會(huì)啟動(dòng)神經(jīng)元ERS，使未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)增加，激活細(xì)胞作出適應(yīng)性應(yīng)答反應(yīng)，引起凋亡信號(hào)分子表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[20]。PERK、抑制物阻抗性脂酶(IRE)1α、轉(zhuǎn)錄活化因子6(ATF6)是參與細(xì)胞適應(yīng)性應(yīng)答反應(yīng)的3種關(guān)鍵受體，正常狀態(tài)下，PERK、IRE1α、ATF6與GRP78結(jié)合，處于無(wú)活性狀態(tài)，ERS發(fā)生時(shí)，PERK、IRE1α、ATF6及GRP78解離并激活，活化的PERK可提高5′端閱讀框翻譯效率，上調(diào)ATF4表達(dá)，ATF4入核后進(jìn)一步上調(diào)CHOP表達(dá)，最終激活下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[21,22]。研究表明，AD患者大腦內(nèi)GRP78水平顯著升高，并與患者Braak分期呈正相關(guān)，PERK、IRE1α、ATF6等水平明顯升高，持續(xù)性ERS可促進(jìn)神經(jīng)元凋亡，損害認(rèn)知及記憶能力[23]。本研究顯示，與假手術(shù)組相比，AD模型組大鼠腦組織中GPR78、PERK、ATF4、CHOP蛋白表達(dá)水平顯著升高，與AD模型組相比，RESV各劑量組GPR78、PERK、ATF4、CHOP蛋白表達(dá)水平均降低，表明RESV可能通過(guò)下調(diào)GPR78、PERK、ATF4、CHOP表達(dá)介導(dǎo)的凋亡通路，減輕ERS對(duì)AD大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞的損傷，進(jìn)而發(fā)揮腦神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用。與史為博等[24]結(jié)論一致。

綜上所述，RESV可有效清除AD大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞Aβ1～40沉積，抑制海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡，下調(diào)凋亡關(guān)鍵蛋白Caspase-3表達(dá)，其可能機(jī)制為RESV通過(guò)參與ERS PERK-ATF4-CHOP信號(hào)通路，抑制其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而保護(hù)海馬神經(jīng)元，為進(jìn)一步研究AD可能的分子治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。