新藤黃酸體外抗肺癌血管生成的作用機(jī)制研究

朱亞芳

（河北中石油中心醫(yī)院，河北 廊坊）

0 引言

據(jù)資料顯示，癌癥已經(jīng)成為了威脅人類生命健康的主要疾病之一，其具有發(fā)病隱蔽、轉(zhuǎn)移性高、復(fù)發(fā)率高、腫瘤細(xì)胞耐藥強(qiáng)等特點(diǎn)，導(dǎo)致臨床治療困難[1-3]。為了有效的控制疾病的發(fā)展，提高患者的生活質(zhì)量與生存率，急需一種有效的抗腫瘤藥物。據(jù)資料顯示，新藤黃酸對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的增殖具有有效的抑制作用，能明顯控制患者病情的發(fā)展，提高其生活質(zhì)量和生存率[4-8]。本研究就是為了分析觀察新藤黃酸對(duì)肺癌血管生成的影響以及初步的作用機(jī)制，具體結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料：選用中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）和人肺腺癌細(xì)胞A549，以及上海源葉生物有限公司的新藤黃酸。

檢測(cè)材料：胎牛血清，DMEM高糖培養(yǎng)基，Matrigel，胰蛋白酶，DAPI，An-NexinV-FITC/PI雙 染 法 試 劑 盒，LY294002，Akt、β-actin抗體，PI3K、p-PI3K、p-Akt、VEGF，PI3K、Akt、β-actin引物，PTENsiRNA序列（上游 5’-GGCUAAGUGAAGAUGACAATT-3’和 下 游 5’-UUGU-CAUCUUCACUUAGCCTT-3’），Lipofectamine 2000TM。

儀器材料：生物安全柜、高壓滅菌鍋、高速立式冷凍離心機(jī)、倒置熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀。

1.2 方法

1.2.1 新藤黃酸對(duì)HUVEC血管成管的影響

選用24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，在使用前先放置4℃溫度下預(yù)冷，接著將液體狀態(tài)的Matrigel膠注入各孔，按照300μL/孔的規(guī)格，然后將培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min。最后將HU-VEC接種于用Matrigel膠覆蓋的細(xì)胞培養(yǎng)板，按照8×104個(gè)/孔的規(guī)格，并依次加入不同濃度的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)（37℃，5%CO2）。通過倒置顯微鏡于培養(yǎng)18h后對(duì)其的管狀結(jié)構(gòu)的形態(tài)進(jìn)行觀察記錄[9-10]。

1.2.2 新藤黃酸對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響

①將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC接種于6孔板中，按照1×105個(gè)/孔的規(guī)格。先對(duì)其進(jìn)行孵育培養(yǎng)，然后將舊培養(yǎng)液換成含1，2，4μmol·L-1GNA的條件培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h。接著采用不含EDTA-Na2的細(xì)胞消化液進(jìn)行消化離心處理，并收集處理后的細(xì)胞。②對(duì)收集到的細(xì)胞使用4℃預(yù)冷的PBS緩沖液進(jìn)行沖洗（2遍，1800r·min-1離心5min）。然后加入400μL的PBS重懸細(xì)胞、5μL的AnnexinV-FITC，并使用吹打管吹打均勻，避光培養(yǎng)15min后，再加入5μL的PI進(jìn)行充分混合，避光培養(yǎng)5min后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.3 新藤黃酸對(duì)蛋白表達(dá)的影響[11]

①將各組細(xì)胞消化收集后的細(xì)胞，使用PBS（4℃）進(jìn)行洗滌2次，然后加入PMSF的RIPA細(xì)胞裂解液并置于冰上孵育10min，接著采用高速立式冷凍離心機(jī)進(jìn)行離心分離（12000r·min-1）5min后收集上層澄清液于EP管中，最后加入LoadingBuffer后于100℃下煮10min，置于4℃下保存。②采用蛋白定量試劑盒和ECL試劑盒嚴(yán)格根據(jù)說明書對(duì)其進(jìn)行操作。

1.2.4 PTEN-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，新藤黃酸對(duì)PI3K，Akt基因的表達(dá)水平的影響

①在6孔板中接種細(xì)胞，按照1×106/孔的規(guī)格，然后加入不含抗生素的培養(yǎng)基1.8mL。從每孔中取出2μL的50μmol/LPTEN-siRNA儲(chǔ)液，并將其溶于Opti-MEMIReducedSerumMedium中進(jìn)行稀釋混合。②根據(jù)Lipofectamine2000TM5μL/孔、Op-ti-MEMI ReducedSerumMedium100μL/孔的規(guī)格進(jìn)行稀釋混合，并放置于常溫下保存5min。③將兩組進(jìn)行混合，并放置于常溫下保存20min，然后除去舊培養(yǎng)基并使用不含血清培養(yǎng)基洗滌2次，并給每孔換上新鮮培養(yǎng)基1.8mL后，加入轉(zhuǎn)染試劑，并于輕輕搖勻后繼續(xù)培養(yǎng)6h。④采用流式細(xì)胞儀和biocaptMV軟件，嚴(yán)格參照說明書對(duì)轉(zhuǎn)染效率和mRNA的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 20.0軟件做統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果分析。

2 結(jié)果

2.1 新藤黃酸對(duì)HUVEC血管成管的影響

倒置顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，新藤黃酸能使得HUVEC細(xì)胞形態(tài)變成梭狀，并向凝膠基質(zhì)中延伸，呈現(xiàn)線性排列并形成管腔樣結(jié)構(gòu)。并且由于濃度的不同，細(xì)胞成管數(shù)不同，隨著濃度的增加，細(xì)胞管腔樣結(jié)構(gòu)逐漸減少。

2.2 新藤黃酸對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響

流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，細(xì)胞凋亡率在GNA的1、2和4μmol/L濃度下分別為（4.5±1.9）%，（9.2±2.4）%，（30.5±6.4）%，與空白對(duì)照組（0.21±0.02）%相比具有明顯差異（P＜0.05）。

2.3 新藤黃酸對(duì)蛋白表達(dá)的影響

HUVEC的p-PI3K，p-Akt蛋白表達(dá)量隨著GNA藥物濃度的增加而下降，但蛋白PI3K表達(dá)量基本不變。當(dāng)PTEN-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，結(jié)果顯示經(jīng)GNA作用后PI3K，AktmRNA基因的表達(dá)水平明顯高于空白對(duì)照組（P＜0.05）。

3 討論

藤黃（gamboge）為藤黃科植物藤黃Garcinia hanbaryi Hook.f.的樹干被割傷后流出的膠狀樹脂[12-14]。近20年來，對(duì)藤黃及其活性成分藤黃酸等做了大量的研究工作，發(fā)現(xiàn)藤黃具有抗癌作用，并經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)重復(fù)證明其主要的有效成分是以藤黃酸（gambogic acid）為代表的橋環(huán)化合物，其抗癌作用與一般的化療抗癌藥有所區(qū)別，能選擇性地殺死癌細(xì)胞，而對(duì)正常的造血系統(tǒng)和白細(xì)胞沒有影響[15]。1984年呂歸寶從中藥藤黃中分離得到新藤黃酸，根據(jù)目前研究表明，新藤黃酸與藤黃酸相比具有作用強(qiáng)，毒性低、穩(wěn)定性好和抗癌譜廣等特點(diǎn)。

VEGF是目前所知最強(qiáng)的、直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成促進(jìn)因子。普遍認(rèn)為VEGF是腫瘤血管生成的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)者。VEGF是內(nèi)皮細(xì)胞上特異性的有絲分裂素，與其受體Flt-1和KDR/Flk-1選擇性位于血管內(nèi)皮細(xì)胞上，激活VEGF和其受體皆可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂，刺激血管生成的全過程，增強(qiáng)微血管通透性。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，中藥藤黃中含有新藤黃酸對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖抑制作用，能有效的誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生凋亡及抑制細(xì)胞自噬，并且還具有抑制血管生成的作用（抑制效果與劑量有關(guān)）和抑制p-PI3K，p-Akt蛋白的表達(dá)水平的作用。當(dāng)PTEN-siRNA轉(zhuǎn)染入細(xì)胞后，能促進(jìn)PI3K，AktmRNA基因的表達(dá)與空白對(duì)照組相比（P＜0.05）。

綜上所述，新藤黃酸具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞的小管形成和誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用，能有效的阻斷腫瘤血管生成中的重要環(huán)節(jié)。其具有的抑制內(nèi)皮細(xì)胞小管形成和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)。