肝素結(jié)合蛋白在膿毒癥中的應(yīng)用研究進展

陳燕，楊軼軒

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院感染科，重慶）

0 引言

膿毒癥是機體對感染的反應(yīng)失調(diào)而導(dǎo)致危及生命的器官功能障礙[1]。其病理生理機制包括宿主反應(yīng)、先天免疫、凝血異常、炎癥反應(yīng)、凝血與炎癥網(wǎng)絡(luò)、免疫抑制、器官功能障礙、基因多態(tài)性等。其發(fā)病率高、病情危重、死亡率高，韓國的一項基于醫(yī)療保險報銷數(shù)據(jù)庫的全國性回顧性觀察性研究表明，在韓國膿毒癥發(fā)病率從2007年的173.8/10萬增加到2016年的233.6/10萬，與膿毒癥相關(guān)的總住院死亡率高達29.0%[2]。一項新的系統(tǒng)綜述研究表明，膿毒癥識別后1h內(nèi)上抗菌藥物對于死亡率的改善是最佳的[3]。膿毒癥的早期臨床癥狀特異性不高，近1/3的嚴(yán)重膿毒癥患者在入院時沒有表現(xiàn)出組織器官功能障礙的征象，隨后卻在最初的急診科評估后24小時內(nèi)進展為嚴(yán)重膿毒癥[4]，所以預(yù)測或是早期診斷膿毒癥就顯得尤為重要。膿毒癥早期診斷和療效評估的生物標(biāo)志物大約有兩百多種[5]，臨床上至今仍缺乏特異性的診斷膿毒癥或是療效監(jiān)測的生物標(biāo)志物。1985年如Wasson等[6]人所述，一個有用的膿毒癥診斷生物標(biāo)記物需要滿足四個標(biāo)準(zhǔn)：（1）生物相關(guān)性基礎(chǔ)；（2）高靈敏度、高特異性和陽性及陰性預(yù)測值高；（3）機構(gòu)之外的重復(fù)性好；（4）其他獨立患者人群的有效性。其它所有提出的診斷生物標(biāo)記物都不滿足所有這些標(biāo)準(zhǔn)。HBP符合這一標(biāo)準(zhǔn)。

1 HBP結(jié)構(gòu)

HBP是Shafer等[7]首次從人中性粒細胞顆粒中分離純化，因其帶正電荷、有抗菌活性、相對分子量為3700，故稱為陽離子抗菌蛋白（CAP37）和天青殺素。成熟（活性）CAP37為單鏈多肽，由221或222個氨基酸殘基組成，相對分子質(zhì)量為24000。Pohl等[8]測定了CAP37的氨基酸序列，CAP37是胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶家族中的一員，具有多種配體的結(jié)合位點（肝素、脂質(zhì)A、脂多糖等），絲氨酸蛋白酶在炎癥的各個方面都很重要[9]，其與人中性粒細胞彈性蛋白酶的同源性最高（45%），與蛋白酶3、組織蛋白酶G的序列同源性分別為為42%、32%；CAP37有3個糖基化位點，分別位于第100、114和145號殘基上；有與彈性蛋白酶、補體因子D和糜蛋白酶結(jié)構(gòu)中相同的8個嚴(yán)格保守的半胱氨酸殘基[10]，另CAP37像彈性蛋白酶一樣具有類糜蛋白酶類型的二硫鍵配對，二硫鍵的存在對于抗菌作用是必要的；最關(guān)鍵的序列差異涉及催化殘基，因其催化三聯(lián)體中的兩個氨基酸殘基被替換，使其無酶活性；但其仍能與胰蛋白酶抑制劑（BPTI）結(jié)合，使得BPTI（牛胰蛋白酶抑制劑）親和色譜法可以提純出HBP，證實HBP與BPTI結(jié)合是作用于活化中心三聯(lián)體上的。蛋白質(zhì)的一側(cè)存在一個由兩簇堿性氨基酸殘基參與組成的一個高度陽離子的結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域結(jié)合肝素和發(fā)揮抗菌活性，堿性氨基酸殘基還可能與帶負電荷的內(nèi)皮細胞膜蛋白多糖分子結(jié)合[11]，從而誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞的構(gòu)象變化。成熟CAP37蛋白是一種具有交替的疏水和親水結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，疏水結(jié)構(gòu)域的存在使其能更好地進入脂質(zhì)雙層，增強了它們對細胞膜和隨后的趨化結(jié)合的親和力。

2 HBP定位

嗜天青顆粒存在于原始粒細胞及早幼粒細胞中，而分泌型小泡在中性粒細胞成熟的末期才出現(xiàn)。HBP在中性粒細胞成熟過程中被合成，在嗜天青顆粒、分泌小泡、質(zhì)膜上儲存量分別約為74%、18%、8%。由于它儲存在中性粒細胞的嗜天青顆粒和靠近細胞膜附近的分泌小泡中，故其易于活化，中性粒細胞受刺激后所分泌的HBP是向細胞外釋放的，所以我們可以通過檢測技術(shù)了解血漿中的HBP水平。其雙重定位表明該蛋白在中性粒細胞中具有多種功能。從分泌小泡釋放容易調(diào)動的HBP，在炎癥早期可能具有重要作用；另一方面，嗜天青顆粒釋放率低，只有當(dāng)中性粒細胞浸潤組織時才釋放，此時中性粒細胞源性HBP與吞噬體融合后，可能與內(nèi)部細菌發(fā)生密切接觸，產(chǎn)生重要的抗菌作用[12]。

3 HBP的分泌及功能

中性粒細胞活化及釋放HBP是對感染作出的反應(yīng)。趨化因子從感染部位釋放，以響應(yīng)入侵病原體的組分與模式識別受體的結(jié)合[13]。這些趨化因子如IL-8激活中性粒細胞并導(dǎo)致HBP釋放[14]。細菌蛋白也可以直接激活中性粒細胞并釋放HBP[15-18]，包括來自化膿性鏈球菌的M1蛋白[15]，來自豬鏈球菌的溶血素[16]，來自銅綠假單胞菌分泌物[18]和來自金黃色葡萄球菌的酚溶性調(diào)節(jié)素α4[17]。內(nèi)皮細胞是中性粒細胞分泌小泡釋放的HBP的第一個靶點，當(dāng)其與內(nèi)皮細胞表面的細胞粘附分子接觸時，中性粒細胞也被激活[19]，隨后的HBP釋放導(dǎo)致內(nèi)皮通透性增加，促進中性粒細胞及單核細胞向感染部位外滲[20]。儲存在嗜天青顆粒中的HBP，只有在中性粒細胞滲入組織后才釋放[12,21]。因此，HBP既在血液中釋放，也在組織中釋放，在那里它對幾種細胞類型產(chǎn)生影響。

HBP是一種具有抗菌、趨化多種白細胞、增加血管內(nèi)皮通透性等多種功能的炎性蛋白。它能夠殺死革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌和白色念珠菌[7,22]，通過作為調(diào)理素增強對病原體的吞噬作用[23]；其抗菌活性主要是針對革蘭氏陰性細菌，可能是通過與脂多糖（LPS）類脂A結(jié)合而啟動的，HBP可能在感染過程中發(fā)揮中和LPS的作用[24]。除了與病原體的相互作用外，HBP還影響宿主中幾種不同類型的白細胞以增強免疫反應(yīng)。例如作為單核細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞的趨化劑[14,25]，從而增強白細胞募集和細胞因子釋放。穿過內(nèi)皮屏障，循環(huán)中的白細胞才能外滲至感染部位[26]；內(nèi)皮屏障功能的喪失是膿毒癥發(fā)生的一個重要因素[27]；HBP影響內(nèi)皮細胞，首先通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞表達ICAM1，PECAM-1和整合素a3和b1，這有助于中性粒細胞粘附到內(nèi)皮表面[28]；HBP然后誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞骨架的重排[20]、細胞收縮和細胞之間的間隙形成[29]，導(dǎo)致內(nèi)皮通透性增加。HBP也針對內(nèi)皮細胞中的線粒體，引起形態(tài)學(xué)變化，降低細胞色素c氧化酶亞基II的表達，降低線粒體膜電位[30]，對線粒體起到抗凋亡的保護作用，有助于在體內(nèi)中性粒細胞激活的情況下將內(nèi)皮細胞的損傷降至最低。

4 HBP在膿毒癥中的應(yīng)用

HBP是中性粒細胞中唯一從分泌囊泡分泌到環(huán)境中的顆粒蛋白[24]，因此強調(diào)了其在炎癥反應(yīng)中具有重要作用。有研究表明，銅綠假單胞菌彈性蛋白酶是一種有效的金屬蛋白酶，可以降解像LL-37這樣的抗菌肽，卻不能降解HBP，表明HBP在高度蛋白水解的環(huán)境中是穩(wěn)定的[18]。這些都使得HBP能在血液循環(huán)中被檢測到。

從生物學(xué)上看，HBP是一種早期和預(yù)測性的生物標(biāo)志物，因為它是預(yù)先合成的，并通過遷移中性粒細胞對細菌感染的反應(yīng)迅速動員起來。HBP儲存在中性粒細胞的分泌小泡和嗜天青顆粒中[12]，中性粒細胞中的分泌小泡在其激活時會出現(xiàn)快速的胞吐，僅在吞噬細菌30分鐘后就有89%的HBP胞吐，這比其他中性粒細胞顆粒蛋白的比例要大得多[24]。HBP導(dǎo)致血管滲漏和水腫形成，并對各種白細胞和上皮細胞具有促炎作用。血管屏障功能破壞和細胞炎癥反應(yīng)的失調(diào)可導(dǎo)致器官功能衰竭。HBP在嚴(yán)重細菌感染的病理生理學(xué)中起主要作用，因此是一種潛在的診斷標(biāo)記物和膿毒癥治療的靶點。

HBP能診斷膿毒癥、預(yù)測膿毒性休克的發(fā)生及判斷預(yù)后。健康人血漿HBP濃度很低，一般不超過10ng/mL。2009年Linder等[31]認為血漿HBP水平大于15ng/mL是嚴(yán)重膿毒癥診斷的最佳實驗室指標(biāo)，敏感性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值均高，分別達87.1%、95.1%、88.4%、94.5%。在26例感染性休克患者中，24例（92.3%）在入選時血漿HBP水平就已升高；在其余44例嚴(yán)重膿毒癥患者中，37例（84.1%）血清水平升高；在100名非嚴(yán)重膿毒癥患者中，只有7名患者的HBP水平升高。表明HBP血漿水平升高與低血壓、器官功能衰竭的發(fā)生密切相關(guān)。研究中的一些登記患者后來被診斷為非傳染性疾病，在這20名患者中，有11名因各種非感染性臨床條件導(dǎo)致循環(huán)衰竭；與嚴(yán)重感染的患者相比，除1例非感染性低血壓患者外，其余患者的HBP水平均較低；這些數(shù)據(jù)支持HBP在嚴(yán)重膿毒癥患者觀察到的循環(huán)衰竭中具有特定的致病作用這一假設(shè)。在所研究的70名有嚴(yán)重膿毒癥和感染性休克的患者中，由多種細菌引起的嚴(yán)重感染會導(dǎo)致血漿HBP水平升高，當(dāng)比較感染了革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細菌的患者的HBP水平時，檢測到?jīng)]有顯著差異（未發(fā)表的數(shù)據(jù)）。此外，患者人群中的HBP水平與WBC之間沒有相關(guān)性，這表明如果HBP要釋放到循環(huán)中，就需要特定的中性粒細胞激活。在本研究中，在發(fā)展為膿毒癥的患者中，有80%在滿足重度膿毒癥標(biāo)準(zhǔn)之前，其HBP水平就升高了（＞30ng/mL），表明HBP可預(yù)測膿毒癥及器官功能障礙的發(fā)生；提示在發(fā)燒患者中檢測到血漿HBP水平升高應(yīng)立即提醒臨床醫(yī)生加強液體復(fù)蘇并開始適當(dāng)?shù)目股刂委煟越档椭匕Y膿毒癥或感染性休克患者的死亡率[3]。

2012年Linder等[32]研究了ICU中嚴(yán)重膿毒癥和感染性休克患者血漿中HBP水平。總共包括179名患者，其中151名有膿毒癥（126名有感染性休克，25名有嚴(yán)重膿毒癥）和28名非膿毒癥危重患者。使用15 ng/mL的截斷值和/或HBP/WBC＞2，發(fā)現(xiàn)87%的膿毒癥患者在研究登記時HBP水平升高。在17.6%的患者中發(fā)現(xiàn)一過性白細胞減少癥，這是膿毒癥相對常見的特征；膿毒癥患者出現(xiàn)白細胞減少的可能原因是：膿毒癥發(fā)作時胞吐增強、骨髓細胞成熟耗竭或停止、中性粒細胞組織分泌等，所以使用HBP/WBC比值可提高診斷一過性白細胞減少癥患者是否為膿毒癥的敏感性。這項研究表明：與ICU中的非感染性疾病患者相比，嚴(yán)重膿毒癥或感染性休克患者的血漿HBP水平顯著升高；HBP水平與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)；入院時HBP升高與死亡風(fēng)險增加相關(guān)；隨著時間的推移升高的HBP可能識別出預(yù)后惡化的患者。先前關(guān)于HBP作為嚴(yán)重膿毒癥的敏感標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)在不同的環(huán)境中得到了證實，強調(diào)了它作為一種有價值的診斷工具的潛力。

2015年Linder等[33]做了一項前瞻性國際多中心隊列研究，地點為瑞典、加拿大和美國的七個不同的急診科。在674名被診斷為感染的患者中，487名在登記時沒有器官功能障礙。在這487名患者中，141名（29%）在72小時的研究期間內(nèi)出現(xiàn)了器官功能障礙；HBP閾值設(shè)定為30 ng/mL 時，141例患者中有110例（78.0%）在發(fā)生器官功能障礙前血漿HBP濃度超過閾值。HBP預(yù)測進展為器官功能障礙的敏感度為78.0%，特異性為76.3%，與其他生物標(biāo)志物（PCT、WBC、CRP、乳酸）相比，肝素結(jié)合蛋白是進展為器官功能障礙的最佳預(yù)測因子（受試者工作特征曲線下面積=0.80）。HBP比其他標(biāo)記物先升高，可以用其位于分泌顆粒內(nèi)的位置來解釋，分泌顆粒是中性粒細胞激活后最先被動員的。釋放后，HBP參與中性粒細胞介導(dǎo)的內(nèi)皮通透性改變，導(dǎo)致血管滲漏。如果患者樣本獲取得更接近器官功能障礙的起始點，那么HBP升高的可能性可能會增加。本次研究提出的HBP作為膿毒癥標(biāo)志物的截斷值高于以前的研究。

2019年，一項中國的前瞻性隊列研究[34]，探討膿毒癥和膿毒性休克國際共識定義（Sepsis-3）中肝素結(jié)合蛋白（HBP）在膿毒癥和膿毒性休克中的釋放水平；膿毒癥組56例和膿毒性休克組37例，在125名感染患者中，以HBP28.1ng/mL作為診斷膿毒癥的臨界值，診斷膿毒癥的敏感性為84.9%，特異性為78.3%。陽性預(yù)測值為94.0%，陰性預(yù)測值為65.9%,這一數(shù)值與該研究結(jié)果（最佳截斷值分別為HBP≥15ng/mL和≥30ng/mL）接近。以≥103.5 ng/mL作為診斷膿毒性休克的臨界值，敏感性為67.6%，特異性為82.1%，陽性預(yù)測值為71.4%，陰性預(yù)測值為79.3%；86人有明確的病原體證據(jù)，其中42人感染了革蘭氏陽性菌，31人感染了革蘭氏陰性菌，革蘭氏陽性細菌感染患者與革蘭氏陰性細菌感染患者之間的血漿HBP水平無顯著差異。

綜上所述，HBP是中性粒細胞合成并釋放的一種多功能炎性蛋白，它是預(yù)先合成的，菌體結(jié)構(gòu)可刺激其從分泌囊泡中快速釋放,它作為炎癥反應(yīng)的放大器，并導(dǎo)致毛細血管滲漏，這兩者在嚴(yán)重膿毒癥時都是高度失調(diào)的。因此，HBP在感染早期升高，用于預(yù)測器官衰竭及判斷預(yù)后，在生物學(xué)上是非常合理的，多個不同中心的大型臨床研究結(jié)果均提示其診斷、預(yù)測胡判斷預(yù)后的性能均優(yōu)于PCT、CRP等傳統(tǒng)炎性指標(biāo)；但其在臨床應(yīng)用中的截斷值還需要更多大型臨床研究來界定。近年來有研究發(fā)現(xiàn)HBP可作為膿毒癥的治療靶點，尚需深入研究。