升清降濁方對慢性腎功能衰竭重要臟器的保護(hù)效用及其對炎癥因子的影響

*傅貴平，龔志南，王 霞，李 升，戴彩華，王冬芽，江嘉陵，武 蓉，陳 晨

（井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)部，江西，吉安343000）

炎癥反應(yīng)是慢性腎功能衰竭(chronic renal failure，CRF)重要的病理基礎(chǔ)之一。前期研究顯示，升清降濁方治療CRF療效確切[1-6]，并可有效地降低外周血及腎組織微炎癥因子的濃度[6-7]。近期有研究顯示，CRF 隨著病情的惡化，對人體的心臟功能、消化系統(tǒng)均會產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p害[8-9]。本研究從炎癥因子角度探討以升清降濁方及其主要單味藥大黃、升麻對慢性腎衰竭中的重要臟器的保護(hù)的效應(yīng)，以明確升清降濁方治療CRF 的作用靶點，為中醫(yī)治療CRF提供理論依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 實驗動物

SPF 級SD 雄性大鼠180 只，體重180～200 g/只，由湖南省斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司提供，實驗動物許可證號:SCXK ( 湘) 2016－0002。

1.2 藥物情況

升清降濁方組：升麻10 g，大黃10 g，黃芪20 g，丹參20 g，蒲公英10 g，白花蛇舌草12 g，鹿銜草15 g，菟絲子15g，枸杞15g，桃仁10 g，馬鞭草15 g。以10倍量的水合煎，每次30 min，共2 次，合并2 次濾液，濃縮至120 mL，每mL 相當(dāng)于原藥材1 g。

升麻單體治療組：以升麻有效成分異阿魏酸8 mg／kg 用藥劑量，每日分2次灌注CRF 大鼠（此劑量約相當(dāng)于成人每日升麻10 g）；異阿魏酸（南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司生產(chǎn)，純度98%，產(chǎn)品批號：ZLSC171208001-YAWS）

大黃單體治療組：以大黃有效組份大黃總蒽醌 240 mg／kg 用藥劑量，每日分2 次灌注CRF 大鼠（此劑量約相當(dāng)于成人每日大黃10 g）。大黃總蒽醌（南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司生產(chǎn)，純度98%，產(chǎn)品批號：ZLSC170409003-DHZEK）

基本方治療組：此方為益氣活血、清熱解毒方，它是課題組前期基礎(chǔ)方，丹參20 g，黃芪20 g，桃仁10 g，白花蛇舌草12 g，蒲公英10 g，馬鞭草15 g，鹿銜草15 g。將基本方的各飲片分別用8倍、6倍水煎煮2 次，第1次煎煮1.5 h，第2次煎煮1 h，兩次煎煮液相混，減壓濃縮后低溫冷凍，干燥成粉狀，灌胃前按100 g（原藥材）／加水100 mL 溶解。按10 mL／kg 用藥劑量給CRF 大鼠灌胃。

替米沙坦組：以替米沙坦(上海信誼天平藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字：87181204)干預(yù)CRF大鼠，以1.5 mg／只／d 給藥。

1.3 主要試劑與儀器

戊巴比妥鈉液(德國默克集團生產(chǎn)，批號：140618)；MM-0046R 大鼠IL-1(貨號：1806R)、MM-0190R 大鼠IL-6(貨號:1806R)、MM-0180R 大鼠TNF-α ( 貨號:1806R)ELISA 試劑盒均由德國IBL 公司生產(chǎn)；C-反應(yīng)蛋白ELISA 試劑盒為上海奧普生物有限公司生產(chǎn)（貨號CRP-1501，批號20171206）；大鼠酪蛋白B級飼料，由湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司提供，許可證號:SCXK (湘)2014－0002。EVO-LSI5電鏡(德國Zeiss公司)；MDF-U53超低溫冰箱(日本三洋公司)；ADVIA 2400 全自動生化檢測儀(Siemns 公司)；BM_VIII 生物組織包埋機(湖北孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司)TS-12μ 生物組織自動脫水機(湖北孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司)。

1.4 造模方法

參照沙朝暉等制備CRF動物模型技術(shù)[10]，采用大鼠5/6 腎切除的方法（即采用二次手術(shù)的方式）。具體方法：在大鼠腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉25 mg/kg進(jìn)行麻醉，打開腹腔，先切除2/3左腎，用明膠海綿止血，1周后再切除右腎全部，僅余下1/6腎組織，縫合。造模30 d 在大鼠尾部靜脈采血，采血量0.5～1 mL／只，離心，測定Scr、BUN，Scr水平>177 μmol/L（2 mg/dL）以上，BUN 水平升高>7.0 mmol/L（20 mg/dl）為造模成功。

1.5 動物分組及給藥方法

將180只造模成功的大鼠隨機分組，每組30只，即空白對照組、升清降濁方組、升麻單體治療組、大黃單體治療組、基本方治療組、替米沙坦組。

升清降濁方組給予升清降濁方溶液(濃度為1 g/mL) 10 mL/K g 灌胃；升麻單體治療組以升麻有效成分異阿魏酸8 mg／kg（約相當(dāng)于成人每日升麻10 g）用藥劑量，每日分2次灌胃；大黃單體治療組以大黃有效組份大黃總蒽醌240 mg／kg 用藥劑量（約相當(dāng)于成人每日大黃10 g），每日分2次灌胃；基本方治療組以課題組前期基礎(chǔ)方(濃度為1 g /mL)10 mL/K g 灌胃；替米沙坦組以替米沙坦干預(yù)CRF大鼠，1.5 mg／只／d?？瞻捉M每日以與升清降濁方等量的生理鹽水灌胃。各組灌胃均為28 d。

1.6 觀察指標(biāo)

各組灌胃干預(yù)28 d，采集大鼠血液，檢測血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、尿酸(UA)等生化指標(biāo)；檢測白細(xì)胞介素1（IL-1），白細(xì)胞介素6（IL-6），腫瘤壞死因子α（TNF-α），C反應(yīng)蛋白（CRP）等炎癥因子水平；處死大鼠，對腎組織進(jìn)行病理切片，做HE 染色和電鏡觀察；炎癥因子水平等。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料用x±s表示；各組干預(yù)前后比較采用配對t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，其中的兩兩比較用q 檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腎功能指標(biāo)比較

如表1 所示，升清降濁方組、升麻單體治療組、大黃單體治療組治療前后Scr、BUN、UA、有顯著差異(P＜0.05)；

2.2 各組大鼠血清炎癥因子含量比較

升清降濁方組、升麻單體治療組、大黃單體治療組治療前后Scr、BUN、UA、CRP、IL-1、IL-6、TNF-α 有顯著差異(P＜0.05或P＜01)；升清降濁方組、升麻單體治療組、大黃單體治療組的Scr、UA、IL-1、CRP 較其它治療組更顯著(P＜0.05 或P＜01)。

表1 各組大鼠腎功能指標(biāo)比較( x± s)Table 1 Comparison of renal function indexes of rats in each group

表2 各組大鼠血清炎癥因子表達(dá)比較(x± s)Table 2 Comparison of the expression of serum inflammatory factors in rats of each group

2.3 各組大鼠腎組織的病理改變

如圖1 所示：空白組腎間質(zhì)彌漫淋巴細(xì)胞浸潤，局灶見腎小管內(nèi)中性粒細(xì)胞聚集形成膿腫，大部分腎小球球囊擴張，毛細(xì)血管叢萎縮；基本方組腎間質(zhì)灶性淋巴細(xì)胞浸潤，小球血管叢萎縮明顯，小管上皮水腫部分脫離；升清降濁方組腎小球毛細(xì)血管叢肥大，小管上皮水腫，散在少量炎細(xì)胞浸潤；升麻單體組腎小球毛細(xì)血管叢萎縮，淋巴細(xì)胞灶狀分布，小管上皮脫落；大黃單體組腎小球毛細(xì)血管叢萎縮，淋巴細(xì)胞灶狀分布，小管上皮水腫，部分脫落。

截至2012年8月份，宿州市現(xiàn)有注冊的物業(yè)管理企業(yè)約50家，其中最高資質(zhì)等級為二級，所占比例不足20%，其余大多是三級資質(zhì)，還有部分是剛剛注冊的暫定三級資質(zhì)。很多物業(yè)公司都是開發(fā)置業(yè)公司的親子單位，專業(yè)的物業(yè)公司很少。在這50家左右的企業(yè)中，小型企業(yè)居多，中型企業(yè)不占主體，物業(yè)管理面積達(dá)到規(guī)模的企業(yè)偏少，從而導(dǎo)致物業(yè)服務(wù)成本的增加，直接制約物業(yè)管理行業(yè)的健康發(fā)展。并且，在現(xiàn)有公司中，絕大部分企業(yè)來自外地，宿州市本地大型物業(yè)管理公司極其缺乏。這也是導(dǎo)致宿州市物業(yè)管理行業(yè)出現(xiàn)不良狀態(tài)的原因之一[1]。

如圖2所示：空白組心肌大面積瘢痕纖維化；基本方組心肌重度水腫；升清降濁方組心肌輕度水腫；升麻單體組心肌重度水腫；大黃單體組心肌中度水腫。

如圖3所示：空白組肝竇擴張淤血；基本方組肝竇擴張淤血；升清降濁方組肝細(xì)胞輕度水腫；升麻單體組肝竇擴張淤血；大黃單體組肝細(xì)胞中度水腫淤血。

空白組腎間質(zhì)彌漫淋巴細(xì)胞浸潤，局灶見腎小管內(nèi)中性粒細(xì)胞聚集形成膿腫，大部分腎小球球囊擴張，毛細(xì)血管叢萎縮。升清降濁方組的大鼠腎小球毛細(xì)血管叢肥大，小管上皮水腫，散在少量炎細(xì)胞浸潤。而升麻單方組及大黃單方組大部分腎小球毛細(xì)血管叢萎縮，小管上皮脫落，淋巴細(xì)胞灶狀分布。陽性對照組大鼠心肌大面積瘢痕纖維化，觀察升清降濁方大鼠心肌輕度水腫，相對其他組大鼠心肌均有重度水腫。升清降濁方組大鼠肝細(xì)胞輕度水腫，余各組大鼠肝細(xì)胞水腫并且伴有不同程度淤血。

動物造模后對比不同用藥組大鼠的腎、心、肝重要器官病理觀察，明顯發(fā)現(xiàn)：升清降濁方組對大鼠腎臟、心臟及肝臟保護(hù)作用明顯優(yōu)于其他組。

圖1 各組間腎組織HE 染色對比（×100）Fig.1 Comparison of HE staining in renal tissue of each group

圖2 各組間心肌HE 染色對比（×100）Fig.2 Comparison of HE staining in myocardium of each group

圖3：各組間肝臟HE 染色對比（×100）Fig.3 Comparison of liver HE staining of each group

3 討論

腎臟主要生理功能之一是將機體產(chǎn)生的代謝廢物排出體外，并保持體內(nèi)水、電解質(zhì)和酸堿平衡即“降濁”。這一功能的實現(xiàn)依賴于腎小球的濾過屏障，腎小管的重吸收和分泌的精細(xì)調(diào)節(jié)，機體需要的營養(yǎng)物質(zhì)會被“保留”下來而用于生物合成，功能調(diào)節(jié)等生理功能的實現(xiàn)即“升清”。CRF 狀態(tài)下這種“升清”與“降濁”的功能喪失，形成清陽不升、濁陰不降的病理狀態(tài)。

中醫(yī)認(rèn)為CRF 狀態(tài)，清陽不升、濁陰不降是病機關(guān)鍵，“痰、濁、濕、毒”是主要病理產(chǎn)物，且清陽不升，濁陰不降與“痰、濁、濕、毒”互為因果關(guān)系[11]?！疤?、濁、濕、毒”在體內(nèi)影響絡(luò)脈運行氣血，久則蘊結(jié)難解，病勢膠著，頑固不化。

而從最近的研究來看，CRF 不僅對人體腎臟，對其他一些臟器也有明顯損傷。研究表明，CRF 患者普遍存在超聲心動圖異常改變，其左室、左房、左室后壁厚度、左室心肌重量指數(shù)、室間隔均高于正常對照組。相比于正常對照組，CRF 組病人左室射血分?jǐn)?shù)、二尖瓣口舒張早期與末期血流峰值速度比值均明顯下降(P< 0.05)，CRF 病情越嚴(yán)重，心臟異常改變的幅度越大[8]。此外，在消化系統(tǒng)方面，腸道菌群失衡普遍存在于CRF 患者中，這種腸道菌群失衡表現(xiàn)為低豐度細(xì)菌類群最先受到影響,并且對腸道健康有益的丁酸鹽產(chǎn)生菌數(shù)量明顯減少，腎功能障礙程度越高，腸道菌群的結(jié)構(gòu)失衡越嚴(yán)重。CRF 患者還存在腸黏膜屏障的損傷，主要表現(xiàn)為腸黏膜通透性增加，由此引發(fā)細(xì)菌易位及腸源性內(nèi)毒素血癥[9]。

針對上述病機，我們研究組創(chuàng)新綜合治法，以升麻大黃藥對為主藥組成的方劑，是基于人體的五臟陰陽平衡角度來制定。生死之機，升降而已。有升必有降，有降才有升，升降有序，五臟才得協(xié)調(diào)。而升麻大黃藥對為主方的中藥配伍防治CRF，正是遵循這一規(guī)律。大黃見于《本經(jīng)》，“主下瘀血，血瘀，寒熱”；《醫(yī)學(xué)啟源》稱大黃：“氣味俱厚，沉而降，陰也”，因而必須加用升浮藥才能達(dá)到更好的療效。升麻最早見于《本經(jīng)》：“味甘，平，主解百毒”?！缎挠〗C珠經(jīng)》稱之為：“無毒，升也”。升麻補益脾氣升清降濁，健運精微，杜絕濕濁（毒）內(nèi)生[12]。升麻與大黃相配升清降濁為君藥；黃芪補益脾氣，健運精微，菟絲子，枸杞益腎填精，桃仁，丹參化瘀通絡(luò)，五藥相配共創(chuàng)補腎健脾，益氣活血為臣藥；蒲公英，白花蛇舌草，馬鞭草，鹿銜草相配清利濕熱為使藥。全方共奏升清降濁、補益脾腎、化瘀利濕之效。