釀酒酵母基因組進(jìn)化的研究進(jìn)展

夏思楊，江麗紅，蔡謹(jǐn)，黃磊，徐志南，連佳長

（1浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)院，生物質(zhì)化工教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州310027；2浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)院，合成生物學(xué)研究中心，浙江杭州310027）

由于對能源安全、可持續(xù)性發(fā)展和全球變暖的日益擔(dān)憂，利用微生物細(xì)胞工廠將可再生資源轉(zhuǎn)化為燃料和化學(xué)品是目前國內(nèi)外研究的一大熱點(diǎn)。通過自下而上或自上而下［1］的工程策略，深入了解生物網(wǎng)絡(luò)對于構(gòu)建有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的“微生物細(xì)胞工廠”至關(guān)重要。此外，系統(tǒng)生物學(xué)和合成生物學(xué)的最新進(jìn)展使人們對生物系統(tǒng)有了更深的理解，能夠做出更具預(yù)測性的工程設(shè)計(jì)。然而，由于生物系統(tǒng)的復(fù)雜性，諸如脅迫耐受性等受到多基因調(diào)控的復(fù)雜表型，單基因理性改造方法很難實(shí)現(xiàn)預(yù)定的目標(biāo)。為了克服這一主要限制，越來越多的研究人員將目標(biāo)轉(zhuǎn)向一種強(qiáng)大的多功能工具——基因組進(jìn)化，以構(gòu)建滿足工業(yè)生產(chǎn)需求的微生物細(xì)胞工廠。

釀酒酵母是第一個(gè)被完全測序的真核細(xì)胞［2］，其分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究最為透徹。與原核生物不同，釀酒酵母含多種細(xì)胞器，能夠?yàn)樯锖铣商峁┎煌沫h(huán)境。此外，釀酒酵母是公認(rèn)安全的模式生物，遺傳操作簡單，并且對惡劣的工業(yè)條件表現(xiàn)出很高的耐受性［3］，適合大規(guī)模生產(chǎn)，因此在生物技術(shù)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。

定向進(jìn)化已經(jīng)在蛋白、途徑和基因組水平上取得了里程碑式的進(jìn)展［4］。本文作者將重點(diǎn)介紹基于釀酒酵母基因組水平定向進(jìn)化的重要技術(shù)進(jìn)展及其在構(gòu)建高效酵母細(xì)胞工廠方面的應(yīng)用，并簡要介紹釀酒酵母基因組進(jìn)化面臨的挑戰(zhàn)和發(fā)展趨勢。

1 釀酒酵母基因組進(jìn)化的技術(shù)策略

基因組進(jìn)化起源于選擇性育種和馴化，如今已發(fā)展成為一種強(qiáng)大的多功能工具，可用于與各種工業(yè)過程相關(guān)的蛋白質(zhì)和全細(xì)胞生物催化劑的工程設(shè)計(jì)?；蚪M進(jìn)化在試管中模擬達(dá)爾文進(jìn)化，涉及遺傳多樣性和文庫篩選的迭代過程。與理性設(shè)計(jì)不同，基因組進(jìn)化工程較少依賴于基因型-表型關(guān)系的先驗(yàn)知識，通過非定點(diǎn)或定點(diǎn)誘變有效地創(chuàng)造遺傳多樣性，然后在選擇性生長條件下篩選優(yōu)異表型。本節(jié)將從隨機(jī)進(jìn)化（非理性）以及可示蹤基因組進(jìn)化（半理性）兩個(gè)方向總結(jié)釀酒酵母全基因組水平進(jìn)化的技術(shù)發(fā)展（圖1）。

圖1 釀酒酵母基因組進(jìn)化的主要技術(shù)策略（基因組進(jìn)化主要包括基于隨機(jī)突變的基因組進(jìn)化技術(shù)和基于高效基因組編輯技術(shù)的可示蹤基因組進(jìn)化技術(shù)）gTME—全局轉(zhuǎn)錄機(jī)制工程；SCRaMbLE—LoxP介導(dǎo)的合成染色體重組和修飾進(jìn)化系統(tǒng)；YOGE—酵母寡核苷酸介導(dǎo)的基因組工程；eMAGE—真核多重自動(dòng)化基因組工程；RAGE—RNAi輔助基因組進(jìn)化；CHAnGE—CRISPR/Cas9和同源定向修復(fù)輔助的全基因組進(jìn)化；MAGIC—多功能全基因組CRISPR系統(tǒng)；MAGESTIC—基于短、可示蹤、整合的細(xì)胞條形碼的多重精準(zhǔn)基因編輯技術(shù)；NGS—二代測序Fig.1 Major technologies for genome evolution in Saccharomyces cerevisiae,including random genome evolution and trackable genome evolutiongTME—global transcription machinery engineering；SCRaMbLE—synthetic chromosome recombination and modification by LoxP-mediated evolution；YOGE—yeast oligo-mediated genome engineering；eMAGE—eukaryotic multiplex automated genome engineering；RAGE—RNAi-assisted genome evolution；CHAnGE—CRISPR/Cas9-and homology-directed-repair-assisted genome-scale engineering；MAGIC—multi-functional genome-wide CRISPR system；MAGESTIC—multiplexed accurate genome editing with short，trackable，integrated cellular barcodes；NGS—next-generation sequencing

1.1 基于隨機(jī)突變的基因組進(jìn)化

傳統(tǒng)的基因組進(jìn)化方法依賴于隨機(jī)突變，可通過化學(xué)誘變劑/紫外線輻射、適應(yīng)性進(jìn)化、轉(zhuǎn)座子插入和基因組改組等實(shí)現(xiàn)?；陔S機(jī)突變的基因組進(jìn)化方法因操作簡單并且能有效產(chǎn)生改良的表型，在工業(yè)上被廣泛采用，尤其是對于遺傳學(xué)定義不明確且遺傳工具有限的宿主。

1.1.1 化學(xué)/物理誘變

化學(xué)/物理誘變［5］是一種經(jīng)典的菌株改良的方法。該技術(shù)將微生物細(xì)胞暴露在適量的誘變劑下，通過鏈斷裂以及堿基的添加、刪除或替換造成DNA隨機(jī)損傷，再結(jié)合有效的篩選策略，獲得性狀優(yōu)良的目標(biāo)菌株。但其分子機(jī)制在很大程度上是未知的。常用的化學(xué)誘變劑包括亞硝基胍（nitrosoguanidine，NTG）和甲基磺酸乙酯（ethyl methane-sulfonate，EMS），而紫外線也被廣泛用于改變微生物的遺傳物質(zhì)。Hashimoto等［6］利用紫外誘變成功選育出營養(yǎng)缺陷型的二倍體工業(yè)酵母突變體。Rous等［7］利用EMS誘變技術(shù)選育的酵母細(xì)胞，降低了異戊醇等雜醇的生產(chǎn)，使葡萄酒的香氣更為濃郁。

1.1.2 基因組改組

基因組改組主要是利用原生質(zhì)體融合和有性重組實(shí)現(xiàn)基因組間的同源重組［8］，能夠顯著增加菌株的進(jìn)化概率，大幅度縮短菌株的選育周期。與傳統(tǒng)原生質(zhì)體融合不同，基因組改組可以將重組庫中的多個(gè)最佳突變體制備成原生質(zhì)體并對其進(jìn)行遞歸重組，產(chǎn)生多親本雜交后代［9］。有性重組利用減數(shù)分裂機(jī)制，創(chuàng)造一個(gè)用于結(jié)合有利突變的遺傳多樣性文庫。Shi等［10］利用原生質(zhì)體融合介導(dǎo)的基因組改組成功提高了釀酒酵母的耐熱性。Zheng等［11］利用G418和吉?dú)W霉素雙抗性標(biāo)記作為篩選標(biāo)簽，在紫外誘變和兩輪有性重組后，分離得到在乙酸脅迫下具有更好生長和乙醇發(fā)酵性能的突變菌株。

1.1.3 轉(zhuǎn)座子插入誘變

基因缺失分析是確定基因功能的重要技術(shù)。與傳統(tǒng)的基因刪除策略不同，轉(zhuǎn)座子插入誘變利用一個(gè)可移動(dòng)的基因元件——轉(zhuǎn)座子，在基因組規(guī)模上創(chuàng)建一個(gè)突變文庫。Kumar等［12］利用細(xì)菌來源的Tn7系統(tǒng)，通過大規(guī)模穿梭誘變在酵母中生成Tn7插入突變文庫。證明了轉(zhuǎn)座子不僅可以被用作標(biāo)簽來快速鑒定目標(biāo)突變體，還能在全基因組范圍內(nèi)研究酵母的基因功能。Ni等［13］利用轉(zhuǎn)座子插入誘變技術(shù)，成功構(gòu)建了木糖利用效率提升的重組釀酒酵母菌株，并且證明了PHO13和TAL1兩個(gè)基因的表達(dá)與木糖特異性生長相關(guān)。

1.1.4 全局轉(zhuǎn)錄機(jī)制工程gTME

細(xì)胞在面對內(nèi)部和外界的刺激時(shí)，通過轉(zhuǎn)錄因子可以迅速調(diào)控成百上千個(gè)基因的表達(dá)水平，即轉(zhuǎn)錄因子對基因表達(dá)具有全局性影響，能夠在全局范圍內(nèi)引發(fā)基因組的轉(zhuǎn)錄重排。基于此，全局轉(zhuǎn)錄機(jī)制工程（global transcription machinery engineering，gTME）通過易錯(cuò)PCR對全局轉(zhuǎn)錄組的關(guān)鍵蛋白（如TFIID組分）進(jìn)行定向進(jìn)化，使細(xì)胞能在轉(zhuǎn)錄水平上產(chǎn)生全基因組規(guī)模的多樣性。Alper等［14］將TATA結(jié)合蛋白SPT15和TATA結(jié)合蛋白相關(guān)因子TAF25進(jìn)行突變，最佳突變體（SPT15含有3個(gè)氨基酸突變）的乙醇生產(chǎn)率提高了70%。此外，gTME結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析（如RNAseq）可以深入了解基因型與表型的相關(guān)性，對菌株的進(jìn)一步改良具有很強(qiáng)的指導(dǎo)價(jià)值。

1.1.5 重組酶介導(dǎo)的基因組進(jìn)化

重組酶催化短同源區(qū)域（30～40 bp）的DNA片段交換，可以實(shí)現(xiàn)DNA片段的缺失、重復(fù)、移位和反轉(zhuǎn)等基因組結(jié)構(gòu)變異，是基因組進(jìn)化的重要驅(qū)動(dòng)力之一。Cre（來自噬菌體P1）和FLP（來自釀酒酵母的2μ質(zhì)粒）分別識別loxP位點(diǎn)和FRT位點(diǎn)，是目前普遍使用的兩種重組酶［15-16］。Dymond等［17］利用Cre介導(dǎo)的同源重組建立了一種基于染色體重排和修飾的進(jìn)化方法——SCRaMbLE（synthetic chromosome recombination and modification by LoxP-mediated evolution）。首先合成酵母染色體時(shí)在每個(gè)非必需基因后添加loxP位點(diǎn)，通過表達(dá)Cre重組酶實(shí)現(xiàn)多個(gè)loxP位點(diǎn)之間的隨機(jī)重組，以創(chuàng)建隨機(jī)的遺傳多樣性文庫。利用SCRaMbLE技術(shù)，經(jīng)過5個(gè)迭代循環(huán)和篩選，類胡蘿卜素的產(chǎn)量提高了38.8倍［18］。

1.1.6 實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性進(jìn)化與逆向代謝工程

實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性進(jìn)化是指在實(shí)驗(yàn)室中通過施加人為干擾及控制微生物生長環(huán)境推動(dòng)生物體生長和繁殖的進(jìn)化過程。適應(yīng)性進(jìn)化可以在分批培養(yǎng)或連續(xù)培養(yǎng)中進(jìn)行，已廣泛應(yīng)用于野生型和工程酵母菌株的系統(tǒng)性改造。例如，適應(yīng)性進(jìn)化可以提高纖維素中的纖維二糖［19］和木糖［20］以及褐藻中的甘露醇和4-脫氧-L-赤式-5-己酮糖糖醛酸（DEHU）等可再生糖的利用率［21］；也可用于提高釀酒酵母對高濃度乙醇［22］、有機(jī)酸［23-24］、松柏醛［25］和高溫［26］的耐受性。

由于高通量測序和基因組編輯技術(shù)的發(fā)展，基于全基因組突變分析的逆向代謝工程成為研究熱點(diǎn)［27］。Nielsen課題組［26］通 過 適應(yīng)性進(jìn)化篩選得到在培養(yǎng)溫度≥40℃時(shí)細(xì)胞生長和乙醇產(chǎn)量提高的酵母菌株，并通過全基因組測序、全基因組基因表達(dá)和代謝流分析發(fā)現(xiàn)，甾醇組成變化（ERG3基因突變）是提高酵母耐熱性的分子機(jī)制。Jin課題組［28］通過構(gòu)建全基因組突變文庫，在高濃度乙醇條件下篩選得到與乙醇耐受性 相 關(guān) 的4個(gè) 基 因MSN2、DOG1、HAL1和INO1，過表達(dá)這4個(gè)基因均可顯著提高釀酒酵母對乙醇的耐受性。

1.2 可示蹤的基因組進(jìn)化

與隨機(jī)突變不同，靶向基因組編輯可以通過可追蹤的方式進(jìn)行全面的大規(guī)?；蚪M修飾。結(jié)合CRISPR/Cas誘導(dǎo)的雙鏈斷裂和同源重組修復(fù)（HDR），可以實(shí)現(xiàn)酵母的高效基因組編輯。另外，寡核苷酸芯片和二代測序技術(shù)的發(fā)展，不僅能夠快速創(chuàng)建大規(guī)?；蚪M突變文庫，還能夠快速和精確地定位引入的遺傳修飾，確定基因型-表型關(guān)系及其分子機(jī)制。本節(jié)將介紹近年來基于釀酒酵母基因組水平的半理性進(jìn)化技術(shù)的發(fā)展，包括酵母寡核苷酸介導(dǎo)的基因組工程（YOGE）、更加精確高效的寡核苷酸整合技術(shù)eMAGE、RNAi輔助基因組進(jìn)化方法（RAGE）及基于CRISPR/Cas的可追蹤的基因組進(jìn)化方法CHAnGE、MAGIC和MAGESTIC技術(shù)（表1）。

表1 釀酒酵母基因組進(jìn)化策略Tab.1 Genome evolution strategies for S.cerevisiae

1.2.1 YOGE（yeast oligo-mediated genome engineering）

釀酒酵母因其高效的同源重組機(jī)制而具有強(qiáng)大的基因編輯能力，但通常需要較長的同源片段，隨著同源臂長度的降低，編輯效率也會(huì)顯著下降。因此，利用較短的單鏈寡核苷酸片段在酵母中實(shí)現(xiàn)高效的基因編輯成為研究熱點(diǎn)。盡管在一些微生物中已能利用寡核苷酸介導(dǎo)的基因重組對基因組進(jìn)行定點(diǎn)突變［36-37］，但在酵母中的低重組效率限制其在酵母基因組進(jìn)化中的應(yīng)用。Church課題組［29］成功開發(fā)了一種在釀酒酵母中由單鏈寡核苷酸介導(dǎo)重組的方法，稱為酵母寡核苷酸介導(dǎo)的基因組工程（YOGE）。通過敲除酵母中錯(cuò)配修復(fù)相關(guān)基因MLH1和MSH2，過表達(dá)DNA重組酶突變體Rad51（K342E）和Rad54蛋白，并通過對寡核苷酸長度、寡核苷酸加入量以及轉(zhuǎn)化效率優(yōu)化后，在3種不同的釀酒酵母（VL6-48、CEN.PK113-7D和VTT C-68059）中成功對基因組進(jìn)行了修飾。并且YOGE可以進(jìn)行迭代操作，每輪可產(chǎn)生105個(gè)細(xì)胞的基因組文庫，對基因組進(jìn)行多重修復(fù)。但是與大腸桿菌（超過30%）相比，YOGE的等位基因替換頻率只提高到約0.2%～2%，寡核苷酸片段整合效率仍然較低，在釀酒酵母基因組進(jìn)化中的應(yīng)用比較有限。

1.2.2 eMAGE（eukaryotic multiplex automated genome engineering）

鑒于YOGE的等位基因替換頻率較低，Isaacs教授［30］構(gòu)建了一種更加精確和高效的寡核苷酸整合技術(shù)eMAGE。與YOGE不同的是，eMAGE并不依賴DNA重組酶介導(dǎo)的同源重組，而是在DNA復(fù)制起始階段形成復(fù)制叉后，由ssDNA退火蛋白（SSAP）介導(dǎo)在后隨鏈上退火合成寡核苷酸，并且利用羥基脲（HU）減慢復(fù)制叉速度進(jìn)一步提高等位基因替換頻率。研究表明，靶序列與復(fù)制起點(diǎn)的緊密接近以及URA3標(biāo)記的共選擇可以有效提高eMAGE的編輯效率。最后，通過寡核苷酸長度或濃度等參數(shù)優(yōu)化，一次轉(zhuǎn)化后能整合12個(gè)寡核苷酸片段，實(shí)現(xiàn)60個(gè)位點(diǎn)靶向突變。將一個(gè)復(fù)雜的寡核苷酸池進(jìn)行迭代轉(zhuǎn)化，可以快速產(chǎn)生>105的基因組多樣性組合。與YOGE相比，eMAGE提高了編輯效率，但這需要依賴于靶序列與復(fù)制起點(diǎn)的緊密接近以及URA3標(biāo)記的共同選擇，在全基因組規(guī)模進(jìn)化的應(yīng)用還有待進(jìn)一步研究。

1.2.3 RAGE（RNAi-assisted genome evolution）

圖2 基于RNAi的釀酒酵母自動(dòng)化多重基因組進(jìn)化技術(shù)［31-32］（a）酵母RNAi工作原理，核酸內(nèi)切酶Dicer切割雙鏈RNA（dsRNA）生成短干擾RNAs（siRNA），siRNA與效應(yīng)蛋白Argonaute形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體RISC，siRNA反義鏈與靶標(biāo)mRNA結(jié)合，指導(dǎo)Dicer干擾靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄；（b）基于RNAi機(jī)制構(gòu)建全基因組規(guī)模調(diào)控文庫，在組成型啟動(dòng)子下定向克隆全長的cDNA文庫，有義和反義構(gòu)型分別引起目標(biāo)基因的過表達(dá)或敲降；（c）基于RNAi的多重基因組突變方法，編碼各種遺傳修飾的基因調(diào)節(jié)部分的側(cè)翼是同源δ序列，用于迭代和多重整合到重復(fù)的基因組序列。為了使CRISPR/Cas能進(jìn)行高效且無需選擇的δ整合，將Cas9表達(dá)盒整合到含有RNAi機(jī)制的酵母菌株中Fig.2 Scheme of automated RNAi-assisted genome evolution in yeast(a)RNAi mechanism in yeast.The double-stranded RNA(dsRNA)is digested by the endonuclease Dicer into short interference RNA(siRNA),which binds to the effector protein Argonaute to form the RNA-induced silencing complex(RISC).The non-sense strand of siRNA binds to the target mRNA,leading to the degradation and interference of the transcription of the target gene.(b)Construction of a genome-wide modulation part library in the yeast strain with the reconstituted RNAi machinery.Full-length cDNA library was directionally cloned under the control of a constitutive promoter.The sense and anti-sense configurations resulted in genetic overexpression and knockdown,respectively.(c)RNAi-assisted multiplex genomic mutations in yeast.Gene modulation parts were flanked by homologous arms for iterative and multiplexδintegration into the repetitive genomic sequences.To enable efficient and selection-freeδintegration,a Cas9 expression cassette was integrated into the RNAi harboring yeast strain

RNA干 擾（RNA interference，RNAi）是 一種由雙鏈RNA引發(fā)的基因沉默途徑，存在于多種真核生物中，但釀酒酵母缺乏天然的RNAi機(jī)制。有研究報(bào)道，通過異源表達(dá)芽殖酵母的RNAi相關(guān)蛋白Ago1和Dcr1，在釀酒酵母中成功重構(gòu)了RNAi途徑［38］，這使得能夠利用RNAi篩選來快速了解和改造工程酵母中的復(fù)雜表型［圖2（a）］。隨后，Si等［31］開發(fā)了釀酒酵母中RNAi輔助的基因組進(jìn)化方法RAGE。在CEN.PK2-1c中引入RNAi途徑后，根據(jù)酵母基因組DNA片段構(gòu)建了雙鏈RNA庫，并利用該RNA庫篩選得到Y(jié)KU70（與端粒酶功能缺失相關(guān)的基因）突變的兩個(gè)已知和三個(gè)未知的抑制基因。同時(shí)經(jīng)過3輪迭代的RNAi篩選，對3個(gè)基因PTC6、YPRP84W和tRNAVal（AAC）同 時(shí) 敲 降 后，顯著改善了釀酒酵母對乙酸的耐受性。Xiao等［39］利用RNAi全基因組進(jìn)化，發(fā)現(xiàn)通過下調(diào)SIZ1基因的表達(dá)水平，可以顯著提高釀酒酵母的糠醛耐受性。在RNAi基因組進(jìn)化的基礎(chǔ)上，Si等［32］又開發(fā)了釀酒酵母自動(dòng)化多重基因組進(jìn)化技術(shù)。根據(jù)酵母基因組構(gòu)建包括基因過表達(dá)和基因下調(diào)的全長cDNA文庫，其中基因過表達(dá)調(diào)控通過全長cDNA的表達(dá)實(shí)現(xiàn)，基因下調(diào)調(diào)控通過全長反義RNA的轉(zhuǎn)錄（RNAi）實(shí)現(xiàn)［圖2（b）］。在CRISPR/Cas的幫助下，通過δ整合的方式將同源供體（donor）整合到酵母基因組上［圖2（c）］，并利用自動(dòng)化平臺進(jìn)行多輪迭代基因組進(jìn)化提高釀酒酵母乙酸耐受性，最后篩選到的菌株在1.1%乙酸濃度下，4 d內(nèi)可將20 g/L葡萄糖轉(zhuǎn)化為5.9 g/L乙醇，且整個(gè)篩選過程在一個(gè)月內(nèi)就能完成。

1.2.4 CHAnGE（CRISPR/Cas9-and homology-directedrepair-assisted genome-scale engineering）

2014年，Bao等［40］構(gòu)建了HI-CRISPR（homologyintegrated CRISPR-Cas）系統(tǒng)。該系統(tǒng)在質(zhì)粒pCRCT上同時(shí)表達(dá)釀膿鏈球菌Cas9突變體（iCas9），整合同源臂的crRNA和tracrRNA，其中同源臂刪去了靶標(biāo)序列8 bp，造成靶標(biāo)基因移碼而喪失功能。利用HI-CRISPR，在釀酒酵母中同時(shí)敲除3個(gè)基因，最高效率可達(dá)100%。在此基礎(chǔ)上，他們又提出一種CRISPR/Cas9和同源定向修復(fù)（HDR）輔助的全基因組進(jìn)化方法CHAnGE［33］，可以實(shí)現(xiàn)對釀酒酵母基因組精確且可追蹤的編輯。首先他們在單個(gè)寡核苷酸上同時(shí)編碼guide RNA（gRNA）和同源重組模板（刪除靶標(biāo)序列8 bp），靶向酵母基因組6459個(gè)開放閱讀框（ORFs）構(gòu)建不同的CHAnGE cassette，其中每個(gè)ORF又設(shè)計(jì)了4個(gè)不同的gRNA。將這些寡核苷酸在芯片上合成，并組裝到質(zhì)粒pCRCT上構(gòu)建CHAnGE質(zhì)粒庫，再轉(zhuǎn)入釀酒酵母細(xì)胞后可進(jìn)行全基因組進(jìn)化。而且每個(gè)CHAnGE cassette上帶有獨(dú)特的DNA條形碼，利用二代測序可以對進(jìn)化后的突變體進(jìn)行追蹤。該方法能使超過98%的靶序列被有效編輯，平均效率為82%。利用CHAnGE方法對釀酒酵母全基因組一輪進(jìn)化后，在5 mmol/L糠醛濃度下篩選出與糠醛耐受性相關(guān)的3個(gè)靶點(diǎn)SIZ1、SAP30和UBC。在SIZ1敲除菌基礎(chǔ)上進(jìn)行第2輪進(jìn)化，在10 mmol/L糠醛濃度下篩選到能提高糠醛耐受性的靶點(diǎn)LCB3，但該靶點(diǎn)需要SIZ1的協(xié)同作用，單獨(dú)敲除對提高糠醛耐受性沒有明顯效果。同時(shí)，CHAnGE也增強(qiáng)了酵母的乙酸耐受性，與野生型相比提高了20倍。

1.2.5 MAGIC（multi-functional genome-wide CRISPR system）

利用CRISPR/Cas技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)基因敲除，而在核酸酶失活的Cas蛋白（dCas）上融合表達(dá)激活域或抑制域可以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄激活和抑制［41］。2017年，Lian等［42］開發(fā)了三功能CRISPR體系（CRISPRAID），可以在一個(gè)細(xì)胞內(nèi)同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄抑制以及基因敲除。其中dLbCpf1-VP用于轉(zhuǎn)錄激活（CRISPRa），dSpCas9-RD1152用于轉(zhuǎn)錄抑制（CRISPRi），SaCas9用于基因敲除（CRISPRd）。利用CRISPR-AID和寡核苷酸芯片技術(shù)，Lian等［34］又發(fā)展了多功能全基因組進(jìn)化技術(shù)MAGIC（圖3），構(gòu)建了最全面最多樣化的酵母基因組文庫。根據(jù)酵母基因組對基因敲除、轉(zhuǎn)錄激活和轉(zhuǎn)錄抑制分別設(shè)計(jì)不同的gRNA，構(gòu)建基因敲除、轉(zhuǎn)錄激活和轉(zhuǎn)錄抑制3個(gè)質(zhì)粒庫，將這3個(gè)質(zhì)粒庫同時(shí)轉(zhuǎn)入釀酒酵母中，通過高通量篩選實(shí)現(xiàn)基因組進(jìn)化，而gRNA可以作為獨(dú)特的基因條形碼，可通過二代測序進(jìn)行追蹤。利用MAGIC技術(shù)，他們鑒定了復(fù)雜表型（糠醛耐受性和蛋白表面展示）一些之前未知的遺傳決定因素。比如在5 mmol/L糠醛濃度下除了篩選到和糠醛耐受性相關(guān)的已知靶點(diǎn)SIZ1和SAP30，還篩選到了之前未發(fā)現(xiàn)的新的靶點(diǎn)SLX5、NUP133、GPI17和UME1。在SIZ1基因表達(dá)水平下調(diào)的菌株基礎(chǔ)上進(jìn)行第2輪進(jìn)化，一些與線粒體功能相關(guān)的靶點(diǎn)MRPL32、NAT1等被發(fā)現(xiàn)可以提高糠醛耐受性，但這些靶點(diǎn)依賴SIZ1基因的下調(diào)。第3輪進(jìn)化在SIZ1基因表達(dá)水平下調(diào)及NAT1基因表達(dá)水平激活的菌株上進(jìn)行，發(fā)現(xiàn)PDR1基因表達(dá)水平的下調(diào)可以進(jìn)一步提高糠醛耐受性。最后經(jīng)過3輪進(jìn)化的酵母菌能在17.5 mmol/L糠醛濃度下，兩天內(nèi)消耗掉大部分的葡萄糖（初始濃度20 g/L），且乙醇的最終濃度與對照菌株相當(dāng)，說明該工程酵母菌株的中心代謝并沒有明顯改變。

圖3 MAGIC用于全基因組基因型-表型關(guān)系研究［34，42］（a）使用三種正交的CRISPR蛋白開發(fā)CRISPR-AID體系，其中CRISPRa由核酸酶缺陷的CRISPR蛋白與激活域融合（dLbCpf1-VP）實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄激活，CRISPRi由核酸酶缺陷的突變體與抑制域融合（dSpCas9-RD1152）實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄抑制，CRISPRd由具有催化活性的CRISPR蛋白（SaCas9）實(shí)現(xiàn)基因敲除；（b）通過DNA芯片寡核苷酸陣列的形式合成用于基因組規(guī)模激活（橙色）、干擾（淺藍(lán)色）和缺失（品紅色）的gRNA文庫，并克隆到相應(yīng)的gRNA表達(dá)質(zhì)粒中。通過將質(zhì)粒文庫轉(zhuǎn)入CRISPR-AID整合的酵母菌株中構(gòu)建MAGIC文庫，通過高通量篩選或者生長富集，并結(jié)合二代測序分析富集的gRNA序列。MAGIC可用于更好地理解、設(shè)計(jì)和改造復(fù)雜表型Fig.3 MAGIC for genome-wide mapping genotype-phenotype relationships［34，42］(a)Development of CRISPR-AID using three orthogonal CRISPR proteins,a nuclease-deficient CRISPR protein fused with an activation domain(dLbCpf1-VP)for CRISPRa,a nuclease-deficient mutant fused with a repression domain(dSpCas9-RD1152)for CRISPRi,and a catalytically active CRISPR protein(SaCas9)for CRISPRd.(b)Guide sequences for genome-wide activation(orange),interference(light blue),and deletion(magenta)were synthesized as arrayed oligos on DNA chip and cloned into the corresponding gRNA expression plasmids.The transformation of the pooled plasmid libraries into the CRISPR-AID integrated yeast strain resulted in the construction of the MAGIC library.The MAGIC library was subject to growth enrichment or high throughput screening,and the corresponding enrichment or depletion of guide sequences were profiled using next-generation sequencing.MAGIC can be employed to better understand and engineer complex phenotypes

1.2.6 MAGESTIC（multiplexed accurate genome editing with short，trackable，integrated cellular barcodes）

Steinmetz課題組［35］在CRISPR/Cas9技術(shù)的基礎(chǔ)上開發(fā)了MAGESTIC技術(shù)，利用該技術(shù)可以在釀酒酵母體內(nèi)實(shí)現(xiàn)多重精確的、可追蹤的、基因組整合條形碼的基因組編輯技術(shù)。利用寡核苷酸芯片技術(shù)合成設(shè)計(jì)含gRNA和同源片段的寡核苷酸，質(zhì)粒組裝后攜帶有一個(gè)短的、獨(dú)特的31mer DNA條形碼。同時(shí)，質(zhì)粒上表達(dá)另一個(gè)gRNA（guide X），可以同時(shí)靶向該質(zhì)粒和酵母基因組基因FCY1兩側(cè)，使質(zhì)粒線性化并將條形碼整合到FCY1位點(diǎn)。通過基因組條形碼整合，可防止質(zhì)粒條形碼不穩(wěn)定而丟失的現(xiàn)象，并實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的表型分型。而設(shè)計(jì)的gRNA可以指導(dǎo)靶標(biāo)位點(diǎn)的準(zhǔn)確編輯，可以對整個(gè)基因組進(jìn)行編輯。研究表明，LexA-Fkh1p蛋白融合表達(dá)能招募更多供體DNA至DNA雙鏈斷裂位點(diǎn)，編輯效率可提高5倍以上。利用MAGESTIC技術(shù)對必需基因SEC14進(jìn)行了飽和編輯并鑒定出對抑制脂質(zhì)信號傳導(dǎo)至關(guān)重要的氨基酸Y111和Y122，生成了Sec14p 102～137區(qū)域的氨基酸與抑制劑相互作用的完整功能圖。通過gRNA及同源模板的設(shè)計(jì)，MAGESTIC技術(shù)可以對上百萬個(gè)細(xì)胞進(jìn)行高通量基因編輯。

2 釀酒酵母基因組進(jìn)化工程的實(shí)際應(yīng)用

基因組進(jìn)化已在不同領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，比如拓寬底物的利用范圍、增強(qiáng)細(xì)胞的耐受性、提高生產(chǎn)速率和產(chǎn)物濃度等等。本節(jié)將討論近年來在基因組水平上使用定向進(jìn)化方法改善釀酒酵母細(xì)胞工廠的示例。

2.1 拓寬底物利用范圍

出于環(huán)境和能源安全的考慮，人們對利用可再生原料（如木質(zhì)纖維素和大型藻類）生產(chǎn)燃料和化學(xué)品的工程微生物越來越感興趣。由于底物的利用可以很容易地與細(xì)胞生長相耦合，便于建立高通量篩選方法，因此基因組進(jìn)化已被廣泛地用于提高釀酒酵母對不同底物的利用能力和利用效率。

作為地球上最豐富的生物材料，木質(zhì)纖維素生物質(zhì)是可再生燃料和化學(xué)品生產(chǎn)中最有希望的原料之一。目前己糖（如葡萄糖）可以被大多數(shù)微生物有效發(fā)酵，而戊糖（主要是木糖和阿拉伯糖，占總碳水化合物的30%以上）的利用存在很多技術(shù)瓶頸，其利用效率較六碳糖低得多。基因組進(jìn)化使構(gòu)建高效的木糖發(fā)酵酵母菌株成為可能，Kim等［20］在含木糖的培養(yǎng)基中進(jìn)行了適應(yīng)性進(jìn)化，進(jìn)化菌株的全基因組測序結(jié)果以及后續(xù)研究表明，PHO13的功能缺失在有效利用木糖方面起著主導(dǎo)作用。

盡管利用基因組進(jìn)化策略已經(jīng)成功構(gòu)建高效利用木糖的酵母菌株，但葡萄糖抑制現(xiàn)象的存在導(dǎo)致發(fā)酵生產(chǎn)率較低，因此希望設(shè)計(jì)一種能夠同時(shí)高效利用所有碳源以提高發(fā)酵生產(chǎn)率的平臺菌株。在之前的研究中，通過引入纖維糊精轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和β-葡萄糖苷酶實(shí)現(xiàn)纖維二糖的胞內(nèi)水解被證明是緩解葡萄糖阻抑的有效策略［43］，因?yàn)橹饾u釋放的葡萄糖被迅速消耗，使得酵母菌株可以同時(shí)消耗纖維二糖和木糖。同時(shí)，纖維素水解產(chǎn)物中普遍存在高濃度乙酸，由于其對釀酒酵母有細(xì)胞毒性而大大降低了糖化合物的生物轉(zhuǎn)化率。有研究發(fā)現(xiàn)引入乙酸鹽還原途徑能平衡細(xì)胞氧化還原電位，實(shí)現(xiàn)原位解毒，使得木糖和乙酸鹽可以同時(shí)轉(zhuǎn)化為乙醇，獲得更高的產(chǎn)率［44］。最后，Wei等［45］將這兩種策略結(jié)合起來，在適應(yīng)性進(jìn)化得到的木糖發(fā)酵酵母基礎(chǔ)上，成功構(gòu)建了一株可以同時(shí)高效利用纖維二糖、木糖和乙酸鹽的釀酒酵母菌株（圖4）。

圖4 同時(shí)利用木質(zhì)纖維素碳源，如纖維二糖、木糖和乙酸的酵母菌株的構(gòu)建XR—木糖還原酶；XDH—木糖醇脫氫酶；ACS—乙酰輔酶A合成酶；AADH—乙?；胰┟摎涿?；ADH—醇脫氫酶Fig.4 Construction of a recombinant yeast strain for simultaneous utilization of lignocellulosic carbons,such as cellobiose,xylose,and acetateXR—xylose reductase;XDH—xylitol dehydrogenase;ACS—acetyl-CoA synthetase;AADH—acetylating acetaldehyde dehydrogenase;ADH—alcohol dehydrogenase

2.2 提高產(chǎn)物合成水平

以高濃度和高產(chǎn)率形成所需產(chǎn)物是大多數(shù)生物技術(shù)過程的最終目標(biāo)。但是在許多情況下，產(chǎn)物的形成不易與細(xì)胞生長耦聯(lián)，甚至損害細(xì)胞生長。這意味著普遍適用于提高產(chǎn)量的高通量篩選方法并不容易獲得，因此可以將基因組進(jìn)化和代謝工程結(jié)合以提高產(chǎn)量和生產(chǎn)率。

在某些情況下，可以利用產(chǎn)物的特性來開發(fā)與細(xì)胞生長耦聯(lián)相關(guān)的基因組進(jìn)化策略。例如，利用類胡蘿卜素的抗氧化特性，以過氧化氫作為選擇壓力，通過基因組進(jìn)化最終使類胡蘿卜素的產(chǎn)量增加了3倍（從6 mg/g干細(xì)胞重量增加到18 mg/g干細(xì)胞重量）［46］。與此類似，采用丙烯醛作為選擇壓力，通過基因組進(jìn)化可以提高進(jìn)化菌株中谷胱甘肽的積累水平，與出發(fā)菌株相比提高了3.3倍，達(dá)到了接近6%細(xì)胞干重的谷胱甘肽含量［47］。

由于釀酒酵母存在葡萄糖固有的發(fā)酵代謝，阻礙了除乙醇以外的其他化學(xué)品的生產(chǎn)。近年來，微生物脂肪酸生物合成因其在生產(chǎn)油性化學(xué)品和生物燃料中的潛在用途而備受關(guān)注。其中，游離脂肪酸（FFA）是制造洗滌劑、潤滑劑、化妝品和藥物成分的理想原料。Yu等［48］通過模擬產(chǎn)油酵母的代謝途徑對釀酒酵母進(jìn)行了大規(guī)模的代謝重編程，最佳菌株的FFA濃度為33.4 g/L，是微生物發(fā)酵中目前報(bào)道的最高水平。又通過實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化進(jìn)一步消除了FFA高產(chǎn)菌株中的乙醇發(fā)酵，從而成功將釀酒酵母進(jìn)化為產(chǎn)油酵母（圖5）?；蚪M測序和代謝特征表明丙酮酸激酶突變對于平衡糖酵解和細(xì)胞生長至關(guān)重要。最近，Zhu等［49］通過在蛋白質(zhì)/途徑/基因組水平上對酵母進(jìn)行多維工程設(shè)計(jì)，大大提高了中鏈脂肪酸（MCFA）的產(chǎn)量，是最經(jīng)典的代謝工程與進(jìn)化工程相結(jié)合的實(shí)例之一。他們首先對FAS酶進(jìn)行工程改造，然后通過定向進(jìn)化得到了Tpo1 M49突變體和ZWE03抗性菌株，二者分別賦予了細(xì)胞對C10和C8脂肪酸的耐受性，最后，選用高耐受性菌株ZWE03進(jìn)行一系列的代謝途徑改造，最終進(jìn)化菌株ZWE37的MCFA產(chǎn)量為1.39 g/L，與出發(fā)菌株相比，其濃度提高了250倍以上。

圖5 高效生產(chǎn)FFA酵母菌株的構(gòu)建［48］（野生型釀酒酵母中，中心碳代謝是“葡萄糖轉(zhuǎn)化為乙醇”；高產(chǎn)脂肪酸釀酒酵母中，為了實(shí)現(xiàn)“葡萄糖轉(zhuǎn)化為油”的代謝模型，建立了FFA生產(chǎn)的有效途徑；產(chǎn)油釀酒酵母中，通過適應(yīng)性進(jìn)化，酒精發(fā)酵成功地重新編程為純脂肪酸合成）PPP—磷酸戊糖途徑；TCA—三羧酸循環(huán)；FFA—游離脂肪酸Fig.5 Construction of yeast cell factories for an efficient production of FFA［48］(In wild-type yeast,the major carbon metabolism is to drive ethanol fermentation from glucose.In the fatty acid-overproducing yeast,metabolic engineering strategies were employed to establish efficient biosynthetic pathway from glucose to fatty acid.In the lipogenesis yeast,genome evolution was performed to completely reprogram the cellular metabolism from alcohol fermentation to fatty acid biosynthesis)PPP—pentose phosphate pathway;TCA—tricarboxylic acid;FFA—free fatty acid

2.3 改善細(xì)胞屬性

由于工業(yè)生物技術(shù)過程中生產(chǎn)條件非常苛刻，所以需要?jiǎng)?chuàng)建能夠抵抗多種壓力的微生物細(xì)胞工廠?？鼓嫘缘姆肿訖C(jī)制十分復(fù)雜，難以通過純理性設(shè)計(jì)來構(gòu)建抗逆性菌株，因而基因組進(jìn)化是個(gè)更為有效的策略。目前，基因組進(jìn)化已經(jīng)廣泛用于提高工業(yè)釀酒酵母菌株的乙醇［50-51］、長鏈烷烴［52］以及噴氣燃料的耐受性［53］。

基于CRISPR的基因組進(jìn)化技術(shù)可以在不同菌株背景下構(gòu)建全基因組突變體，與傳統(tǒng)的基因組規(guī)模工程策略相比，其針對性更強(qiáng)、突變范圍更廣。以糠醛耐受性為例，RAGE通過敲降或缺失SIZ1基因可顯著提高糠醛耐受性［39］，但是用5 mmol/L糠醛進(jìn)行一輪篩選后未能鑒定出其他靶標(biāo)；CHAnGE將SIZ1、SAP30、UBC和LCB3鑒定為糠醛耐受性的重要基因［33］，但是在10 mmol/L糠醛中進(jìn)行兩輪篩選后無法獲得其他更多的靶標(biāo)；而MAGIC在15 mmol/L糠醛中進(jìn)行第3輪篩選后仍能繼續(xù)鑒定其他與糠醛耐受性相關(guān)的遺傳決定因素［34］。同樣地，在10 mmol/L糠醛中進(jìn)行兩輪進(jìn)化篩選，MAGIC工程菌株（SIZ1i-NAT1a）的性能要優(yōu)于CHAnGE工程菌株（SIZ1d-LCB3d）。這也表明，MAGIC不僅確定了更多的糠醛耐受性遺傳決定因素，而且能構(gòu)建更多的糠醛耐受性菌株。

除了在工業(yè)生物技術(shù)過程中耐受性的應(yīng)用外，基因組進(jìn)化還可用于細(xì)胞營養(yǎng)需求相關(guān)的改造。生物素在所有生物中都起著重要作用，但并非所有生物都能合成這種維生素。因此，通常將這種昂貴的維生素添加到培養(yǎng)基中，這極大增加了生產(chǎn)成本。有研究證明在釀酒酵母CEN.PK113-7D中，通過實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性進(jìn)化實(shí)現(xiàn)了快速的非生物素依賴性生長［54］。原始的釀酒酵母菌株在沒有生物素添加的情況下，其生長非常緩慢（μ<0.01 h-1），通過實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性進(jìn)化在無生物素的培養(yǎng)基中獲得了生長速率提高了32倍的突變酵母菌株。全基因組重測序結(jié)果表明，BIO1基因的擴(kuò)增（40倍）以及膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因TPO1和PDR12的突變是提高非生物素依賴生長速率的決定性因素。進(jìn)化菌株可以在廉價(jià)的培養(yǎng)基上快速生長，有利于降低生產(chǎn)成本、工藝復(fù)雜性和發(fā)酵過程中的污染風(fēng)險(xiǎn)。

3 總結(jié)與展望

基于CRISPR系統(tǒng)等最新基因組編輯技術(shù)的全基因組規(guī)模進(jìn)化工程（如CHAnGE和MAGIC）克服了許多傳統(tǒng)菌株改良技術(shù)的局限，大大提高了對生物系統(tǒng)進(jìn)行重新編程的能力。由于具有高通量、高覆蓋率和低成本等特點(diǎn)，這些新型基因組編輯技術(shù)能夠快速生成龐大的組合突變體文庫。因此，目前在大多數(shù)基因組進(jìn)化實(shí)驗(yàn)中，最大的難點(diǎn)在于如何開發(fā)高通量篩選方法，從數(shù)百萬種可能性中尋找最佳突變體。

當(dāng)前，基因組進(jìn)化的成功實(shí)例主要限于生長相關(guān)的表型，如底物利用以及對有毒化合物的耐受性。為了拓展全基因組進(jìn)化的應(yīng)用范圍，基于轉(zhuǎn) 錄 因 子（TFs）［55-56］、G蛋 白 偶 聯(lián) 受 體（GPCRs）［57］、核糖體開關(guān)［58］等的生物傳感器已被整合到全基因組進(jìn)化流程中。例如，基于FapR［55］的丙二酰輔酶A生物傳感器能簡單、快速地監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)丙二酰輔酶A的濃度，將其與全基因組cDNA過表達(dá)文庫結(jié)合使用，獲得了細(xì)胞內(nèi)丙二酰輔酶A水平顯著提高的突變菌株；基于XyIR［56］的生物傳感器用于篩選木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白突變體，獲得了木糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力提高6.5倍的HXT14突變體。此外，通過將產(chǎn)物形成與基本的細(xì)胞過程相結(jié)合，生物傳感器可以進(jìn)一步發(fā)展為基因組規(guī)模的代謝工程和進(jìn)化工程的合成選擇電路。例如，利用芳香族氨基酸響應(yīng)性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)遺傳霉素抗性基因的表達(dá)，可用于篩選高產(chǎn)黏糠酸的酵母突變菌株［59］。

近年來，微流控系統(tǒng)［60-62］和機(jī)器人平臺［51，63］已經(jīng)成為高通量篩選目標(biāo)表型的有效手段。使用微流控液滴（microfluidic droplets）［60］進(jìn)行超高通量篩選可大大提高基因組進(jìn)化的效率。最新的μSCALE［61］（微毛細(xì)管單細(xì)胞分析和熒光提?。├脽晒鉁y定法在微毛細(xì)管陣列內(nèi)快速回收活的陽性細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的并行篩選。此外，實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化可以極大加速微生物基因組規(guī)模的工程設(shè)計(jì)，通過消除人工干預(yù)，有望提高生產(chǎn)率和可靠性。

總之，基因組進(jìn)化是生物系統(tǒng)工程化改造的強(qiáng)大工具，高通量篩選和自動(dòng)化平臺的開發(fā)將加快基因組進(jìn)化過程。另一方面，基因組進(jìn)化與先進(jìn)計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)和人工智能的集成將大大推動(dòng)基因組規(guī)模進(jìn)化工程的發(fā)展，進(jìn)而促進(jìn)基礎(chǔ)生物學(xué)和生物技術(shù)的系統(tǒng)性研究。