細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)在細(xì)胞間通訊中的應(yīng)用及其合成生物學(xué)研究進(jìn)展

李曉萌，姜威，梁泉峰，祁慶生

（山東大學(xué)微生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島266237）

生物體之間能夠進(jìn)行基礎(chǔ)的交流和簡單的信息交換，這是生命存在的標(biāo)志。之前，人們一直認(rèn)為只有多細(xì)胞生物才具備進(jìn)行任何形式信息交流的能力，很少有細(xì)菌能通過特定的、可擴(kuò)散的信號(hào)分子進(jìn)行通訊。隨著對(duì)微生物學(xué)的不斷深入研究，發(fā)現(xiàn)微觀世界的原核生物之間也可以利用不同的“語言”進(jìn)行信息交流，進(jìn)而以類似多細(xì)胞生物的群體模式對(duì)變化的環(huán)境做出不同的響應(yīng)［1］。這種細(xì)胞與細(xì)胞間的通訊工程被稱為群體感應(yīng)（quorum sensing，QS），即細(xì)菌能夠通過同時(shí)響應(yīng)周圍微生物群落的細(xì)胞密度和物種組成的變化來相應(yīng)地改變行為［2-3］。群體感應(yīng)涉及胞外信號(hào)分子的產(chǎn)生、釋放和群體范圍內(nèi)的檢測，這些信號(hào)分子被稱為自體誘導(dǎo)物（autoinducer，AI）。AI的濃度會(huì)隨著細(xì)胞密度的增加而不斷提高，達(dá)到一定的濃度后，可以和胞內(nèi)的受體蛋白相結(jié)合形成受體蛋白復(fù)合體，最終改變基因表達(dá)的整體模式［4］。由群體感應(yīng)控制的過程包括生物發(fā)光、抗生素的合成，固氮基因調(diào)控，致病基因的表達(dá)、細(xì)菌運(yùn)動(dòng)和生物被膜的形成等［5］。利用單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行這些過程，成本高且低效，但利用細(xì)胞群體去進(jìn)行時(shí)會(huì)有相對(duì)較高的效率［6］。已有研究表明，細(xì)菌既可以利用QS進(jìn)行種內(nèi)特異性交流，也可以利用QS感知周圍種群細(xì)菌的數(shù)量來調(diào)控自身的行為，實(shí)現(xiàn)種群間的交流［7-8］。解析群體感應(yīng)系統(tǒng)以及由其介導(dǎo)的跨界信息交流和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，不僅為明確病原菌致病調(diào)控機(jī)理、闡明微生物生態(tài)競爭和動(dòng)態(tài)平衡機(jī)制提供了一個(gè)全新的切入點(diǎn)，同時(shí)也為調(diào)控微生物生態(tài)體系和發(fā)展新的病害防控策略等奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。因此，本文作者中將會(huì)詳細(xì)介紹群體感應(yīng)系統(tǒng)的主要作用、機(jī)制以及群體感應(yīng)系統(tǒng)在合成生物學(xué)中的研究進(jìn)展。

1 自然界細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)及其主要作用機(jī)制

細(xì)菌之間可以通過自身合成信號(hào)分子來實(shí)現(xiàn)種內(nèi)和種間的信息交流，使其能與多細(xì)胞生物一樣，行使單個(gè)細(xì)胞無法完成的功能［9］。到目前為止，發(fā)現(xiàn)的自誘導(dǎo)物信號(hào)分子基本分為3類：N-酰化高絲氨酸內(nèi)酯（N-acylated homoserine lactones，AHLs）類的信號(hào)分子；氨基酸和短肽類物質(zhì)（autoinducing peptides，AIPs），這兩類自體誘導(dǎo)物主要協(xié)助實(shí)現(xiàn)種內(nèi)交流；而第三種信號(hào)分子則是呋喃酰硼酸二酯（furanosyl borate diester，即AI-2型信號(hào)分子），可協(xié)助實(shí)現(xiàn)種間交流［10］。細(xì)菌中常見的群體感應(yīng)系統(tǒng)組成及其調(diào)控的功能可見表1。而根據(jù)細(xì)菌群體發(fā)揮功能作用的不同，可以將細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)分為4種類型：調(diào)控生物發(fā)光、生物被膜形成、孢子形成以及產(chǎn)生毒力的群體感應(yīng)系統(tǒng)。

表1 細(xì)菌典型的群體感應(yīng)系統(tǒng)及其功能Tab.1 Typical QS systems and functions in bacteria

1.1 調(diào)控生物發(fā)光的群體感應(yīng)系統(tǒng)：LuxI/R、AI-2群體感應(yīng)系統(tǒng)

20世紀(jì)60年代，曾有人對(duì)海洋魚類的共生菌——費(fèi)氏弧菌（Vibrio fischeri）的發(fā)光現(xiàn)象進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)費(fèi)氏弧菌定植于夏威夷魷魚的發(fā)光器官內(nèi)，其發(fā)光現(xiàn)象與菌群密度變化有關(guān)［11］。在海水中時(shí)，費(fèi)氏弧菌濃度較低，其周圍的信號(hào)分子濃度也較低，整個(gè)細(xì)菌群體呈黑色。只有當(dāng)細(xì)菌密度達(dá)到一定濃度時(shí)，才會(huì)產(chǎn)生生物發(fā)光現(xiàn)象，這樣會(huì)更有利于與費(fèi)氏弧菌共生的海洋魚類進(jìn)行捕食和躲避天敵等活動(dòng)［12］。作為互利共生的另一方，該海洋魚類也會(huì)為費(fèi)氏弧菌提供一個(gè)優(yōu)越的生活環(huán)境，使其可以利用宿主體內(nèi)豐富的營養(yǎng)物達(dá)到相當(dāng)高的群落密度［13］。目前，以費(fèi)氏弧菌的LuxI/R群體感應(yīng)系統(tǒng)作為革蘭氏陰性菌群體感應(yīng)研究的一個(gè)經(jīng)典模型（圖1）。費(fèi)氏弧菌的生物發(fā)光基因lux基因簇由8個(gè)基因（luxA～E、luxG、luxI和luxR）組成［14］。其群體感應(yīng)系統(tǒng)包括兩個(gè)操縱子luxICDABE、luxR。其中操縱子luxICDABE負(fù)責(zé)編碼自誘導(dǎo)物合成酶基因（luxI）和發(fā)光基因（luxCDABEG）。LuxI合成信號(hào)分子N-3-氧-己酰高絲氨酸內(nèi)酯（3-oxo-C6-HSL，OHHL）。而操縱子luxR負(fù)責(zé)編碼信號(hào)分子受體蛋白LuxR。在細(xì)胞密度較低的情況下，luxI進(jìn)行基礎(chǔ)水平的轉(zhuǎn)錄，隨著細(xì)胞密度增加，OHHL在培養(yǎng)基中不斷積累，在達(dá)到閾值水平后會(huì)與LuxR的自誘導(dǎo)域結(jié)合形成復(fù)合體。然后，LuxR-OHHL復(fù)合物會(huì)結(jié)合到luxI上游的lux啟動(dòng)子區(qū)域（lux盒），啟動(dòng)熒光素酶亞基基因luxICDABEG的表達(dá)［15］，實(shí)現(xiàn)費(fèi)氏弧菌群體的發(fā)光。同時(shí)，會(huì)形成正反饋回路，進(jìn)一步表達(dá)luxI并產(chǎn)生更多的OHHL［16］。

圖1 LuxI/LuxR群體感應(yīng)系統(tǒng)示意圖（以V.fischeri為例）Fig.1 Schematic of LuxI/LuxR quorum sensing system(V.fischeri as an example)

除了LuxI/R群體感應(yīng)系統(tǒng)外，海洋細(xì)菌——夏威夷弧菌（Vibrio harveyi）同時(shí)具有革蘭氏陰性菌和陽性菌群體感應(yīng)的調(diào)控系統(tǒng)以共同調(diào)控生物發(fā)光現(xiàn)象［17］。與其他革蘭氏陰性菌一樣，夏威夷弧菌會(huì)產(chǎn)生信號(hào)分子AHL作為自體誘導(dǎo)物（AI-1），但它的信號(hào)感應(yīng)及傳遞組分則類似革蘭氏陽性菌的雙組分蛋白質(zhì)［18］。夏威夷弧菌還會(huì)產(chǎn)生第2套自體誘導(dǎo)系統(tǒng)AI-2，與其他細(xì)菌中的高絲氨酸內(nèi)酯類自體誘導(dǎo)物不同，是由LuxS蛋白合成，一般作為細(xì)菌種間信息交流的信號(hào)分子［19］。夏威夷弧菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)的具體調(diào)控方式如下：在細(xì)胞密度較低時(shí)，由于缺少AI-1和AI-2，LuxN和LuxQ作為磷酸激酶會(huì)將LuxN磷酸化，隨后將LuxO磷酸化，磷酸化后的LuxO成為活性阻遏蛋白，間接抑制編碼熒光素酶基因luxCDABE的轉(zhuǎn)錄，因此在細(xì)胞密度較低時(shí)夏威夷弧菌不產(chǎn)生熒光。當(dāng)細(xì)菌種群密度達(dá)到一定閾值后，自體誘導(dǎo)物AI-1和AI-2會(huì)分別與LuxN和LuxPQ作用，使其在具備磷酸酶活性后將信息傳遞到磷酸轉(zhuǎn)移蛋白酶LuxU，從而使LuxO去磷酸化成為無活性阻遏蛋白，解除對(duì)luxCDABE的抑制作用，使夏威夷弧菌發(fā)光［20］。與此機(jī)制相似，霍亂弧菌（Vibrio cholerae）也是利用磷酸化-去磷酸化這一復(fù)雜的群體感應(yīng)系統(tǒng)來調(diào)控基因的表達(dá)［21］。

1.2 生物被膜形成的群體感應(yīng)系統(tǒng)：Las/Rhl/喹諾酮群體感應(yīng)系統(tǒng)

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是引起癌癥、艾滋病和囊性纖維化（cystic fibrosis，CF）等疾病的重要條件致病菌，可以從土壤和水中分離得到，通過高絲氨酸內(nèi)酯介導(dǎo)的QS系統(tǒng)調(diào)控其生命活動(dòng)過程［22-23］。銅綠假單胞菌之所以成為一種典型的條件致病菌，主要是因?yàn)樗梢詤f(xié)同釋放毒力因子，包括外蛋白酶、脂肪酶和外毒素等，其中絕大部分毒力因子由群體感應(yīng)調(diào)節(jié)［24］。此外，銅綠假單胞菌經(jīng)常會(huì)黏附于人體組織表面，通過分泌一些脂質(zhì)蛋白和纖維蛋白，將其自身包裹其中形成一個(gè)高度組織化的膜樣聚合物，即生物被膜，從而抵御人體免疫系統(tǒng)以及傳統(tǒng)抗生素的治療［25］。群體感應(yīng)系統(tǒng)會(huì)通過調(diào)控生物被膜結(jié)構(gòu)形成、細(xì)菌黏附以及其從生物被膜上解離并重新定植等過程，進(jìn)而影響銅綠假單胞菌的耐藥性。研究發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌群體形成生物被膜后，耐藥性會(huì)有顯著提高［26］，其機(jī)制很有可能是生物被膜會(huì)阻止抗菌藥物進(jìn)入膜內(nèi)尤其是對(duì)膜內(nèi)較深層的細(xì)菌發(fā)揮作用。

銅綠假單胞菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)包含基于?；呓z氨酸內(nèi)酯的Las、Rhl信號(hào)系統(tǒng)［27］以及基于2-烷基-4（1H）-喹諾酮［2-alkyl-4（1H）-quinolone，AHQ］的喹諾酮信號(hào)系統(tǒng)等［28］，它們共同構(gòu)成了一個(gè)非常復(fù)雜的級(jí)聯(lián)調(diào)控系統(tǒng)。之前通過大量的遺傳學(xué)研究揭示了LasR/I和RhlR/I這兩個(gè)群體感應(yīng)系統(tǒng)，Las和Rhl系統(tǒng)的自誘導(dǎo)分子分別是AHL同系物3-氧十二烷酰高絲氨酸內(nèi)酯［N-（3-oxododecanoyl）-Lhomoserine lactone，3-oxo-C12-HSL］和丁基高絲氨酸內(nèi)酯（N-butanoylhomoserine lactone，C4-HSL）。Las、Rhl系統(tǒng)分別由轉(zhuǎn)錄激活因子lasR、rhlR和信號(hào)合成酶lasI、rhlI組成。通過這兩個(gè)群體感應(yīng)系統(tǒng)的作用，細(xì)菌可以在不同的感染階段表達(dá)不同的毒力因子，提高毒性［29］。而喹諾酮類則包含較多的自誘導(dǎo)分子，2-庚基-3-羥基-4-喹諾酮（2-heptyl-3-hydroxy-4-quinolone，PQS）和其前體2-庚基-3-羥 基-4-喹啉（2-heptyl-3-hydrox-y-4-quinoline，HHQ）就是其中的兩種。在Las系統(tǒng)中，細(xì)胞種群密度較低時(shí)，LasI會(huì)產(chǎn)生較低水平的3-oxo-C12-HSL。隨著種群密度不斷增加達(dá)到一定閾值后，3-oxo-C12-HSL會(huì)與LasR結(jié)合。它們形成的復(fù)合物L(fēng)asR-3-oxo-C12-HSL會(huì)激活很多基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，包括lasB、toxA、rhlR和lasI。當(dāng)復(fù)合物激活lasI后，會(huì)產(chǎn)生一個(gè)積極的正反饋調(diào)節(jié)通路。同時(shí)3-oxo-C12-HSL本身也具有免疫調(diào)節(jié)活性，單獨(dú)的3-oxo-C12-HSL與銅綠假單胞菌的毒力有關(guān)。而當(dāng)復(fù)合物激活rhlR時(shí)，則會(huì)發(fā)生Las和Rhl群體感應(yīng)系統(tǒng)的級(jí)聯(lián)效應(yīng)，而且會(huì)在轉(zhuǎn)錄水平后期控制RhlR的活性。隨后，RhlR會(huì)激活一些生產(chǎn)各種次生代謝物（如氰化氫）相關(guān)基因的表達(dá)。同時(shí)，RhlI/R系統(tǒng)可反饋調(diào)控LasI/R系統(tǒng)的表達(dá)。此外，喹諾酮群體感應(yīng)系統(tǒng)的信號(hào)分子PQS與Las、Rhl系統(tǒng)也存在一個(gè)級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)的關(guān)系。PQS的合成受到LasI的正調(diào)節(jié)和RhlI的負(fù)調(diào)節(jié)，同時(shí)PQS系統(tǒng)可以正調(diào)節(jié)RhlI、LasI的表達(dá)［30］。這3個(gè)系統(tǒng)互相調(diào)控，可以使細(xì)菌更好地適應(yīng)環(huán)境，而且喹諾酮信號(hào)系統(tǒng)對(duì)細(xì)菌自身致病性和環(huán)境適應(yīng)力具備更多一層的控制［31］。

1.3 孢子形成的群體感應(yīng)系統(tǒng)：CSF群體感應(yīng)系統(tǒng)

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是芽孢桿菌科的模式菌株，單個(gè)細(xì)胞呈桿狀，無莢膜，周生鞭毛，可產(chǎn)芽孢。由于其在自然界中廣泛存在，具有耐高溫、耐酸堿和耐擠壓等特性，目前該菌主要作為產(chǎn)酶菌用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生和食品保健等領(lǐng)域［32-33］。在枯草芽孢桿菌群體感應(yīng)系統(tǒng)中主要涉及兩種信號(hào)分子：ComX信息素和感受態(tài)及產(chǎn)孢因子（competence and sporulation factor，CSF）。ComX編碼含有55個(gè)氨基酸殘基的Pre-ComX前導(dǎo)肽，Pre-ComX再經(jīng)異戊二烯轉(zhuǎn)化酶ComQ的處理和修飾后分泌到細(xì)胞膜外［34］。該信息素的活性由ComP/ComA雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)控制，當(dāng)細(xì)菌種群密度達(dá)到閾值后，信息素會(huì)與膜上的相關(guān)受體ComP結(jié)合，激活該酶，促進(jìn)其自我磷酸化；同時(shí)，磷酸化的ComP（ComP~P）會(huì)使磷酸化的ComA（ComA~P）被激活。ComA~P會(huì)直接激活相關(guān)下游基因的表達(dá)，例如激活srfA啟動(dòng)子，誘導(dǎo)枯草芽孢桿菌的亞群分化進(jìn)入感受態(tài)［35-36］。CSF由基因PhrC編碼，是一種物種特異性的群體感應(yīng)分子，使不同菌株的枯草芽孢桿菌之間可以通過群體感應(yīng)來交流。在寡肽通透酶（oligopeptide permease，Opp）的作用下，胞外CSF被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)［37］。當(dāng)胞內(nèi)濃度較低時(shí)，CSF可以促進(jìn)感受態(tài)的發(fā)展，其與磷酸酶RapC結(jié)合并抑制其活性，使磷酸化ComA的水平上調(diào)，促進(jìn)ComS的表達(dá)。伴隨著環(huán)境內(nèi)條件的惡化、營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，胞內(nèi)CSF在達(dá)到一定閾值濃度后會(huì)促進(jìn)細(xì)菌亞群分化進(jìn)入孢子形成階段［38］。

1.4 產(chǎn)生毒力的群體感應(yīng)系統(tǒng)：Agr群體感應(yīng)系統(tǒng)

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一種常見的人類致病菌，也是多種急慢性感染病的病原體，會(huì)分泌大量毒性因子例如毒素、溶血素和酚溶調(diào)控蛋白等。Ji等［39］研究發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌致病基因的表達(dá)受細(xì)菌細(xì)胞密度影響。在Agr群體感應(yīng)機(jī)制的調(diào)控下，自誘導(dǎo)肽作為信號(hào)分子分泌到胞外，通過響應(yīng)一系列下游信號(hào)分子來驅(qū)動(dòng)致病基因的表達(dá)。Agr群體感應(yīng)系統(tǒng)的核心agr操縱子包括AIP的前體肽合成酶AgrD、負(fù)責(zé)編碼加工蛋白的AgrB、編碼組氨酸激酶感應(yīng)器的AgrC和誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)調(diào)節(jié)器AgrA。在這個(gè)群體感應(yīng)系統(tǒng)中，AgrD在正常情況下會(huì)保持一個(gè)較低的表達(dá)量，在AgrB的加工下得到了信號(hào)分子AIP并不斷分泌到胞外。當(dāng)胞外AIP濃度達(dá)到一定閾值后會(huì)激活A(yù)grC，使其發(fā)生自磷酸化并將反應(yīng)調(diào)控子AgrA磷酸化，磷酸化后的AgrA～P會(huì)結(jié)合到agrABCD上游的啟動(dòng)子區(qū)域，形成正反饋，啟動(dòng)agrABCD基因和其他受Agr調(diào)控系統(tǒng)控制基因的表達(dá)［40］，最終實(shí)現(xiàn)目的基因的表達(dá)調(diào)控。

2 參與種內(nèi)細(xì)胞間通訊動(dòng)態(tài)調(diào)控的合成生物學(xué)群體感應(yīng)基因線路

在微生物群體中，細(xì)菌會(huì)受到與其相鄰的同種或不同種細(xì)胞的相互作用以及外界環(huán)境的影響。它們之間長期共生共存，通過不斷進(jìn)化形成了復(fù)雜的信號(hào)分子交流系統(tǒng)。細(xì)菌通過群體感應(yīng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)產(chǎn)生和感應(yīng)化學(xué)信號(hào)分子，以物種復(fù)雜性和種群密度依賴的方式同步調(diào)控一組基因的表達(dá)，使得細(xì)菌群體之間進(jìn)行相互作用和牽制，最終達(dá)到相互適應(yīng)［41-42］。目前，對(duì)群體感應(yīng)系統(tǒng)的研究已相對(duì)透徹，作用機(jī)理也逐漸清晰，其被廣泛應(yīng)用于表征復(fù)雜的胞內(nèi)應(yīng)答機(jī)制和構(gòu)建不同的群體感應(yīng)基因線路，對(duì)于合成生物學(xué)發(fā)展具有深遠(yuǎn)的影響。細(xì)菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)主要分為種內(nèi)細(xì)胞間通訊和種間細(xì)胞間通訊兩大類，目前對(duì)于群體感應(yīng)種內(nèi)細(xì)胞間通訊的研究和綜述相對(duì)較多地集中在生物被膜形成、群體感應(yīng)猝滅以及環(huán)境監(jiān)測等方面，而在構(gòu)建生物計(jì)算工具、調(diào)控種群密度和調(diào)節(jié)代謝流等方面相對(duì)較少。因此，下文將首先著重介紹合成生物學(xué)中撥動(dòng)開關(guān)、生物傳感器和邏輯門近年來在群體感應(yīng)種內(nèi)通訊方面的主要研究成果。

2.1 撥動(dòng)開關(guān)

代謝工程領(lǐng)域的主要目的是利用多基因重組技術(shù)來提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量及生產(chǎn)效率。該領(lǐng)域傳統(tǒng)的改造方式主要是基因敲除和過表達(dá)，但基因敲除可能會(huì)導(dǎo)致菌體的生長狀況下降［43-44］。因此，需要適時(shí)激活和關(guān)閉特定基因的表達(dá)。撥動(dòng)開關(guān)就是解決這一問題的有利工具，其是一大類代謝調(diào)控開關(guān)，可被應(yīng)用到合成基因線路中來提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量［45］。本實(shí)驗(yàn)室Gu等［46］通過抑制蛋白失活、阻斷競爭途徑和過表達(dá)關(guān)鍵酶，將野生型大腸桿菌BW25113的莽草酸酯產(chǎn)量提高到1.73 g/L。然后構(gòu)建了一個(gè)可調(diào)控aroK表達(dá)的撥動(dòng)開關(guān)，發(fā)現(xiàn)重組菌株P(guān)-9中aroK的表達(dá)在生長階段會(huì)維持一個(gè)較高的水平，然后在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間內(nèi)可以通過添加最佳濃度的誘導(dǎo)劑降低表達(dá)水平。最終發(fā)現(xiàn)重組菌株P(guān)-9可以在不添加任何芳香化合物的情況下產(chǎn)生13.15 g/L莽草酸，證明營養(yǎng)缺陷型合成莽草酸鹽的大腸桿菌構(gòu)建成功。

現(xiàn)在，研究者們通過將撥動(dòng)開關(guān)與群體感應(yīng)系統(tǒng)相結(jié)合，嘗試構(gòu)建一系列新的基因線路來達(dá)到改造目的，實(shí)現(xiàn)細(xì)菌群體的種間通訊。有研究表明，群體感應(yīng)通訊系統(tǒng)不僅會(huì)參與微生物致病基因的表達(dá)調(diào)控，也會(huì)直接影響微生物的耐藥性［47-48］。由于分泌抗癌蛋白的沙門菌對(duì)腫瘤具有抑制作用，但非特異性表達(dá)會(huì)對(duì)健康組織造成傷害。因此Swofford等［49］為了構(gòu)建對(duì)腫瘤敏感的基因表達(dá)開關(guān)，避免對(duì)健康組織造成傷害，他們將Lux群體感應(yīng)系統(tǒng)和一個(gè)GFP熒光報(bào)告基因共同整合到非致病性沙門菌中。通過將QS系統(tǒng)和組成型的沙門菌共同注射到荷瘤小鼠體內(nèi)，對(duì)小鼠體內(nèi)蛋白水平的表達(dá)進(jìn)行定量。同時(shí)利用免疫熒光技術(shù)對(duì)腫瘤內(nèi)的細(xì)菌和熒光蛋白GFP進(jìn)行定量定位，發(fā)現(xiàn)新構(gòu)建的開關(guān)能作為一種很有用的癌癥治療工具，其可以很好地對(duì)腫瘤進(jìn)行靶向治療，同時(shí)對(duì)健康組織無任何損害。

Soma等［50］在大腸桿菌中將lux啟動(dòng)子和正反饋回路相結(jié)合，構(gòu)建了一個(gè)合成的Lux系統(tǒng)作為細(xì)胞密度可調(diào)傳感器。研究者利用該系統(tǒng)來觸發(fā)代謝撥動(dòng)開關(guān)（metabolic toggle switch，MTS），通過將兩者整合構(gòu)建了QS-MTS。利用QS-MTS在理想的細(xì)胞密度下，實(shí)現(xiàn)了代謝流從TCA循環(huán)到異丙醇生產(chǎn)的重定向，從而顯著提高了異丙醇的產(chǎn)量。

能夠?qū)崿F(xiàn)自我調(diào)節(jié)和代謝流重新定向的工程菌株可以最大限度提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量，并降低對(duì)發(fā)酵過程的人為監(jiān)控需要。所以研究者投入大量心血去構(gòu)建一種獨(dú)立于通路、誘導(dǎo)和干預(yù)的基因裝置，Gupta等［51］設(shè)計(jì)了QS機(jī)制來調(diào)控pfk-1基因（該基因決定糖酵解和細(xì)胞生長的碳通量）的表達(dá)，從而可根據(jù)所需的時(shí)間和細(xì)胞密度來確定關(guān)閉基因表達(dá)的最佳點(diǎn)。當(dāng)AHL不存在時(shí)，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子EsaR170V將與PesaS結(jié)合。隨著細(xì)胞密度的不斷增加，AHL逐漸積累后會(huì)降低EsaR170V的活性，并關(guān)閉pfk-1基因的表達(dá)。因此，大多數(shù)葡萄糖將會(huì)轉(zhuǎn)移到生產(chǎn)途徑以提高肌醇（myoinositol，MI）產(chǎn)量。

大多數(shù)情況下，研究者都是使用一種單一、常見的策略對(duì)代謝通量路徑進(jìn)行動(dòng)態(tài)調(diào)控。而Doong等［52］將通路無關(guān)策略和通路特異性策略相結(jié)合，構(gòu)建了涉及兩個(gè)動(dòng)態(tài)正交可調(diào)策略的控制機(jī)制，這種機(jī)制可實(shí)現(xiàn)分層調(diào)控，獨(dú)立調(diào)節(jié)兩種不同酶的表達(dá)，從而提高D-葡萄糖醛酸的產(chǎn)量。在達(dá)到AHL濃度閾值后，基于QS系統(tǒng)的通路無關(guān)策略會(huì)將葡萄糖的利用從糖酵解轉(zhuǎn)化為D-葡萄糖醛酸的生產(chǎn)，從而將細(xì)胞從“生長”模式切換到“生產(chǎn)”模式；而通路特異性策略則是以肌醇作為中間代謝物傳感器來實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)自主控制，從而提高D-葡萄糖醛酸的產(chǎn)量。

目前，大多數(shù)關(guān)于QS系統(tǒng)的報(bào)道都依賴于基因表達(dá)的下調(diào)而非上調(diào)，極大限制了其作為調(diào)控代謝通量分子開關(guān)的潛力。Cui等［53］構(gòu)建了基于兩個(gè)天然啟動(dòng)子PabrB（Spo0A-P下調(diào)）和PspoiiA（Spo0A-P上調(diào)）的雙功能模塊化Phr60-Rap60-Spo0A QS系統(tǒng)。通過改變Spo0A-P結(jié)合位點(diǎn)的位置、數(shù)目和序列，構(gòu)建了一個(gè)具有上調(diào)和下調(diào)能力的啟動(dòng)子庫。然后，將雙功能模塊化系統(tǒng)運(yùn)用到枯草芽孢桿菌168中menaquinone-7（MK-7）的生產(chǎn)，通過該動(dòng)態(tài)途徑調(diào)控后MK-7的產(chǎn)量顯著提高40倍。本實(shí)驗(yàn)室Gu等［54］也構(gòu)建了基于Esa-QS系統(tǒng)的雙功能動(dòng)態(tài)開關(guān)，能夠在不同的時(shí)間和間隔上同步基因的上調(diào)和下調(diào)。將該雙功能動(dòng)態(tài)開關(guān)應(yīng)用于5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid，5-ALA）和聚β-羥基丁酸（polyhydroxybutyrate，PHB）的合成后發(fā)現(xiàn)產(chǎn)量分別會(huì)提高6倍和12倍。

以上研究均將QS系統(tǒng)與代謝撥動(dòng)開關(guān)相結(jié)合，在達(dá)到細(xì)胞密度閾值后激活合成線路，從而實(shí)現(xiàn)自誘導(dǎo)代謝狀態(tài)的轉(zhuǎn)變。隨著這一機(jī)制在代謝工程中的應(yīng)用不斷成熟，工程微生物群落和QS誘導(dǎo)的代謝開關(guān)相結(jié)合會(huì)繼續(xù)為合成生物學(xué)做出新的貢獻(xiàn)。

2.2 生物傳感器

隨著人們對(duì)構(gòu)建具有調(diào)控細(xì)胞功能的新型生物元件的興趣日益濃厚，人們開始對(duì)生物計(jì)算領(lǐng)域的創(chuàng)新工具進(jìn)行不斷的探索。而生物傳感器因其易使用、成本低，在相關(guān)的生理環(huán)境條件下能提供實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)的優(yōu)良性能受到了廣泛的關(guān)注［55］。例如，一種不需要蛋白轉(zhuǎn)錄因子參與而直接由核酸感受胞內(nèi)信號(hào)分子或胞外環(huán)境變化的調(diào)控模式，即核糖開關(guān)。其是適體結(jié)構(gòu)域和表達(dá)結(jié)構(gòu)域的組合，可以通過感應(yīng)底物濃度高低實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)［56］。但由于缺乏對(duì)配體和適體結(jié)合方式的正確認(rèn)識(shí)以及合適的篩選方法，所以對(duì)天然核糖體的改造存在一定的困難。本實(shí)驗(yàn)室Pang等［57］提出了N-乙酰神經(jīng)氨酸（NeuAc）核糖開關(guān)在體內(nèi)進(jìn)化和篩選的策略。選擇了一個(gè)高閾值的核糖開關(guān)對(duì)一些途徑和關(guān)鍵酶進(jìn)行優(yōu)化，再以葡萄糖為唯一碳源進(jìn)行試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)N-乙酰神經(jīng)氨酸的最高產(chǎn)量可達(dá)14.32 g/L。

之后，有很多研究發(fā)現(xiàn)生物傳感器與群體感應(yīng)系統(tǒng)相結(jié)合后，可以作為一種新的微生物改造途徑來實(shí)現(xiàn)自誘導(dǎo)代謝狀態(tài)的轉(zhuǎn)變。例如基因工程全細(xì)胞生物傳感器，它是利用細(xì)菌蛋白和通路檢測特定物質(zhì)的有力工具，已被廣泛應(yīng)用于合成生物學(xué)研究中，包括對(duì)群體感應(yīng)分子（quorum sensing molecules，QSMs）的檢測［58］。Raut等［59］構(gòu)建并優(yōu)化了基于哈維弧菌BB170菌株的AI-2全細(xì)胞傳感系統(tǒng)。當(dāng)AI-2進(jìn)入細(xì)胞后會(huì)與LuxP結(jié)合，LuxP在與AI-2結(jié)合時(shí)構(gòu)象會(huì)發(fā)生改變，進(jìn)而啟動(dòng)luxCDABE的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)熒光素酶及其底物的表達(dá)，最終導(dǎo)致生物發(fā)光，依賴熒光素酶產(chǎn)生的光信號(hào)與細(xì)胞環(huán)境中的AI-2成正比。因此，該系統(tǒng)可應(yīng)用于檢測炎癥性腸?。↖BD）患者唾液、糞便和腸道樣本中的AI-2水平，為炎癥性腸病早期的檢測和診斷提供高效、敏感度高、便利的方法?；谌后w感應(yīng)機(jī)制的全細(xì)胞生物傳感器在醫(yī)學(xué)診斷與檢測方面發(fā)揮了很大的作用，在生物防治和生態(tài)環(huán)境保護(hù)方面也提供了有力的幫助。例如汞污染，汞廣泛應(yīng)用于化學(xué)品制造工業(yè)或電子制造領(lǐng)域，但是它具有很強(qiáng)的生物毒性。因此，研制一種經(jīng)濟(jì)高效、操作簡便、對(duì)環(huán)境友好的重金屬汞生物檢測方法就顯得極為重要。Cai等［60］將基于群體感應(yīng)的正反饋系統(tǒng)與汞特異性操縱子MerR相結(jié)合，構(gòu)建了一種含工程化Hg2+可調(diào)MerR蛋白的汞特異性全細(xì)胞生物傳感器。通過含MerR蛋白的汞特異性操縱子來控制LuxⅠ的表達(dá)，形成的LuxR-AHL復(fù)合物會(huì)依次激活Prlux并表達(dá)RFP。同時(shí)設(shè)計(jì)了QS1、QS2和QS3三種策略來驗(yàn)證生物傳感器的實(shí)際輸出信號(hào)的放大效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)含有正反饋體系的全細(xì)胞探針對(duì)汞離子有很高的靈敏性。而且，把熒光信號(hào)擬合到經(jīng)典的Hill方程，發(fā)現(xiàn)構(gòu)建的探針對(duì)汞離子的響應(yīng)接近于超靈敏曲線。除此之外，Thapa等［61］利用生物發(fā)光的原理研制了一種光生物傳感器來檢測環(huán)境中污染物的存在，將光纖技術(shù)和光電二極管結(jié)合來檢測發(fā)光并將光信號(hào)轉(zhuǎn)換為可測的電信號(hào)。該裝置可通過基于群體感應(yīng)機(jī)制的Lux操縱子來調(diào)控發(fā)光過程，從而對(duì)檢測重金屬具備一定的特異性。當(dāng)環(huán)境中有重金屬存在時(shí)細(xì)菌的發(fā)光現(xiàn)象會(huì)有所減弱，但當(dāng)監(jiān)測到鋇元素時(shí)卻發(fā)現(xiàn)發(fā)光現(xiàn)象既存在上升也存在下降，也就是說構(gòu)建的光生物傳感器可以很好地對(duì)環(huán)境中的污染物進(jìn)行定性、定量的檢測。

在合成生物學(xué)領(lǐng)域，許多的生物工程系統(tǒng)和生物元件被用于設(shè)計(jì)實(shí)用性強(qiáng)、操作方便的臨床檢測工具。但是，只有少數(shù)研究證明了這些檢測工具在臨床上的基礎(chǔ)功能性［62-63］，并未考慮到臨床測試樣品的復(fù)雜性以及如何達(dá)到臨床檢測工具的最優(yōu)化。因此，研究人員開始使用無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)作為生物傳感器來進(jìn)行病原診斷和治療［64］。Wen等［65］構(gòu)建了一種在無細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)中的模塊化DNA編碼傳感器，其可用于檢測囊性纖維化疾病患者痰標(biāo)本中銅綠假單胞菌感染的標(biāo)志物。在優(yōu)化無細(xì)胞系統(tǒng)后進(jìn)行試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該生物傳感系統(tǒng)可以在納摩爾水平上定量檢測痰樣品中的群體感應(yīng)信號(hào)分子3-oxo-C12-HSL，有助于提高臨床診斷速度。

2.3 邏輯門

近年來，隨著合成生物學(xué)的迅猛發(fā)展，在微生物中構(gòu)建了具有復(fù)雜基因線路的多種邏輯門調(diào)控系統(tǒng)，以期實(shí)現(xiàn)在空間、時(shí)間和種群尺度上的精確調(diào)控。正反饋線路和負(fù)反饋線路在物理系統(tǒng)和生物系統(tǒng)中普遍存在［66］，這兩類系統(tǒng)之間的相似性以及復(fù)雜性吸引了很多的研究人員來開發(fā)生物分子計(jì)算系統(tǒng)，除了研究撥動(dòng)開關(guān)和生物傳感器，他們?cè)谶壿嬮T和其他生物控制線路相結(jié)合的方面也取得了豐碩的研究成果［67］。邏輯門又稱“數(shù)字邏輯電路基本單元”，執(zhí)行“或”“與”“非”“或非”“與非”等邏輯運(yùn)算的電路。早在2002年，就有研究者構(gòu)建了一種通過外源添加信號(hào)分子啟動(dòng)線路響應(yīng)的與門系統(tǒng)［68］。在該邏輯門中，以外源添加IPTG和ATC作為誘導(dǎo)劑輸入，同時(shí)響應(yīng)后以激活GFP的表達(dá)作為輸出。由于大多數(shù)基因線路的報(bào)告基因僅是熒光蛋白，基本都用來做信號(hào)檢測。所以，之后有更多的研究者致力于在微生物中將Lux、Las和Rhl等群體感應(yīng)系統(tǒng)與基因線路相結(jié)合，構(gòu)建基于QS系統(tǒng)的各種邏輯門，以期在群體水平上更好地協(xié)調(diào)細(xì)胞行為，進(jìn)而促進(jìn)在生物醫(yī)學(xué)和環(huán)境防治等諸多方面的應(yīng)用。Hu等［69］在奧奈達(dá)希瓦菌（Shewanella oneidensisMR-1）mtrA基因敲除突變株中構(gòu)建了一個(gè)基于Lux群體感應(yīng)模塊的與門系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了邏輯門在微生物燃料電池（MFCs）中的應(yīng)用。他們首先將IPTG應(yīng)答模塊、QS模塊和輸出模塊（報(bào)告基因或靶基因mtrA）整合在一起，形成與門系統(tǒng)來控制細(xì)菌胞外電子轉(zhuǎn)移。當(dāng)Lux-AHL的濃度達(dá)到閾值后會(huì)與LuxR結(jié)合，促進(jìn)Lux啟動(dòng)子的激活。與此同時(shí)，伴隨著IPTG的加入，會(huì)解除Lacl蛋白對(duì)tac啟動(dòng)子的抑制。當(dāng)這個(gè)與門系統(tǒng)的兩個(gè)輸入信號(hào)同時(shí)響應(yīng)時(shí)，胞外電子便開始轉(zhuǎn)移。

在利用群體感應(yīng)系統(tǒng)設(shè)計(jì)與門動(dòng)態(tài)調(diào)控線路中，已廣泛存在多個(gè)操縱子調(diào)控單個(gè)啟動(dòng)子的行為。但是當(dāng)細(xì)胞同時(shí)識(shí)別兩個(gè)外源信號(hào)時(shí)，也有可能會(huì)啟動(dòng)系統(tǒng)中基因的表達(dá)。因此，可以結(jié)合內(nèi)部信號(hào)和外部信號(hào)調(diào)控來同時(shí)驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)，其中當(dāng)外源添加誘導(dǎo)劑時(shí)，細(xì)胞只有處于特定生理狀態(tài)下才會(huì)啟動(dòng)基因表達(dá)。Shong等［67］已經(jīng)構(gòu)建并表征了兩個(gè)合成的與門啟動(dòng)子，它們需要群體感應(yīng)信號(hào)和一個(gè)外源添加的誘導(dǎo)劑才能啟動(dòng)基因的表達(dá)。LEE和TTE的基因表達(dá)都需要兩種信號(hào)分子，只有一方存在時(shí)都無法觀察到基因高于本底水平的表達(dá)。研究者通過添加AHL內(nèi)源性產(chǎn)物來評(píng)估啟動(dòng)子以依賴QS方式發(fā)揮作用的能力，并觀察到只有外源性IPTG或者ATC存在的情況下，基因表達(dá)才會(huì)隨著細(xì)胞密度的增加而增加。因此，研究者所構(gòu)建的與門調(diào)控系統(tǒng)可作為一個(gè)新調(diào)控系統(tǒng)的模型，將QS系統(tǒng)和其他基因線路相整合，以實(shí)現(xiàn)代謝工程應(yīng)用中基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化。

現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)QS系統(tǒng)在代謝工程中具有廣泛應(yīng)用，可以動(dòng)態(tài)調(diào)控目標(biāo)生產(chǎn)基因的表達(dá)。由于細(xì)胞的生理狀態(tài)會(huì)影響代謝調(diào)控，因此本實(shí)驗(yàn)室He等［70］設(shè)計(jì)了一個(gè)自誘導(dǎo)的與門調(diào)控系統(tǒng)，其可通過同時(shí)感應(yīng)細(xì)胞濃度和細(xì)胞的生理狀態(tài)對(duì)該系統(tǒng)進(jìn)行響應(yīng)。首先進(jìn)行LuxR的隨機(jī)突變及l(fā)uxRI啟動(dòng)子的優(yōu)化，獲得了一系列可感應(yīng)不同細(xì)胞濃度的可變QS系統(tǒng)，同時(shí)通過檢測細(xì)胞生長過程中的熒光強(qiáng)度，選擇對(duì)應(yīng)的穩(wěn)定期感應(yīng)系統(tǒng)。最終將新構(gòu)建的系統(tǒng)應(yīng)用于PHB生產(chǎn)中，發(fā)現(xiàn)PHB產(chǎn)量可提高1～2倍。研究者構(gòu)建的合成邏輯門能夠成為代謝工程的一種工具，作為一種通用的動(dòng)態(tài)感應(yīng)系統(tǒng)，無需特定的感應(yīng)因子即可感應(yīng)復(fù)雜的信號(hào)。

在合成生物學(xué)中每個(gè)生物元件都被當(dāng)作一個(gè)樂高單元，通過改造、組合得到執(zhí)行不同功能的合成基因網(wǎng)絡(luò)。在過去的10年中，基于合成生物學(xué)背景設(shè)計(jì)的撥動(dòng)開關(guān)、生物傳感器以及邏輯門通過與一些生物控制線路相結(jié)合，在食品醫(yī)藥和環(huán)境改制方面取得了較大的成果，為防控人類微生物病害、克服微生物耐藥性問題提供了有益的借鑒，促進(jìn)微生物學(xué)與遺傳學(xué)、植物保護(hù)學(xué)等其他學(xué)科的交叉滲透和共同發(fā)展。

3 參與種間細(xì)胞間通訊動(dòng)態(tài)調(diào)控的合成生物學(xué)群體感應(yīng)基因線路

在合成生物學(xué)和微生物學(xué)快速發(fā)展、交匯融合下，基于群體感應(yīng)模塊設(shè)計(jì)的基因合成線路已迅速發(fā)展為近年微生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。細(xì)菌的種內(nèi)群體感應(yīng)系統(tǒng)的特異性可以保證細(xì)菌在一個(gè)復(fù)雜的環(huán)境中識(shí)別自己，準(zhǔn)確地實(shí)現(xiàn)信息交流。但由于細(xì)菌在自然界中并不是獨(dú)立存在的，它們之間相互影響，既存在共生關(guān)系，也存在競爭關(guān)系。所以為了更好地適應(yīng)復(fù)雜多變的環(huán)境，細(xì)菌可以通過種間交流的方式來啟動(dòng)特定基因的表達(dá)，從而控制整個(gè)群落的狀態(tài)，提高整個(gè)群體的生存能力［71］。所以，下文將詳細(xì)綜述群體感應(yīng)系統(tǒng)在種間細(xì)胞間通訊的應(yīng)用前景。

3.1 控制種群密度

代謝工程旨在根據(jù)已有的細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行設(shè)計(jì)，通過重組來再次分配所需途徑的代謝通量，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)高價(jià)值藥物、營養(yǎng)品和工業(yè)化學(xué)品的高產(chǎn)［72］。在利用底物生產(chǎn)理想目標(biāo)產(chǎn)物的過程中，只依靠天然代謝途徑無法達(dá)到產(chǎn)率最大化。所以為了重構(gòu)碳代謝途徑，提高產(chǎn)率，本實(shí)驗(yàn)室Wang等［73］通過將糖酵解途徑、戊糖磷酸途徑和“雙歧分流”相結(jié)合，在大腸桿菌中構(gòu)建了一個(gè)EPbifido途徑。將該途徑應(yīng)用到PHB、甲羥戊酸和脂肪酸的生產(chǎn)中，發(fā)現(xiàn)可以很好地降低二氧化碳排放并提高產(chǎn)物的摩爾轉(zhuǎn)化率。但An等［74］和Goo等［75］證明微生物生長環(huán)境中的營養(yǎng)物通常有限，而且相對(duì)擁擠的環(huán)境不利于微生物的生長和代謝。因此，調(diào)控種群密度對(duì)于提高代謝物的產(chǎn)量具有重要意義。Patidar等［76］以扁藻和百慕大公海橄欖菌為研究對(duì)象，采用兩階段培養(yǎng)模式進(jìn)行共培養(yǎng)，評(píng)估不同脅迫條件下生物燃料的生產(chǎn)情況?；诠才囵B(yǎng)模式，百慕大公海橄欖菌及其代謝物可以與扁藻相互促進(jìn)生長，從而提高脂質(zhì)產(chǎn)量。HHQ和PQS通過增加百慕大公海橄欖菌的細(xì)胞豐度，在生物表面形成生物膜，介導(dǎo)了互惠互利的共生作用。然而，當(dāng)HHQ和PQS濃度較高時(shí)，可以抑制扁藻的生長。

腸道微生物群在建立和維持宿主健康方面具有關(guān)鍵作用。Kim等［77］利用群體感應(yīng)機(jī)制在天然大腸桿菌和減毒鼠傷寒沙門菌之間重新構(gòu)建了一個(gè)信息傳遞系統(tǒng)。研究者將一個(gè)物種功能化使其產(chǎn)生可誘導(dǎo)的信號(hào)，而另一個(gè)物種則可以利用基因集成線路進(jìn)行信號(hào)的檢測和記錄。這個(gè)新構(gòu)建的信號(hào)傳輸系統(tǒng)成功實(shí)現(xiàn)了小鼠腸道內(nèi)微生物的種內(nèi)和種間信號(hào)傳遞，為進(jìn)一步了解其他環(huán)境中細(xì)菌間的相互作用提供了一定的基礎(chǔ)。

1.1.3 儀器:日立7020型全自動(dòng)生化分析儀;Beckman-Coulter MAXM血球分析儀;電子稱(常熟市雙杰測試儀器廠產(chǎn)品);萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司產(chǎn)品);Thermo BIOFUGE PRIMO R型離心機(jī)。

Brexó等［78］發(fā)現(xiàn)在利用甘蔗生產(chǎn)生物乙醇的過程中，不可避免地會(huì)產(chǎn)生乳酸菌（LAB）和野生酵母。而且，乳酸菌和酵母在發(fā)酵罐中共存時(shí)產(chǎn)生有機(jī)酸和其他細(xì)胞外代謝物，導(dǎo)致乙醇產(chǎn)量減少。在發(fā)酵過程中細(xì)胞間的相互作用會(huì)促進(jìn)細(xì)菌和酵母之間的交流，它們很有可能通過群體感應(yīng)共存。因此，進(jìn)一步了解基于群體感應(yīng)進(jìn)行共存的機(jī)制，可產(chǎn)生一系列相關(guān)的理論和技術(shù)支持，進(jìn)而為生物燃料行業(yè)做出一定貢獻(xiàn)。

現(xiàn)在，很多微生物生態(tài)學(xué)家嘗試構(gòu)建一些小型的合成生態(tài)系統(tǒng)來探索種群之間調(diào)控機(jī)制的復(fù)雜性。Scott等［79］將兩個(gè)正交的QS機(jī)制和種群控制機(jī)制相結(jié)合，來控制競爭性的鼠傷寒沙門菌的種群密度。Lux-QS和Rpa-QS可以與兩個(gè)裂解基因結(jié)合，在兩株細(xì)菌中形成SLCs來進(jìn)行調(diào)控。研究結(jié)果表明，當(dāng)Lux-QS和Rpa-QS與裂解基因結(jié)合后進(jìn)行共培養(yǎng)時(shí)，它們之間的初始種群比為100：1，在10 h后種群比就可以達(dá)到1：1。但當(dāng)沒有裂解基因存在時(shí)，對(duì)兩株菌進(jìn)行共培養(yǎng)后將會(huì)被Lux-QS菌株接管。即整合兩個(gè)正交的QS機(jī)制以形成正交分解系統(tǒng)對(duì)于穩(wěn)定競爭菌株的共培養(yǎng)具有很大優(yōu)勢。

3.2 振蕩子

在大規(guī)模基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，只使用少量的調(diào)控因子就可以調(diào)控相對(duì)較多的基因，進(jìn)而協(xié)調(diào)復(fù)雜的細(xì)胞行為。很多的代謝活動(dòng)，例如種群控制、激素分泌、晝夜節(jié)律等都與同步振蕩密切相關(guān)［80-82］。所以有很多研究者對(duì)于構(gòu)建振蕩子模型產(chǎn)生了極大興趣，構(gòu)建合成基因振蕩器（SGOs）也就成為合成調(diào)控研究的主要方向之一。McMillen等［83］在大腸桿菌中將由PRE啟動(dòng)子、基因X（cii）和基因Y（ftsh）組成的弛豫振蕩器與Lux-QS機(jī)制相結(jié)合，利用細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制來耦合振蕩器并誘導(dǎo)同步振蕩。蛋白Ftsh可以降解cii，而AHL與LuxR的復(fù)合物則可以激活cii的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)胞內(nèi)AHL濃度達(dá)到閾值時(shí)，它可以與其他細(xì)胞中的另一個(gè)LuxR結(jié)合，調(diào)節(jié)其cii水平。通過對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行建模，也證明了新構(gòu)建的機(jī)制的確會(huì)實(shí)現(xiàn)跨細(xì)胞群的同步行為。

雖然振蕩子在合成生物學(xué)方面的應(yīng)用已經(jīng)取得了較大的進(jìn)展，但是在一個(gè)復(fù)雜的環(huán)境中尋求構(gòu)建一個(gè)穩(wěn)定的基因線路還是相對(duì)較難的。這種復(fù)雜的環(huán)境會(huì)導(dǎo)致基因線路中相當(dāng)大的細(xì)胞間差異，有可能會(huì)阻礙菌落水平上的功能。Prindle［84］等通過將遺傳弛豫振蕩器、群體間的氣相氧化還原信號(hào)和Lux-QS系統(tǒng)整合在一起，在不同的菌落間形成耦合的遺傳“生物混合體”。當(dāng)不含亞砷酸鹽時(shí)，ArsR會(huì)抑制LuxR的表達(dá)，從而無熒光和振蕩的產(chǎn)生。但是當(dāng)亞砷酸鹽含量足夠時(shí)，這種抑制作用會(huì)被解除，LuxR-AHL復(fù)合物將會(huì)促進(jìn)熒光基因的表達(dá)和振蕩產(chǎn)生，最終實(shí)現(xiàn)數(shù)千個(gè)振蕩的群體在厘米尺度上的同步。

合成生物學(xué)基于振蕩子的應(yīng)用除了之前存在的問題，還面臨一個(gè)挑戰(zhàn)是要?jiǎng)?chuàng)造出基于種群水平行為的微生物協(xié)同系統(tǒng)，可利用細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制來調(diào)節(jié)多種細(xì)胞類型的基因表達(dá)。Chen等［85］構(gòu)建了一個(gè)由兩種不同細(xì)胞類型組成的微生物聯(lián)合體，其中一種是“激活”菌株，另一種是“抑制”菌株。這些菌株會(huì)產(chǎn)生兩個(gè)正交的細(xì)胞信號(hào)分子，在雙菌株合成線路中調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。激活因子產(chǎn)生Rhl-AHL，促進(jìn)兩株菌株的靶基因轉(zhuǎn)錄，而抑制因子會(huì)產(chǎn)生Cin-AHL，抑制由LacI蛋白介導(dǎo)的兩菌株的轉(zhuǎn)錄。除此之外，還存在一個(gè)負(fù)反饋回路，其中AiiA蛋白可以降解這兩個(gè)AHL。這兩個(gè)菌株只有共培養(yǎng)時(shí)才會(huì)產(chǎn)生群體水平的振蕩。通過利用多合作菌株的基因工程來調(diào)控種群水平動(dòng)態(tài)的能力，為構(gòu)建具有多種細(xì)胞類型的復(fù)雜合成組織和器官指明了方向。

利用細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制來調(diào)節(jié)多種細(xì)胞類型的基因表達(dá)已經(jīng)取得了成功，但如果要在土壤或腸道微生物群等復(fù)雜環(huán)境中使用合成多細(xì)胞系統(tǒng)，或者說與材料學(xué)相結(jié)合，那么通過細(xì)胞間信號(hào)進(jìn)行跨時(shí)間和空間的基因協(xié)調(diào)表達(dá)將會(huì)非常重要。Kim等［86］構(gòu)建了一個(gè)雙菌株合成菌群，這兩個(gè)菌株會(huì)產(chǎn)生兩個(gè)正交的群體感應(yīng)分子，從而形成一個(gè)可以連接正反饋和負(fù)反饋的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。當(dāng)在微流控裝置中進(jìn)行共培養(yǎng)時(shí)，這兩個(gè)菌株會(huì)產(chǎn)生振蕩現(xiàn)象。在大群體中，發(fā)現(xiàn)整個(gè)群體暫時(shí)的協(xié)調(diào)振蕩是依賴于一個(gè)內(nèi)在的正反饋線路的存在，該線路會(huì)放大和傳遞細(xì)胞間信號(hào)。即新構(gòu)建的多細(xì)胞系統(tǒng)可以通過利用組成細(xì)胞間的短暫、短距離的耦合來實(shí)現(xiàn)基因的協(xié)調(diào)表達(dá)。

3.3 混合菌種的共培養(yǎng)

合成生物學(xué)和代謝工程元件的不斷更新與改進(jìn)為構(gòu)建更加復(fù)雜、高效的微生物合成系統(tǒng)提供了有利的基礎(chǔ)，但有可能會(huì)受到單個(gè)細(xì)胞中可用資源和環(huán)境的限制。為了解決這個(gè)問題，研究人員提出了一個(gè)策略，即共培養(yǎng)發(fā)酵，通過對(duì)亞群之間的物質(zhì)進(jìn)行協(xié)調(diào)分配來克服這些限制［87］。

Dinh等［88］構(gòu)建了一種基于群體感應(yīng)的生長調(diào)節(jié)線路，該線路提供了一種額外的參數(shù)用于調(diào)節(jié)發(fā)酵過程中共培養(yǎng)物的組成。該線路通過降低糖酵解通量和增加細(xì)胞密度來下調(diào)生長速率，細(xì)胞密度與生長速率下調(diào)的關(guān)系可以通過改變AHL合成酶的表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而在相同的接種比例下獲得不同的共培養(yǎng)動(dòng)態(tài)。將該線路應(yīng)用于柚皮苷的共培養(yǎng)生產(chǎn)過程中，通過改變菌株的接種比例就可使滴度增加60%。此外，還證明了將生長控制線路與通訊模塊相結(jié)合后，其中一個(gè)亞種群的細(xì)胞密度可調(diào)控另一個(gè)模塊的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而協(xié)調(diào)細(xì)胞間的行為，提高柚皮苷滴度。

許多變形桿菌可以利用群體感應(yīng)來調(diào)控公共產(chǎn)品例如抗菌劑和蛋白酶的生產(chǎn)，這些公共產(chǎn)品可以在一個(gè)微生物群落中實(shí)現(xiàn)共享。Evans等［89］構(gòu)建了一個(gè)實(shí)驗(yàn)室模型去研究群體調(diào)控抗菌劑在種間競爭中的重要性。在該模型中，伯克霍爾德菌和紫花色桿菌均使用了QS機(jī)制調(diào)控的抗菌劑來抑制其他物種的生產(chǎn)。研究者證明了在共培養(yǎng)模型中，波林菌素抑制了群體感應(yīng)缺陷突變體的出現(xiàn)，而抗菌劑生產(chǎn)合作者的增加使得紫花色桿菌種群變得更具競爭力，即物種間的競爭可以通過限制有群體感應(yīng)缺陷的突變體來加強(qiáng)合作行為。除此之外，由于銅綠假單胞菌QS系統(tǒng)參與調(diào)控多種公共產(chǎn)品的生產(chǎn)，可以很好地作為研究微生物合作的模型。Smalley等［90］對(duì)銅綠假單胞菌和多食雙歧桿菌在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行共培養(yǎng)，并研究了3種銅綠假單胞菌QS系統(tǒng)調(diào)控的抗菌劑氰化氫、鼠李糖酯和吩嗪在生物競爭中的重要性。通過研究發(fā)現(xiàn)，銅綠假單胞菌和多食雙歧桿菌共培養(yǎng)時(shí)，銅綠假單胞菌會(huì)占優(yōu)勢，這3種抗菌劑會(huì)共同促進(jìn)銅綠假單胞菌的競爭力。這兩種細(xì)菌都需要銅綠假單胞菌群體調(diào)節(jié)蛋白酶來促進(jìn)生長，因此QS調(diào)控的抗菌劑對(duì)于銅綠假單胞菌很重要，可以防止雙歧桿菌對(duì)公共產(chǎn)品蛋白酶的利用。

通過對(duì)QS機(jī)制在控制種群密度、構(gòu)建振蕩子模型以及混合菌種共培養(yǎng)這3個(gè)方面進(jìn)行歸納總結(jié)，對(duì)細(xì)菌群體感應(yīng)通訊系統(tǒng)有了更進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)。有助于今后創(chuàng)建微生物群體感應(yīng)通訊系統(tǒng)調(diào)控的新理論和新方法，通過人為地干擾或促進(jìn)微生物群體感應(yīng)系統(tǒng)從而調(diào)控某種功能。

4 結(jié)語與展望

細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)是近20年微生物學(xué)研究領(lǐng)域的重大發(fā)現(xiàn)之一，目前對(duì)其已有相對(duì)全面的認(rèn)識(shí)和研究。細(xì)菌廣泛存在于各個(gè)群落中，其可利用一些包括復(fù)雜的信號(hào)分子、信號(hào)傳感器以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的細(xì)胞間通訊系統(tǒng)來快速適應(yīng)不斷變化的環(huán)境。本文詳細(xì)綜述了調(diào)控生物發(fā)光、生物被膜形成、孢子形成和產(chǎn)生毒力的群體感應(yīng)系統(tǒng)，極大增進(jìn)了對(duì)各類細(xì)菌中不同群體感應(yīng)系統(tǒng)的了解，幫助深入研究各個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)之間的互作關(guān)系。自然界中的微生物群體感應(yīng)系統(tǒng)非常復(fù)雜且多樣化，還有很多的信號(hào)分子尚未鑒定，信號(hào)通路及調(diào)控機(jī)理也未明晰。因此，在小分子分離鑒定和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析技術(shù)逐漸成熟的時(shí)代，應(yīng)該投入更多的精力去研究和發(fā)展多樣化、高效化的群體感應(yīng)系統(tǒng)，幫助揭示細(xì)菌之間互作競爭的作用機(jī)制，使其獲得競爭優(yōu)勢，從而極大增強(qiáng)了細(xì)菌在環(huán)境中的生存概率。QS系統(tǒng)對(duì)細(xì)菌種群的社會(huì)行為產(chǎn)生了很大的影響，使之可以更好地適應(yīng)不斷變化的環(huán)境。這些研究極大增進(jìn)了人們對(duì)群體感應(yīng)系統(tǒng)在細(xì)菌種內(nèi)及種間細(xì)胞間通訊應(yīng)用的了解，也進(jìn)一步說明了研究微生物群體感應(yīng)系統(tǒng)的重要性和復(fù)雜性。目前很多的研究都集中在生物被膜形成、環(huán)境檢測和疾病防治等方面，對(duì)于生物計(jì)算工具的構(gòu)建和調(diào)節(jié)種群密度方面的研究相對(duì)少一些。因此本文詳細(xì)闡釋了近年來細(xì)菌在種內(nèi)和種間基于群體感應(yīng)機(jī)制的動(dòng)態(tài)調(diào)控應(yīng)用，集中討論了群體感應(yīng)系統(tǒng)與各類基礎(chǔ)調(diào)控線路相結(jié)合的生物計(jì)算工具的構(gòu)建，以及以群體感應(yīng)為基礎(chǔ)的基因元件在控制種群密度、調(diào)節(jié)代謝流方面的改進(jìn)，努力簡化發(fā)酵過程，降低成本，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)調(diào)控并積極地向產(chǎn)業(yè)化方向靠攏。

積極開展基于群體感應(yīng)的合成生物學(xué)改造技術(shù)對(duì)于明晰微生物之間的信息交流以及病原菌與寄主之間的通訊系統(tǒng)具有重大的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值：首先對(duì)于細(xì)菌的基礎(chǔ)群體感應(yīng)系統(tǒng)原理和機(jī)制的了解，以及對(duì)細(xì)菌的群體感應(yīng)通訊系統(tǒng)和病原-宿主跨界通訊系統(tǒng)的研究會(huì)幫助研究者建立一個(gè)相對(duì)完善的微生物群體感應(yīng)研究體系。不但可以提供一些基礎(chǔ)、科學(xué)的理論指導(dǎo)，還有利于研究者開拓基于群體感應(yīng)研究的新思路和新方法。其次，基于群體感應(yīng)的微生物通訊系統(tǒng)會(huì)參與調(diào)控細(xì)菌的多種生活習(xí)性以及各種生理過程，QS系統(tǒng)很好地承擔(dān)著病原菌之間以及病原菌和宿主之間溝通的角色，使其成為防治生物疾病和治療動(dòng)植物病害的新突破口，也為發(fā)展新型綠色安全農(nóng)業(yè)和健全醫(yī)藥服務(wù)提供了有益的借鑒。除此之外，群體感應(yīng)基因線路已被廣泛應(yīng)用于工農(nóng)醫(yī)科等領(lǐng)域，在各個(gè)領(lǐng)域通過合成生物學(xué)手段構(gòu)建新型的基因元件及合成線路，實(shí)現(xiàn)了代謝流重組和產(chǎn)量提高，同時(shí)還促進(jìn)了微生物學(xué)、遺傳學(xué)和植物學(xué)等各個(gè)學(xué)科的交叉融合和共同發(fā)展。但是目前仍有一些研究存在不足或尚未明晰之處，例如基于群體感應(yīng)的動(dòng)態(tài)調(diào)控存在一定的泄露，無法對(duì)靶基因的表達(dá)實(shí)現(xiàn)嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控；不同調(diào)控系統(tǒng)之間的正交性、有關(guān)種間細(xì)胞通訊的代謝流調(diào)控、脈沖發(fā)生器等方面的應(yīng)用也需要進(jìn)一步研究。今后，相信基于群體感應(yīng)系統(tǒng)來優(yōu)化動(dòng)態(tài)線路的策略會(huì)在生物化工等領(lǐng)域有更大的發(fā)展空間。