基于工程化鹽單胞菌的下一代工業(yè)生物技術(shù)

陳江楠，陳瀟寧，劉心怡，萬薇，章義鑫，張自豪，鄭逸飛，鄭陶然，王宣，王子瑜，閆煦，張旭，吳赴清，陳國強

（1清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京100084；2清華大學(xué)新雅書院，北京100084；3天津大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津300072；4山東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東濟(jì)南250100）

化學(xué)工業(yè)在過去幾十年里為人類社會帶來了巨大的福利，但隨著社會的進(jìn)步，化學(xué)工業(yè)導(dǎo)致的環(huán)境污染、資源枯竭等問題引起越來越多的關(guān)注，可持續(xù)發(fā)展的呼聲不斷增多［1-2］。工業(yè)生物技術(shù)（industrial biotechnology）是指通過微生物發(fā)酵或無細(xì)胞生物催化，在溫和的條件下將原材料轉(zhuǎn)化為所需的化學(xué)物質(zhì)、材料和能源的技術(shù)，它可以有效緩解環(huán)境污染問題，實現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展［3-4］。但現(xiàn)有工業(yè)生物技術(shù)存在許多缺點：易發(fā)生微生物污染，對生物反應(yīng)器、操作人員、發(fā)酵條件和發(fā)酵程序要求十分嚴(yán)格，微生物生長緩慢，原材料價格昂貴，底物到產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率低，生產(chǎn)過程難以連續(xù)，產(chǎn)品分離純化困難，消耗大量淡水和能源等［5］。這些缺點導(dǎo)致工業(yè)生物技術(shù)生產(chǎn)成本較高，無法與以低廉的石油為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)化學(xué)工業(yè)競爭［6-7］。因此，迫切需要開發(fā)能夠克服這些缺點的新型工業(yè)生物技術(shù)。

下一代工業(yè)生物技術(shù)（next generation industrial biotechnology，NGIB）是一種低成本生物加工技術(shù)，其核心是利用生長在特殊環(huán)境中的極端微生物，如嗜鹽菌、嗜酸菌、嗜堿菌、嗜冷菌、嗜熱菌等作為底盤細(xì)胞建立的開放、無滅菌的連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)體系［8-10］。由于這些微生物在極端環(huán)境下仍能快速生長，可以避免雜菌污染對發(fā)酵培養(yǎng)的干擾。鹽單胞菌（Halomonasspp.）在高鹽和堿性環(huán)境中能夠快速生長，這為限制雜菌生長提供了雙重保證。以鹽單胞菌為基礎(chǔ)開發(fā)的下一代工業(yè)生物技術(shù)可以有效節(jié)約淡水和能源、降低發(fā)酵過程的復(fù)雜性和生產(chǎn)成本（圖1）［9］。此外，多種鹽單胞菌的全基因組測序已經(jīng)完成［11-15］，為這些物種的合成生物學(xué)和代謝工程改造和研究奠定了生物信息學(xué)基礎(chǔ)。研究人員已開發(fā)了適用于鹽單胞菌的多種基因編輯工具和調(diào)控元件，以快速獲得優(yōu)良的目標(biāo)性狀［16］?；邴}單胞菌的下一代工業(yè)生物技術(shù)體系已成功用于在開放、非滅菌條件下連續(xù)生產(chǎn)多種聚羥基脂肪酸酯［17-18］、生物表面活性劑蛋白［19］和氨基酸［20］。基于工程化鹽單胞菌的下一代工業(yè)生物技術(shù)顯示了巨大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

圖1 基于鹽單胞菌的下一代工業(yè)生物技術(shù)的流程［9］Fig.1 Process of next generation industrial biotechnology based on Halomonas spp.［9］

本文作者系統(tǒng)總結(jié)了近年來基于工程化鹽單胞菌的下一代工業(yè)生物技術(shù)在各個方面取得的進(jìn)展和突破，同時為進(jìn)一步的研究提供良好的理論支撐。

1 下一代工業(yè)生物技術(shù)的優(yōu)勢

1.1 利用海水代替淡水

隨著農(nóng)業(yè)、工業(yè)和生活用水量的不斷增加，全球可用淡水資源急劇下降［21］。傳統(tǒng)工業(yè)生物技術(shù)的底盤細(xì)胞如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、假單胞菌、羅氏真氧菌以及酵母等發(fā)酵過程需要消耗大量珍貴的淡水，使水資源短缺問題更加嚴(yán)重。而全球水資源中97%以上為海水，卻沒有得到充分的利用［22］。開發(fā)能夠利用海水的新型底盤細(xì)胞對節(jié)約淡水資源具有重要意義［23-24］。

鹽單胞菌生活在深海、鹽湖等高鹽環(huán)境中，天然條件下可合成聚羥基脂肪酸酯（PHA）［24］、果聚糖［25］、胞外多糖［26］、四氫吡啶［27］、胞外聚合物（EPS）［28］等多種化合物。鹽單胞菌Halomonas bluephagenesis（H.bluephagenesis）是清華大學(xué)陳國強團(tuán)隊［29］從新疆艾丁湖中分離出來的，該菌株可在不滅菌條件下，在海水中生長數(shù)周至數(shù)月不被污染。近年來，利用海水進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)鹽單胞菌已被成功開發(fā)。Tan等［29］利用該菌株在含60 g/L NaCl的發(fā)酵培養(yǎng)基中經(jīng)56 h的補料分批發(fā)酵生產(chǎn)聚3-羥基丁酸（PHB）。此外，鹽單胞菌H.campaniensisLS21重組菌株在實驗室人工海水（27 g/L NaCl）中經(jīng)65 d連續(xù)開放發(fā)酵，細(xì)胞干重達(dá)約65 g/L，PHB占細(xì)胞干重約70%，并且在利用模擬餐廚廢料的發(fā)酵過程中，分泌到胞外的纖維素酶、淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶都保持良好的活性［30］。工程化的鹽單胞菌能夠利用海水迅速生長并積累產(chǎn)物，這對充分開發(fā)海水資源、節(jié)約淡水資源具有重要應(yīng)用意義。

1.2 節(jié)省能量

在微生物發(fā)酵生產(chǎn)流程中，蒸汽滅菌和好氧發(fā)酵過程中的空壓機鼓氣是能量消耗最高的兩大步驟［31］。鹽單胞菌由于生長在高鹽和堿性培養(yǎng)液中，直接抑制了其他微生物的生長［32］，因此可以免除滅菌步驟，進(jìn)行開放發(fā)酵。另外，嗜鹽菌生長快，在爭奪營養(yǎng)物質(zhì)的競爭中占據(jù)優(yōu)勢，從而間接抑制雜菌生長繁殖［33］。Tan等［29］對高鹽和堿性培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物定期進(jìn)行菌落計數(shù)和PCR污染測試，結(jié)果顯示培養(yǎng)48 h后雜菌細(xì)胞干重仍少于3.5 g/L，僅為H.bluephagenesis數(shù)量的1/10。利用鹽單胞菌作為底盤細(xì)胞避免了滅菌導(dǎo)致的能源消耗。

由于微生物耗氧量與所生產(chǎn)的生物質(zhì)濃度密切相關(guān)，在發(fā)酵罐中進(jìn)行高細(xì)胞密度培養(yǎng)時，需要向培養(yǎng)基中持續(xù)泵入充足的無菌氧氣（或空氣），這個過程增加的空氣過濾流程導(dǎo)致了更高的能耗［34］。利用合成生物學(xué)方法對微生物進(jìn)行改造，使其在低氧條件下維持正常的生長和生產(chǎn)效率是降低能量損耗的有效途徑［35-37］。Ouyang等［38］將血紅蛋白（VHb）導(dǎo)入鹽單胞菌中，并利用雙精氨酸轉(zhuǎn)位酶途徑（Tat）將其轉(zhuǎn)運到細(xì)胞的周質(zhì)空間，促進(jìn)與氧氣的接觸和轉(zhuǎn)運，使低氧條件下細(xì)胞干重提高了100%。Wu等［39］還發(fā)現(xiàn)，構(gòu)建串聯(lián)Pvgb重復(fù)序列的啟動子可以在低曝氣或高細(xì)胞密度條件下強有力地誘導(dǎo)PHA合成。除了以上策略，蛋白定向進(jìn)化技術(shù)廣泛應(yīng)用于酶性能的改造［40］。篩選能夠在低氧培養(yǎng)環(huán)境中保持高活性的突變，從而降低對氧氣的需求，這是更加節(jié)能的方式之一，也是下一步研究的重點方向。

1.3 從滅菌不連續(xù)的批次發(fā)酵到開放連續(xù)發(fā)酵轉(zhuǎn)變

連續(xù)發(fā)酵是指以一定的速度向發(fā)酵罐內(nèi)不斷添加新鮮培養(yǎng)基，同時以相同速度流出培養(yǎng)液，使發(fā)酵罐內(nèi)液體量維持恒定的發(fā)酵過程［41］。相比分批發(fā)酵，連續(xù)發(fā)酵工藝將產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益，包括：①避免間歇發(fā)酵中重復(fù)清洗和滅菌步驟，減少了人力、能量和時間消耗；②延長微生物指數(shù)增長時間，促進(jìn)產(chǎn)物積累；③采用連續(xù)收獲分離，降低了底物或產(chǎn)物的抑制作用［42］。雖然連續(xù)發(fā)酵具有這些優(yōu)勢，但由于長時間培養(yǎng)增加了污染的概率，普通微生物進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵存在較大風(fēng)險。

鹽單胞菌由于培養(yǎng)基中高鹽和堿性環(huán)境可有效抑制雜菌生長，是開發(fā)連續(xù)發(fā)酵工藝的理想底盤細(xì)胞。Tan等［29］在H.bluephagenesis中建立了連續(xù)培養(yǎng)體系，并進(jìn)行了為期14 d的不滅菌連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)。該體系包括兩個發(fā)酵罐，第1發(fā)酵罐為MM-G培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37℃、pH 9.0和50%溶解氧濃度（DO），24 h后細(xì)胞干重達(dá)40 g/L，PHB含量達(dá)60%，此時將第1發(fā)酵罐中的培養(yǎng)物連續(xù)泵送到第2發(fā)酵罐中，并在無氮源的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，第2發(fā)酵罐中的細(xì)胞干重在20 g/L左右，PHB水平保持在細(xì)胞干重的65%～70%。培養(yǎng)物泵出和培養(yǎng)基補充同時進(jìn)行，保持發(fā)酵罐中培養(yǎng)物體積恒定。第2發(fā)酵罐中的培養(yǎng)物經(jīng)分離后上清可繼續(xù)用于配制第1或第2發(fā)酵罐的培養(yǎng)基，從而循環(huán)使用。經(jīng)測定，第1發(fā)酵罐的葡萄糖轉(zhuǎn)化率在20%～30%，第2發(fā)酵罐的葡萄糖轉(zhuǎn)化率在50%以上。

Yue等［30］利用鹽單胞菌H.campaniensisLS21進(jìn)行了連續(xù)65 d的流加發(fā)酵培養(yǎng)未發(fā)生雜菌污染，重組菌產(chǎn)生的PHB大約占干重的70%，而野生型產(chǎn)生的PHB大約占干重的26%，重組質(zhì)粒在整個流加發(fā)酵過程中穩(wěn)定存在。

Ling等［43］對鹽單胞菌的沉降性能進(jìn)行了優(yōu)化，獲得了1 min內(nèi)即可自動絮凝沉降的突變菌株，以此為基礎(chǔ)進(jìn)行了連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)，并進(jìn)行了對比研究。在連續(xù)培養(yǎng)過程中，菌體移除后無需滅菌和接種，上清液可再次用于下一批的生長，在120 h的連續(xù)過程中，絮凝細(xì)胞被收集了4次，菌株細(xì)胞干重和PHB的產(chǎn)率分別從單次發(fā)酵的0.45 g/（L·h）和0.18 g/（L·h）提高到連續(xù)發(fā)酵的0.82 g/（L·h）和0.33 g/（L·h），幾乎是批量生產(chǎn)的兩倍［43］。這些結(jié)果表明無廢水工藝不僅減少廢水排放，而且在一定時間內(nèi)增加了細(xì)胞生長和產(chǎn)品形成效率。

1.4 簡化發(fā)酵過程與使用低成本原料

發(fā)酵過程的復(fù)雜程度直接影響生產(chǎn)效率和生產(chǎn)成本［44］。鹽單胞菌由于生長在高鹽和堿性環(huán)境中，可以有效抑制雜菌生長，因此發(fā)酵過程可以免除發(fā)酵設(shè)備、培養(yǎng)基和空氣的滅菌程序，使發(fā)酵過程大大簡化。由于不需要滅菌，發(fā)酵裝置也不需要使用價格昂貴的不銹鋼材料，可以用成本低廉的塑料甚至水泥發(fā)酵裝置［9］。通過培育具有自絮凝特性的菌株，簡化了后期菌體分離工藝，也可簡化后期分離過程［43］。鹽單胞菌作為下一代工業(yè)生物技術(shù)的底盤細(xì)胞，已經(jīng)體現(xiàn)出了巨大的優(yōu)勢與潛力，未來通過改進(jìn)發(fā)酵流程與發(fā)酵工藝，使用更低成本的發(fā)酵原料，將會進(jìn)一步降低成本，提高鹽單胞菌在綠色生物制造方面的優(yōu)勢。

鹽單胞菌H.bluephagenesis可以利用葡萄糖、果糖、蔗糖、甘油等多種化合物作為底物生長進(jìn)行培養(yǎng)［45］。為進(jìn)一步降低底物成本，研究人員對廚余垃圾作為碳源進(jìn)行了研究。Yue等［30］利用與廚房垃圾相似的混合基質(zhì)，包括可溶性和不溶性纖維素、蛋白質(zhì)、脂肪、脂肪酸和淀粉等對鹽單胞菌進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)菌株H.campaniensisLS21能產(chǎn)生約70%的PHB。據(jù)測算，利用嗜鹽菌構(gòu)建的開放連續(xù)培養(yǎng)工藝，碳源轉(zhuǎn)化率增加了40%，PHB生產(chǎn)成本控制在1.4萬元/噸，只有Escherichia coli成本的一半［42］。

近年來，農(nóng)產(chǎn)品加工的廢棄物如去油米糠、水稻碾米水等被用作低廉底物進(jìn)行PHA等化合物生產(chǎn)［46-47］，開拓新興低廉底物也是下一代工業(yè)生物技術(shù)的重要研究方向。

2 下一代工業(yè)生物技術(shù)開發(fā)和利用

2.1 鹽單胞菌生物元件與調(diào)控工具開發(fā)

圖2 鹽單胞菌H.bluephagenesis中已開發(fā)的下一代分子生物技術(shù)工具（a）、方法（b）和合成的多種產(chǎn)物（c）［5］1—Porin啟動子表達(dá)系統(tǒng)；2—T7-like誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)；3—CRISPRi基因編輯系統(tǒng)；4—CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)；5—提升氧氣利用率；6—形態(tài)工程改造；7—高密度生長；8—大規(guī)模發(fā)酵；9—PHA產(chǎn)品類型（PHB、PHBV和P3HB4HB）；10—其他產(chǎn)品類型（PhaP，PhaR，ALA和ectoine）gRNA—向?qū)NA；PHBV—聚3羥基丁酸-3羥基戊酸酯；RBS—核糖體結(jié)合位點；sgRNA—單鏈向?qū)NA；VHb—透明顫菌血紅蛋白Fig.2 Engineering halophilic Halomonas spp.for NGIB tools(a),methods(b)and production of multiple products(c)1—Porin promoter expression system;2—T7-like expression system;3—CRISPRi engineering system;4—CRISPR/Cas9 engineering system;5—increasing oxygen availability;6—morphology engineering;7—high-cell-density growth;8—large-scale fermentation;9—PHA product types(PHB,PHBV,and P3HB4HB);10—other products(PhaP,PhaR,ALA,and ectoine)gRNA—guide RNA;PHBV—poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate);RBS—ribosome binding site;sgRNA—single-guide RNA;VHb—Vitreoscilla hemoglobin

為對嗜鹽菌進(jìn)行調(diào)控和改造，許多調(diào)控工具、元件相繼被開發(fā)出來［5］［圖2（a）、（b）］。Fu等［48］建立了質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)化到嗜鹽菌中的方法，并利用自殺載體pRE1126I-SceI建立了無標(biāo)記的基因敲除技術(shù)。Tan等［45］在高拷貝質(zhì)粒pSEVA341中連入LacIq-Ptrc系統(tǒng)實現(xiàn)嗜鹽菌中多個基因的誘導(dǎo)表達(dá)。為實現(xiàn)外源基因的穩(wěn)定整合和表達(dá)，Yin等［49］開發(fā)了基于強表達(dá)的porin基因的染色體表達(dá)系統(tǒng)。Li等［50］通過對porin基因啟動子-35至-10區(qū)間進(jìn)行突變，構(gòu)建了轉(zhuǎn)錄活性變化達(dá)310倍的組成型啟動子庫，并通過將lac元件整合到核心啟動子區(qū)，構(gòu)建了誘導(dǎo)率大于200倍的可誘導(dǎo)啟動子庫。Shen等［51］進(jìn)一步利用porin基因啟動子-10區(qū)內(nèi)部及上游分別進(jìn)行4堿基與3堿基的飽和突變，構(gòu)建了轉(zhuǎn)錄活性在40～140 000的穩(wěn)定啟動子庫。Ouyang等將8個低氧誘導(dǎo)的vgb啟動子串聯(lián)，獲得了低氧誘導(dǎo)的強啟動子Pvgb［38］。Tao等［52］開發(fā)了鹽單胞菌CRISPRi系統(tǒng)，并成功實現(xiàn)了對編碼細(xì)菌分裂環(huán)形成蛋白的ftsZ基因、編碼2-甲基檸檬酸合成酶的prpC基因和編碼檸檬酸合成酶的gltA基因可控抑制。為了控制靶基因的表達(dá)水平，Zhao等［53］成功建立3個誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)MmP1、VP4和K1F，基因誘導(dǎo)倍數(shù)達(dá)3085倍，效率是Ptac啟動子的2.5倍。Qin等［54］利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)開發(fā)了一種高效、無瘢痕的鹽單胞菌基因組編輯方法，基因敲除效率最高可達(dá)100%。調(diào)控工具和調(diào)控元件的不斷開發(fā)使鹽單胞菌的合成生物學(xué)改造變得更加方便、更加高效。

2.2 重組鹽單胞菌用于生產(chǎn)多種產(chǎn)品

基于鹽單胞菌的下一代工業(yè)生物技術(shù)是一個廣譜的生產(chǎn)平臺，已被成功用于合成PHB［55］、聚（3-羥基丁酸-co-3-羥基戊酸）（PHBV）［45］、聚（3-羥基丁酸-co-4-羥基丁酸）（P3HB4HB）［56］、表面活性劑蛋白［19］、5-氨基乙酰丙酸（ALA）［20］等多種材料及化學(xué)品［圖2（c）］。PHB是研究最多的聚羥基脂肪酸酯材料。PHB是一種熱塑性材料，性能與石油化工塑料聚乙烯和聚丙烯類似，它具有生物惰性、生物相容性和生物可降解性，在醫(yī)學(xué)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景［57］。傳統(tǒng)菌株生產(chǎn)PHB，產(chǎn)量低、成本昂貴。利用鹽單胞菌在實驗室發(fā)酵條件下培養(yǎng)56 h后細(xì)胞干重達(dá)80 g/L，PHB含量達(dá)80%［29］。另外，抑制編碼檸檬酸合成酶的gltA基因，將更多的乙酰輔酶A從三羧酸（TCA）循環(huán)引導(dǎo)到PHB合成途徑，使鹽單胞菌中PHB積累增加了約8%［52］，而提高NADH/NAD+比值使PHB的積累量達(dá)到細(xì)胞干重的90%［55］。

PHBV是由3-羥基丁酸（3HB）和3-羥基戊酸（3HV）形成的共聚物，具有良好的生物可降解性和生物相容性，其材料物理和機械性能很大程度上取決于3HV比例［58］。在E.coli中利用葡萄糖為單一碳源，結(jié)合檸檬酸途徑和蘇氨酸生物合成途徑可以將PHBV中的3HV比例提高，但菌株生長較差，PHBV含量較低，而且發(fā)酵過程中還要加入昂貴的誘導(dǎo)劑使生產(chǎn)成本增加［59］。在鹽單胞菌中敲除編碼2-甲基檸檬酸合成酶的prpC基因，丙酸轉(zhuǎn)化為3HV單體的效率從約10%提高到近100%，過表達(dá)蘇氨酸合成途徑和蘇氨酸脫氫酶基因，重組菌株TD08能夠利用多種碳源合成PHBV，3HV比例在4%～6%（摩爾分?jǐn)?shù)）［45］。在鹽單胞菌中利用CRISPRi體系下調(diào)prpC基因，獲得了3HV比例在1%～13%（摩爾分?jǐn)?shù)）的多種PHBV共聚物［52］。通過敲除prpC和琥珀酸脫氫酶組裝因子2編碼基因sdhE，同時過表達(dá)編碼甲基丙二酰輔酶A變位酶基因scpA、甲基丙二酰輔酶A脫羧酶基因scpB和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的編碼基因ppc，重組菌株TY194細(xì)胞干重達(dá)6.3 g/L、PHBV占細(xì)胞干重65%，3HV單體含量為25%［17］。

P3HB4HB可用于心血管、軟骨和神經(jīng)組織的修復(fù)以及織工程支架［60］。在R.eutropha中利用豆油和γ-丁內(nèi)酯（GBL）作為碳源進(jìn)行P3HB4HB生產(chǎn)的嘗試，得到了4-羥基丁酸（4HB）摩爾分?jǐn)?shù)為6%～10%的共聚物［61］。提高GBL的供給可以提升共聚物中4HB的含量，但卻降低了細(xì)胞干重（CDW）和PHA產(chǎn)率。Chen等［56］將編碼4HBCoA轉(zhuǎn)移酶的orfZ基因整合到嗜鹽菌基因組中，使菌株能夠利用GBL合成4HB，在發(fā)酵罐中培養(yǎng)48 h，細(xì)胞干重超過70 g/L，P（3HB-co-12%4HB）比例達(dá)63%。利用更強的Pporin啟動子過表達(dá)orfZ基因時，菌株在7 L發(fā)酵罐中無滅菌分批發(fā)酵50 h后，CDW超過100 g/L，含有80%的P（3-HB-co-11% 4-HB）［51］。Ye等［62］在5 m3生物反應(yīng)器中進(jìn)行了中試放大研究，在數(shù)學(xué)模型和合理計算的幫助下，生長36 h后細(xì)胞干重達(dá)100 g/L，P（3HB-co-13.5%4HB）占比60.4%。通過敲除編碼琥珀酸半醛脫氫酶基因gabD減弱4HB競爭途徑，同時過表達(dá)琥珀酸半醛脫氫酶基因sucD、4-羥基丁酸脫氫酶基因4hbD、CoA轉(zhuǎn)移酶基因orfZ、2-氧葡萄糖酸脫羧酶基因ogdA促進(jìn)4HB-CoA合成，構(gòu)建了以葡萄糖為唯一碳源的P3HB4HB合成菌株［18］。該菌株在7 L生物反應(yīng)器中，非滅菌條件下培養(yǎng)60 h細(xì)胞干重達(dá)26.3 g/L，P（3HB-co-17.04% 4HB）含 量 達(dá)60.5%［18］。

Lan等［19］在嗜鹽菌中構(gòu)建了表面活性劑蛋白PhaP的高效表達(dá)系統(tǒng)，在開放發(fā)酵中得到了1.86 g/L的PhaP蛋白產(chǎn)量。ALA是一種重要的細(xì)胞中間代謝產(chǎn)物，在許多疾病的治療中有重要作用［63-64］，其生物法生產(chǎn)也是領(lǐng)域內(nèi)關(guān)注的重點［65］。Li等［20］在H.bluephagenesisTD01中 構(gòu)建了ALA合成途徑，產(chǎn)量達(dá)到635 mg/L，同時PHB產(chǎn)量達(dá)到細(xì)胞干重的22%。

2.3 下游分離過程優(yōu)化

發(fā)酵菌體分離是影響產(chǎn)物成本的重要因素，常用方法有離心分離法、常規(guī)過濾法和膜過濾法等。這些方法不但需要昂貴的設(shè)備而且損耗大量能量。為簡化鹽單胞菌分離程序，研究人員從增大細(xì)菌體積、增強細(xì)菌自凝絮性能等方面進(jìn)行了優(yōu)化，促進(jìn)細(xì)胞更方便地從培養(yǎng)液中分離出來。

細(xì)菌體積調(diào)控的研究最早是在大腸桿菌中展開的，研究最多的是細(xì)胞骨架蛋白MreB和細(xì)胞分裂蛋白FtsZ［66-68］。Wang等［69］抑制E.coli中ftsZ基因，使細(xì)胞從棒狀變?yōu)榻z狀，PHB含量和細(xì)胞干重增加100%，細(xì)胞靜置20 min后可以自行沉降從發(fā)酵液中分離出來。Jiang等［70］刪除E.coliJM109SG中mreB基因，使細(xì)胞變?yōu)榍蛐?，?xì)胞尺寸增大到5～10μm，PHB含量也顯著增加。Elhadi等［71］利用CRISPRi技術(shù)同時抑制ftsZ和mreB基因表達(dá)，產(chǎn)生形態(tài)各異、體積增大的細(xì)胞，并且細(xì)胞內(nèi)PHB累積量與細(xì)胞體積成正比，約占細(xì)胞干重的40%～80%。由于mreB和ftsZ基因突變影響細(xì)菌分裂和生長，為更好地協(xié)調(diào)生長和體積調(diào)控的關(guān)系，急需進(jìn)一步對調(diào)控策略進(jìn)行優(yōu)化。Jiang等首先構(gòu)建mreB突變體，然后將mreB基因連入溫敏質(zhì)粒再轉(zhuǎn)入突變體中，該菌株在30℃時能夠表達(dá)一定量MreB蛋白，使細(xì)胞正常分裂生長，但當(dāng)溫度升到37℃時細(xì)胞中不再表達(dá)MreB，細(xì)胞體積增大，平均長度達(dá)到5μm；利用相同策略，ftsZ基因缺失細(xì)胞的平均長度達(dá)到500μm［59］。

除了增大細(xì)胞體積，改變細(xì)胞表面電荷是促進(jìn)細(xì)胞沉降的另一條有效途徑。Ling等［43］通過敲除H.campaniensisLS21中編碼電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白的etf操縱子，使細(xì)胞表面電荷降低、細(xì)胞疏水性提高，在停止攪拌后大多數(shù)細(xì)胞在1 min內(nèi)絮凝沉淀到反應(yīng)器底部，實現(xiàn)便捷分離。

菌體收集之后的裂解和內(nèi)含物的高效分離也是下一代工業(yè)生物技術(shù)研究的重要方向。Hajnal等［61］開發(fā)了基于lambda噬菌體裂解基因SRRz和合成核糖體結(jié)合位點（RBS）新型細(xì)胞自溶系統(tǒng)，當(dāng)細(xì)胞生長至OD600>10，并通過離心進(jìn)一步濃縮至OD600為200時，細(xì)胞自裂解可自發(fā)發(fā)生。Shen等［72］利用誘導(dǎo)型啟動子在細(xì)胞平臺期誘導(dǎo)minC和minD基因表達(dá)抑制分裂環(huán)形成，同時刪除PHA顆粒表面結(jié)合蛋白基因phaP1，獲得了細(xì)胞體積與PHA顆粒同時增大的菌株，PHA顆粒的尺寸最大達(dá)10μm。增大的PHA顆粒將降低回收難度，提高回收效率，對簡化加工過程具有重要意義。

2.4 發(fā)酵規(guī)模放大

基于工程化鹽單胞菌的下一代工業(yè)生物技術(shù)已經(jīng)首先在PHA的大規(guī)模生產(chǎn)中取得突破（圖3）［73］。Chen等［56］在鹽單胞菌中構(gòu)建了以葡萄糖和γ-丁內(nèi)酯為底物合成P3HB4HB的工程化菌株，在1 L和7 L發(fā)酵罐中分別進(jìn)行補料分批培養(yǎng)，在非無菌條件下培養(yǎng)48 h細(xì)胞干重超過70 g/L，P（3HB-co-12%4HB）含量達(dá)到干重的63%。在1000 L發(fā)酵罐中，經(jīng)過48 h培養(yǎng)細(xì)胞干重可以達(dá)到83 g/L，P（3HB-co-16%4HB）占比達(dá)到61%。Ye等［62］進(jìn)一步利用廢葡萄糖酸鹽代替葡萄糖作為碳源，使原料成本降低60%左右，同時建立數(shù)學(xué)模型并進(jìn)行合理計算用于指導(dǎo)補料策略和放大生產(chǎn)。在5000 L發(fā)酵罐中生長36 h后，CDW達(dá)到100 g/L，含60.4% P（3HB-co-13.5% 4HB），通過優(yōu)化廢玉米漿的用量，P3HB4HB含量達(dá)到74%。在嗜鹽菌中通過將發(fā)酵與下游提取工藝耦合，已成功地開發(fā)了一條穩(wěn)定、連續(xù)、低成本、高效生產(chǎn)P3HB4HB等多種材料的開放式工藝。

圖3 利用鹽單胞菌成功合成多種不同PHA材料［73］（a）使用T7-like誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)高產(chǎn)PHB；（b）利用非相關(guān)碳源在H.bluephagenesis TD08（prpC基因敲除）菌株生產(chǎn)PHBV；（c）利用γ-丁內(nèi)酯和葡萄糖在H.bluephagenesis TD40中生產(chǎn)P3HB4HB；（d）在H.bluephagenesis TD（phaC敲除）菌株中生產(chǎn)PhaP蛋白；（e）在H.bluephagenesis TD（phaC敲除）菌株中生產(chǎn)PhaR蛋白；（f）在加大或者加長的H.campaniensis LS21中（mreB基因敲除或者ftsZ基因敲除）生產(chǎn)PHB；（g）第一個5000L不滅菌開放連續(xù)塑料發(fā)酵罐，Halomonas spp.在發(fā)酵罐中生長；（h）在H.bluephagenesis TD LTT22中生產(chǎn)ALA基因：phaC—編碼PHA合酶；phaA—編碼β-酮硫解酶；phaB—編碼NADPH依賴乙酰乙酰輔酶A還原酶；prpC—編碼2-檸檬酸甲酯合酶；orfZ—編碼2-檸檬酸甲酯合酶；mreB—編碼細(xì)胞骨架蛋白；ftsZ—編碼細(xì)胞分裂蛋白；△ftsZ：：ftsZ-gfp—gfp基因插入ftsZ基因的C端，使后者喪失功能；hem1—編碼ALA合酶Fig.3 Engineering halophilic Halomonas spp.for production of multiple PHA products(a)Production of PHB using T7-like expression system in H.bluephagenesis TD-HⅠGH;(b)Production of PHBV in H.bluephagenesis TD08(without prpC)in the absence of propionic acid;(c)Production of P34HB in H.bluephagenesis TD40 usingγ-butyrolactone and glucose as carbon sources;(d)Production of PhaP in H.bluephagenesis TD(without phaC);(e)Production of PhaR by H.bluephagenesis TD(without phaC);(f)Production of PHB by enlarged or elongated H.campaniensis LS21 without mreB and deficient ftsZ,respectively;(g)The first 5000L plastic fermentor used to grow Halomonas spp.under open unsterile and continuous conditions;(h)Production of ALA in H.bluephagenesis TD LTT22Genes:phaC—encoding PHA synthase;phaA—encodingβ-ketothiolase;phaB—encoding NADPH dependent acetoacetyl-CoA reductase;prpC—encoding 2-methylcitrate synthase;orfZ—encoding 2-methylcitrate synthase;mreB—encoding cytoskeleton protein;ftsZ—encoding cell division protein;△ftsZ::ftsZ-gfp—a gfp gene was inserted into the C-terminal of ftsZ to destroy its function;hem1—encoding 5-amino-levulinic acid synthase

2.5 廢水循環(huán)

下一代工業(yè)生物技術(shù)減少了淡水使用，但產(chǎn)生含鹽廢水。目前含鹽廢水處理是一個難題，常用的方法有焚燒法、蒸發(fā)法、離子交換法、吸附法、膜分離法、高級氧化法、生物法等［74-76］。無論采用哪種方法都將額外增加生產(chǎn)成本，因此減少含鹽廢水排放是下一代工業(yè)生物技術(shù)迫切需要克服的難題。Ling等［43］探索建立了廢水循環(huán)使用技術(shù)體系，利用自凝絮菌株快速分離菌體后，在殘留營養(yǎng)物質(zhì)和發(fā)酵上清液中補充營養(yǎng)物質(zhì)，無需再次滅菌和接種，直接用于下一批細(xì)胞的生長，同時洗滌細(xì)胞所用的水也可以被帶回生物反應(yīng)器中繼續(xù)循環(huán)使用。利用該技術(shù)收集4批菌體僅產(chǎn)生1次高鹽廢水。這種發(fā)酵策略在降低下游處理成本的同時，還能促進(jìn)細(xì)胞生長、增加PHB產(chǎn)量，進(jìn)一步促進(jìn)以工程化鹽單胞菌為基礎(chǔ)的下一代工業(yè)生物技術(shù)的推廣應(yīng)用。

3 結(jié)論和展望

隨著鹽單胞菌分子操作平臺的不斷完善和菌株性能的不斷優(yōu)化，具有開放、非滅菌、連續(xù)培養(yǎng)特點的下一代工業(yè)生物技術(shù)已經(jīng)建立起來，并成功用于多種化學(xué)品的高效合成。相比傳統(tǒng)工業(yè)生物技術(shù)，基于工程化鹽單胞菌的下一代工業(yè)生物技術(shù)（NGIB）具有明顯優(yōu)勢（表1）。主要表現(xiàn)在：

①節(jié)能：無需高溫高壓滅菌。

②節(jié)水：用海水替代淡水，過程水可循環(huán)利用。

③節(jié)時：生產(chǎn)過程可連續(xù)。

④設(shè)備投資少：無需使用不銹鋼發(fā)酵系統(tǒng)，轉(zhuǎn)而使用便宜的塑料、陶瓷甚至水泥罐體或管道等。

⑤產(chǎn)物終濃度高：細(xì)菌在高密度下進(jìn)行產(chǎn)品合成。

⑥分離過程簡化：增大細(xì)菌體積或表面電荷，利于重力或自凝絮沉淀。

表1 下一代工業(yè)生物技術(shù)與當(dāng)前工業(yè)生物技術(shù)對比［9］Tab.1 Next generation industrial biotechnology(NGIB)compared with current industrial biotechnology

現(xiàn)階段NGIB還面臨一些技術(shù)難點，主要包括含鹽廢水的處理及對設(shè)備可能造成的腐蝕問題、菌株遺傳操作過程復(fù)雜問題和高密度下基因誘導(dǎo)表達(dá)成本高問題。為減少含鹽廢水排放，對底盤細(xì)胞進(jìn)行篩選，獲得了自凝絮底盤菌株，以此為基礎(chǔ)建立了連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)，減少廢水排放。但目前該技術(shù)只在H.campaniensisLS21中取得成功，其他嗜鹽菌株的自絮凝突變還有待進(jìn)一步篩選。高濃度鹽對不銹鋼發(fā)酵罐的腐蝕在中性或酸性環(huán)境中是一個嚴(yán)重問題。但對于嗜鹽嗜堿菌來說，其培養(yǎng)基pH在8.5以上，堿性環(huán)境下金屬保持在穩(wěn)定狀態(tài)。本文作者在山東百盛生物科技有限公司多年來一直采用嗜鹽菌生產(chǎn)PHA，未發(fā)現(xiàn)明顯的發(fā)酵罐腐蝕現(xiàn)象。與E.coli相比，嗜鹽菌的基因操作方法還不完善，H.bluephacenesis和H.campaniensis不能通過化學(xué)或電刺激進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，而只能進(jìn)行結(jié)合轉(zhuǎn)化，增加了菌株改造的復(fù)雜性和難度。高密度發(fā)酵條件下基因誘導(dǎo)表達(dá)對PHA合成和細(xì)胞形態(tài)調(diào)控具有重要意義。目前常用的化學(xué)誘導(dǎo)劑價格昂貴、不同批次間穩(wěn)定性差，在嗜鹽菌中開發(fā)以溫度、光、pH或溶解氧等為誘導(dǎo)因素的誘導(dǎo)系統(tǒng)將使發(fā)酵過程中細(xì)胞生長更易控制，同時節(jié)省成本。

未來下一代工業(yè)生物技術(shù)將進(jìn)一步完善高鹽廢水循環(huán)利用策略，優(yōu)化基因操作工具，加強高密度發(fā)酵條件下調(diào)控模塊開發(fā)，加強對廉價底物利用途徑的設(shè)計，拓寬技術(shù)應(yīng)用規(guī)模和應(yīng)用領(lǐng)域，實現(xiàn)多種化學(xué)品大批量生產(chǎn)。NGIB的不斷完善使用將有力促進(jìn)化工制造向綠色生物制造的轉(zhuǎn)變，為大幅提升生物制造產(chǎn)品的競爭力貢獻(xiàn)力量。