內(nèi)耳異位再生毛細(xì)胞的ADF/destrin發(fā)育表達(dá)及其作用機(jī)制

涂澄宇 張亮 彭佳 (南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院耳鼻喉科，江西 南昌 330001)

哺乳動物的內(nèi)耳毛細(xì)胞比較脆弱，極易遭受噪聲、毒素等因素的影響，導(dǎo)致其毛細(xì)胞受到損害，而這些受損的毛細(xì)胞無法自發(fā)再生，這也是它們后天出現(xiàn)獲得性耳聾的主要原因。destrin會通過化學(xué)當(dāng)量促使纖維形肌動蛋白(F-actin)迅速實(shí)現(xiàn)解聚?，F(xiàn)階段，由哺乳動物各類組織內(nèi)純化得來的destrin，它會與F-actin原聚體相互結(jié)合，并把a(bǔ)ctin分子拆下來，并依托剪切、聚集到與之對應(yīng)的F-actin〔1〕。新生或成年鼠內(nèi)耳依然有部分細(xì)胞具備前體或者干細(xì)胞特征，上述細(xì)胞支持在體外培養(yǎng)條件下形成細(xì)胞球，并能夠分化為毛細(xì)胞樣細(xì)胞。與光感受器相比較，聽覺和前庭感覺上皮相似，出現(xiàn)更為復(fù)雜的感覺區(qū)，在以上感覺區(qū)主要任務(wù)在于合理平衡聲音、感受刺激，并通過化學(xué)信號轉(zhuǎn)化而來的毛細(xì)胞〔2〕。本文探究胚胎14.5 d直至其出生后4 d聽覺、半規(guī)管壺腹上皮發(fā)育中的ADF/destrin表達(dá)。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 青鏈霉素、谷氨酰胺均由Gibco公司提供；山羊、驢封閉血清均從MILLIPORE公司購入； 60 mm和100 mm培養(yǎng)皿、凍存管等產(chǎn)品均由Corning公司提供； 35 mm培養(yǎng)皿由Falcon公司提供；驢抗小鼠-Rho二抗(1∶200)、山羊抗小鼠cy5二抗(1∶200)；山羊抗兔-488二抗(1∶200)；ADF/destrin(兔來源單克隆抗體)(1∶100～1∶200)、E-cadherin(小鼠來源單克隆抗體)、Western印跡試劑盒(南京建成生物科技有限公司)、PCR試劑盒(大連TakaRa)等。

1.2孕鼠天數(shù)計算 挑選C57BL/6型生長健康的小鼠，雌、雄鼠數(shù)量依次為6只、2只，并于實(shí)驗的上午10點(diǎn)將3只雌鼠、1只雄鼠放到同一個窩內(nèi)，24 h后分開以后，次日上午除掉胚胎計作E0.5，依次類推從同窩后第15天、19天分別計作E14.5、E18.5。實(shí)際實(shí)驗中，同窩后第15天、19天下午8點(diǎn)、6點(diǎn)所取的胚胎依次計作E14.5、E18.5。

1.3胚胎小鼠實(shí)施耳蝸處理 采用頸部脫臼把孕鼠處死后，通過剖腹方法快速將子宮取出，將其置于1×磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4)溶液內(nèi)，并對胚囊進(jìn)行相應(yīng)的剝離，把得到的胚胎放在直立熒光纖維鏡下把胚胎放入冰冷的4%多聚甲醛溶液內(nèi)，并解剖內(nèi)耳，將其固定到4%多聚甲醛溶液內(nèi)，并在4℃冰箱內(nèi)保存。

1.4耳蝸全基底膜鋪片 在顯微鏡下把固定完成的耳內(nèi)移到1×PBS(pH7.4)溶液內(nèi)實(shí)現(xiàn)解剖操作，將耳蝸基底膜完整的取出來，除掉表面蓋膜等，并將其放在0.1%TritonX-100的1×PBS溶液內(nèi)室溫下進(jìn)行20 min漂洗處理，并在48培養(yǎng)孔板中開展免疫染色處理。

1.5組織離體實(shí)施病毒培養(yǎng) 采用脫臼的方法將新生小鼠實(shí)施處死處理，并采用75%酒精完成消毒，并把顳骨聽泡部位取出并盛到經(jīng)過滅菌處理的玻璃皿內(nèi)，在鏡下將耳蝸基底膜取出來。由35 mm×10 mm培養(yǎng)皿中事先加入已經(jīng)涂抹0.1%多聚萊氨酸蓋玻片，并增加1.0 ml的血清培養(yǎng)液中，移動基底膜保證匍匐貼壁。在37℃溫箱條件下實(shí)施孵育過夜。次日，把其換為無血清培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)入Ad5-EGFP-math1或Ad5-EGFP病毒，促使其終濃度成為病毒(PFU)1.0×108。在此基礎(chǔ)上，根據(jù)組織貼壁細(xì)胞生長狀況每隔1 d、2 d更換1次培養(yǎng)液。在37℃環(huán)境的溫箱進(jìn)行孵育，CO2濃度為5%，濕度控制為95%，并在轉(zhuǎn)入病毒后6 d、12 d取出培養(yǎng)皿觀察。

1.6開展掃描處理 利用Zeiss LSM510mets激光共聚焦的顯微鏡展開處理，依次設(shè)置不同的波長，分別為488 nm(FitC)、633 nm(cy5)、543 nm(rhodamin)的激光，對其進(jìn)行40倍放大操作，從耳蝸基底膜自頂層慢慢向下完成掃描，設(shè)定層厚數(shù)值為0.5 μm，圖像分辨率設(shè)定為2 048×2 048。

1.7小鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化體系建立及ADF/destrin敲除體獲得 取出實(shí)驗小鼠的內(nèi)耳耳蝸，將其Cochlear組織小心放入35 mm的平皿中，加入適量無菌PBS緩沖溶液；在24孔板中，小心加入無菌的圓形小玻片，其直徑約為14 mm，并在小玻片上加入一定量的尾膠稀釋液，置于37℃中孵育15 min；接著，將內(nèi)耳組織小心放入含有尾膠的24孔板中，再繼續(xù)加入1 ml的DMEM/F12培養(yǎng)基；輕輕的平穩(wěn)的將24孔板小心置于培養(yǎng)箱中，整個過程保證耳蝸不動，緊密貼著鼠尾膠；小鼠cochlear培養(yǎng)過程中，可以加入適量100 mg/L 4-OH Tamoxifen誘導(dǎo)Cre活性；繼續(xù)培養(yǎng)7～10 d后，觀察并拍照。

1.8小鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化體系建立 本研究參考劉亞青等〔3〕研究方法，成功地構(gòu)建了小鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞體外誘導(dǎo)體系，其內(nèi)耳支持細(xì)胞來源于Math1-GFP小鼠。ADF/destrin敲除體獲得是通過與生物公司合作，由生物公司上海斯萊克實(shí)驗動物有限公司構(gòu)建。

1.9切片制作 先修整小鼠內(nèi)耳組織，經(jīng)流水沖洗30 min后，取掉多余固定液；接著依次將其浸泡在70%、80%、90%和100%的乙醇中各脫水1 h，在100%的乙醇中多脫水1 h；接著，在二甲苯中，使得腦組織透明化，處理2次，分別為15 min和10 min；最后，將其依次放入恒溫箱中，融化石蠟，每次1 h，重復(fù)3次。再將處理后的內(nèi)耳組織按照順序包埋成塊狀，連續(xù)冠切片，每張切片保證其厚度約為5 um，切片完成后，用于后續(xù)組織形態(tài)學(xué)和免疫組化學(xué)檢測。小鼠內(nèi)耳組織HE染色方法如下：將上述準(zhǔn)備好的切片，浸入二甲苯中，2次，每次約為10 min；浸入100%乙醇中，2次，每次約為10 min；再依次浸入90%、80%、70%酒精及蒸餾水中，各約5 min；再用配制好的蘇木素染色液染色8 min，染色完成后，用自來水沖洗；分化20 s(由70%乙醇加1%鹽酸配制而成)后，浸入蒸餾水中處理5 min；接著按照70%、80%乙醇，浸泡5 min；再浸入含有90%伊紅醇溶液中，浸泡10 min；再浸入100%乙醇中，2次，每次5 min；再浸入二甲苯中，2次，每次5 min；最后，在中性樹膠中封片，顯微鏡下觀察。

1.10統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1正常小鼠耳蝸基底膜中ADF/destrin表達(dá) 胚胎期14.5 d(E14.5)至出生后的第4天(P4)期間，ADF/destrin處于耳蝸中分布狀況。在E14.5狀態(tài)下，destrin 處于分散分布的狀況，且毛細(xì)胞和支持細(xì)胞均有與之對應(yīng)的表達(dá)，如圖1所示。在出生后第1天(P1)時，destrin大多出現(xiàn)在毛細(xì)胞纖毛及其內(nèi)指細(xì)胞中；P4時主要存在至此細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有表達(dá)。

圖1 小鼠從胚胎至出生后各階段耳蝸中ADF/destrin表達(dá)(×200)

2.2dADF/destrin在小鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化體系中的表達(dá) 隨著誘導(dǎo)時間的增加，Math1的表達(dá)量也在增加，同時，dADF/destrin的表達(dá)也在增加，并且在第6天達(dá)到高峰期。見表1，圖2。

表1 相關(guān)基因表達(dá)分析

圖2 Western 印跡檢測培養(yǎng)不同時間Math1、dADF/destrin表達(dá)水平

2.3敲除dADF/destrin抑制小鼠毛細(xì)胞發(fā)育 通過Cre/Loxp系統(tǒng)，成功地構(gòu)建了小鼠dADF/destrin敲除體，當(dāng)小鼠在E13～E15時，通過灌胃的方式，給予小鼠Tamoxifen，進(jìn)一步誘導(dǎo)Cre活性。同時，當(dāng)胎鼠為20 d時，通過組化法分析突變胎鼠的內(nèi)耳表型。與正常小鼠相比，dADF/destrin敲除小鼠體積更小，發(fā)育遲緩，且內(nèi)耳結(jié)構(gòu)也有一定的絮亂。見圖3、圖4。

圖3 HE染色分析正常小鼠與敲除小鼠內(nèi)耳結(jié)構(gòu)(×200)

圖4 正常小鼠與敲除小鼠胚胎發(fā)育

3 討 論

哺乳動物內(nèi)耳形態(tài)發(fā)生改變屬于比較比較復(fù)雜的過程，毛細(xì)胞是處在內(nèi)耳的機(jī)械感受器細(xì)胞，可以把聲音、運(yùn)動信號等轉(zhuǎn)換為電化學(xué)信號。哺乳動物的耳蝸毛細(xì)胞再生能力有一定的限制，利用藥物或基因干預(yù)可以對其實(shí)施恰當(dāng)?shù)男迯?fù)。根據(jù)小鼠實(shí)驗結(jié)果可知，細(xì)胞周期蛋白大部分使用激酶抑制劑(CDKI)p27等，確保哺乳動物支持細(xì)胞可以順利進(jìn)入細(xì)胞周期作為重要的調(diào)節(jié)因素〔4〕。為保證哺乳動物的毛細(xì)胞受到相應(yīng)的損傷后可以及時修復(fù)，以上蛋白均可當(dāng)做短暫性基因?qū)袠?biāo)敲除?；诖?，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒Atoh1因子保障成熟的細(xì)胞可以轉(zhuǎn)化為毛細(xì)胞。除此之外，異位再生毛細(xì)胞發(fā)育時期是否出現(xiàn)平面細(xì)胞極性(PCP)改變受到多數(shù)研究者的重視和關(guān)注。ADF/destrin屬于肌動蛋白解聚因子中不可缺少的一部分，其他成員包含cofilin2、cofilon1。ADF/destrin出現(xiàn)在海馬錐體細(xì)胞全部的興奮性突觸，且突出前、后結(jié)構(gòu)均有出現(xiàn)，這為動物ADF/destrin相關(guān)問題研究提供一定的參考〔5〕。但ADF敲除突變體發(fā)生突觸前保留其生理功能之外，ADF失活并沒有影響動物的神經(jīng)元及其他功能師傅恢復(fù)正常。通過研究野生型果蠅發(fā)育情況可知，視網(wǎng)膜細(xì)胞通過5倍的延長，tsr RS突變體因伸展階段缺失，導(dǎo)致黏附連接變寬〔6〕。

感覺細(xì)胞、成熟神經(jīng)元大部分源自細(xì)胞表面，也稱為原纖毛細(xì)胞突起。原纖毛基體并沒有得到生產(chǎn)，在參與細(xì)胞分裂過程中有絲分裂紡錘體內(nèi)，如果原纖毛發(fā)生有絲分裂前會受到再次吸收，這一細(xì)胞周期和纖毛形成密切的聯(lián)系，說明原纖毛發(fā)育環(huán)節(jié)發(fā)生細(xì)胞增殖及分化產(chǎn)生重要的影響。原纖毛具體功能展現(xiàn)在細(xì)胞天線上，其具體表現(xiàn)為及時接收細(xì)胞外信號，用于合理調(diào)節(jié)動物大腦發(fā)育狀況〔7,8〕。在上述研究背景下，原纖毛發(fā)育與出現(xiàn)疾病相關(guān)性成為研究的熱點(diǎn)問題，細(xì)胞表面突起多數(shù)參與機(jī)械刺激中，其主要缺點(diǎn)會使得部分器官出現(xiàn)功能性疾病。原纖毛作為化學(xué)及機(jī)械信號兩方面進(jìn)行處理的感受器，它不單能夠整合細(xì)胞周圍信息，各整合操作發(fā)揮著重要的作用〔9〕。從某些分裂細(xì)胞視角分析，原纖毛對細(xì)胞是否要重新進(jìn)入其周期并保持靜止?fàn)顟B(tài)產(chǎn)生影響，使原纖毛發(fā)育一個關(guān)鍵的事件在于前體細(xì)胞/干細(xì)胞之間的不對稱分裂，進(jìn)而發(fā)生相同或展現(xiàn)出不同命運(yùn)的子代。有絲分裂過程中分裂面成為判斷肝細(xì)胞分裂是否對稱具有重要的影響，原纖毛極易對分裂后2個子代細(xì)胞有影響。隨著醫(yī)學(xué)界對原纖毛問題研究的更深入，能夠獲取關(guān)于感覺發(fā)育機(jī)制的新見解〔3,10〕。ADF失活并不會影響神經(jīng)元分化及其突觸功能。本研究結(jié)果表明，耳蝸聽覺上皮及其前庭感覺上皮發(fā)育階段ADF/destrin出生4 d后主要出現(xiàn)在支持細(xì)胞中，這一情況與毛細(xì)胞、支持細(xì)胞負(fù)責(zé)的各功能有著緊密的聯(lián)系；本研究提示，這一時期動纖毛上肌動蛋白解聚活動非常強(qiáng)，之所以發(fā)生這種狀態(tài)，可能于動物的纖毛發(fā)育或退化情況有著密切的聯(lián)系。本研究結(jié)果還表明，ADF/destrin在橢圓囊、半規(guī)管壺腹毛細(xì)胞表皮板到小鼠出生后仍然有所表達(dá)，表明與前庭感覺上皮相比較，耳蝸聽覺發(fā)育更早。