柚皮素對心肌梗死大鼠血管新生的促進作用及機制研究

王欣?李磊?陳元友?吳瀟

【摘要】目的 探究柚皮素對心肌梗死大鼠血管新生的促進作用及其作用機制。方法 將50只SPF級SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、阿司匹林組[100 mg/（kg·d）]、柚皮素高劑量組[100 mg/（kg·d）]和柚皮素低劑量組[50 mg/（kg·d）]，每組10只。采用冠狀動脈前降支結(jié)扎法建立大鼠心肌梗死模型，造模后24 h 給藥，連續(xù)4周。末次給藥后檢測大鼠心功能指標(biāo)，HE染色和Masson染色觀察心肌組織病理學(xué)變化，免疫組織化學(xué)染色檢測心肌組織血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子（CD31）表達，計算微血管密度（MVD），蛋白免疫印跡法檢測心肌組織中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）蛋白表達情況。結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心功能指標(biāo)較差，心肌組織排列紊亂，纖維化明顯，MVD數(shù)量和CD31、VEGF、bFGF表達水平均高于假手術(shù)組（P均< 0.05）。與模型組比較，高劑量和低劑量柚皮素可改善大鼠心功能，減輕心肌組織損傷和膠原纖維沉積，增加MVD數(shù)量，提高CD31、VEGF、bFGF表達水平，且柚皮素高劑量組的作用優(yōu)于柚皮素低劑量組（P均< 0.05）。結(jié)論 柚皮素能夠促進心肌梗死大鼠血管新生，其作用機制可能與VEGF、bFGF蛋白表達水平升高有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】心肌梗死;柚皮素;血管新生;血管內(nèi)皮生長因子;堿性成纖維細(xì)胞生長因子

Study on the promoting effect and mechanism of naringenin on angiogenesis in rats with myocardial infarction Wang Xin， Li Lei， Chen Yuanyou， Wu Xiao. Department of Cardiology， Pengshui Branch， the Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University， Chongqing 409600， China

Corresponding author， Wu Xiao， E-mail： liang584chun@ 163. com

【Abstract】Objective To explore the effect and mechanism of naringenin on the angiogenesis in rats with myocardial infarction. Methods Fifty SPF SD rats were randomly divided into sham operation group， model group， aspirin group， high-dose naringenin group （100 mg/（kg·d）） and low-dose? naringenin group （50 mg/（kg·d））， with 10 rats in each group. Myocardial infarction rat models were established by ligation of the anterior descending branch of coronary artery and administered at 24 h after modeling for 4 consecutive weeks. After the final administration， cardiac function indexes were detected. The pathological changes of myocardial tissues were observed by HE staining and Masson staining. The expression level of platelet-endothelial cell adhesion molecule-1 （CD31） was measured by immunohistochemical staining. The microvessel density （MVD） was calculated. The expression levels of vascular endothelial growth factor （VEGF） and basic fibroblast growth factor （bFGF） proteins in the myocardial tissues were detected by Western blot. Results Compared with the sham operation group， the indexes of cardiac function in the model group were worse， the arrangement of myocardial tissue was disordered， and the fibrosis was more obvious. The MVD and the expression levels of CD31， VEGF and bFGF in the model group were significantly higher than those in the sham operation group （all P < 0.05）. Compared with the model group， high-dose and low-dose naringenin could improve cardiac function， mitigate myocardial tissue damage， reduce collagen fiber deposition， increase the MVD， and up-regulate the expression levels of CD31， VEGF and bFGF. The effects of high-dose naringenin were significantly better than those of low-dose naringenin （all P < 0.05）. Conclusion Naringenin can promote the angiogenesis in rats with myocardial infarction， probably by up-regulating the expression levels of VEGF and bFGF proteins.

【Key words】Myocardial infarction;Naringenin;Angiogenesis;Vascular endothelial growth factor;

Basic fibroblast growth factor

心肌梗死是因冠狀動脈閉塞造成急性、持續(xù)性缺血缺氧所引起的心肌壞死，臨床表現(xiàn)為劇烈胸骨后疼痛，可并發(fā)心律失常、心力衰竭或休克，嚴(yán)重威脅人類生命健康[1-2]?！吨袊难懿蟾?018》結(jié)果顯示，中國心血管病的發(fā)病率及病死率仍在逐年上升，AMI是心血管疾病患者死亡的主要原因[3]。血管新生指在原有血管基礎(chǔ)上生長形成的新血管，包括血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、分化和毛細(xì)血管形成及管壁重構(gòu)等活動，是機體對缺氧狀態(tài)的一種自然響應(yīng)過程[4]。治療性血管新生已被證明能夠恢復(fù)缺血心肌血液供應(yīng)，減少組織梗死，改善預(yù)后，在心血管疾病治療領(lǐng)域逐漸受到重視[5]。

柚皮素是傳統(tǒng)中藥枳實、枳殼中的有效活性成分，屬二氫黃酮類化合物，具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抗菌、抗炎、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和心臟保護等多種藥理作用[6]。研究表明，柚皮素能夠有效改善心臟功能，減輕氧化應(yīng)激和心肌細(xì)胞凋亡，預(yù)防心肌梗死[7]。目前，雖已有研究證明柚皮素具有心臟保護作用，但關(guān)于柚皮素對心肌梗死后血管新生的促進作用鮮有報道。本研究通過建立大鼠心肌梗死模型，深入觀察柚皮素是否可以通過促進血管新生改善大鼠心功能，促進心肌損傷修復(fù)，并初步探究其作用機制。

材料與方法

一、材 料

1.實驗動物

SPF級SD大鼠50只，雌雄各半，6 ～ 8周齡，體質(zhì)量180 ～ 220 g，購自河南省實驗動物中心[SCXK（豫）2017-0001]，飼養(yǎng)在河南省實驗動物中心實驗室獨立動物房[SYXK（豫）2016-0002]。實驗動物及飼養(yǎng)條件符合《實驗動物管理條件》要求。飼養(yǎng)條件：室溫（22±1）℃，濕度（50±10）%，每天定時換氣，保持12 h∶12 h光暗照明，食水不限。研究方案獲倫理委員會批準(zhǔn)。

2.主要試劑與儀器

柚皮素（Sigma-Aldrich，批號：W530098），阿司匹林腸溶片（拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號：BJ49401），HE染色試劑盒、Masson染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），兔IgG-免疫組織化學(xué)（組化）試劑盒SABC即用型（武漢博士德生物工程有限公司），血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子（CD31）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）兔源單克隆抗體，羊抗兔二抗（美國CST公司），雙板垂直電泳儀（北京六一儀器廠，型號：DYCZ-24KS），IX53顯微鏡（日本奧林巴斯），G：BOX多功能凝膠成像系統(tǒng)（Syngene），多普勒超聲儀（美國Beckman公司），Multiskan MK3酶標(biāo)儀（Thermo Fisher Scientific），TGL16MB高速冷凍離心機（長沙湘智離心機儀器有限公司）。

二、實驗方法

1.分組與造模

將50只SPF級SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、阿司匹林組、柚皮素高劑量組和柚皮素低劑量組，每組10只。模型組、阿司匹林組、柚皮素高劑量組和柚皮素低劑量組大鼠通過結(jié)扎冠狀動脈前降支建立心肌梗死模型，造模參考文獻[8]的方法：大鼠腹腔注射10 %水合氯醛麻醉，以仰臥位固定于手術(shù)臺，經(jīng)口行氣管插管，接入呼吸機輔助呼吸。胸前區(qū)備皮消毒，在胸骨左側(cè)第3、4肋間開胸，暴露心臟，在心臟前降支下2 ～ 3 mm處結(jié)扎冠狀動脈，可見局部心肌由紅色變?yōu)榘咨湛s減弱，將心臟放回胸腔，縫合傷口，若心電圖可見Ⅱ?qū)?lián)ST段較手術(shù)前抬高0.2 mV以上則視為造模成功。經(jīng)觀察，模型組、阿司匹林組、柚皮素高劑量組和柚皮素低劑量組大鼠均造模成功。假手術(shù)組大鼠僅開胸，不做冠狀動脈結(jié)扎。從造模當(dāng)天開始肌肉注射4萬單位青霉素預(yù)防傷口感染，每日1次，連續(xù)3 d。造模完成后，各組大鼠均存活，存活率為100%。

2.給藥方法

造模24 h后開始給藥。結(jié)合文獻[9]及預(yù)實驗的結(jié)果，我們分別灌胃給予柚皮素高劑量組和柚皮素低劑量組大鼠100 mg/（kg·d）和50 mg/（kg·d）柚皮素（藥物采用0.5% CMC-Na混合均勻），阿司匹林組大鼠灌胃100 mg/（kg·d）阿司匹林腸溶片（藥物研磨后溶于生理鹽水），假手術(shù)組和模型組大鼠灌胃20 ml/kg生理鹽水，每日1次，連續(xù)4周。

3.心功能指標(biāo)檢測

大鼠心功能指標(biāo)在最后一次給藥后2 h檢測，檢測通過多普勒超聲儀完成，檢測指標(biāo)包括LVEF、左室短軸縮短率（LVFS）、左室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）和左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD），連續(xù)檢測3個心動周期，取平均值作為檢測數(shù)據(jù)。

4. HE染色

處死大鼠，分離心臟，其中5只大鼠心臟放置于4%多聚甲醛溶液中固定，用于HE染色、Masson染色和免疫組化染色，另5只大鼠心臟組織凍存于-80℃超低溫冰箱中，用于蛋白免疫印跡法檢測。將大鼠心臟組織在4%多聚甲醛溶液中固定48 h，蒸餾水清洗，然后置于50%、70%、85%、95%、100%的乙醇中進行梯度脫水，制作組織蠟塊，冰上預(yù)冷切片（厚度為4 μm），二甲苯脫蠟30 min，在95%、80%的乙醇及蒸餾水中復(fù)水，使用蘇木精和伊紅染液分別染細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，脫水、透明后用中性樹膠封片，置于顯微鏡下觀察大鼠心臟組織病理變化。

5. Masson染色

取使用4%多聚甲醛溶液固定的大鼠心臟組織，切片、脫蠟、復(fù)水過程同上。Weigert 鐵蘇木素染色5 min，酸性乙醇分化5 ～ 15 s水洗，Masson藍化液返藍3 ～ 5 min水洗，麗春紅酸性品紅染色液染色5 ～ 10 min，弱酸工作液（蒸餾水∶弱酸溶液= 2∶1）洗滌1 min，磷鉬酸溶液染色1 min，弱酸工作液洗滌1 min，苯胺藍染色1 ～ 2 min，弱酸工作液洗滌1 min，95%乙醇和無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，置于顯微鏡下觀察心臟組織纖維化情況。

6.免疫組化染色

取大鼠心臟組織制作石蠟切片，方法同上。將組織切片60℃烤片2 h，二甲苯脫蠟2 h，置于100%、95%、90%、80%的乙醇中復(fù)水，隨后進行抗原修復(fù)、封閉，滴加用磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋的CD31兔源單克隆抗體（稀釋比例為1∶100），放入濕盒中，蓋上蓋子，置4℃冰箱過夜，第2日37℃孵育羊抗兔二抗0.5 h，PBS沖洗后加DAB顯色液，蘇木精染細(xì)胞核，60%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇脫水，中性樹膠封片，置于顯微鏡下觀察。CD31陽性細(xì)胞可被染成棕黃色，主要分布于梗死周邊范圍，梗死區(qū)少見。選擇梗死周邊區(qū)域，隨機選取5個視野，計算CD31呈陽性的微血管數(shù)量，取平均值，即為微血管密度（MVD）。使用Image-Pro Plus 6. 0分析CD31陽性表達的光密度值（IOD），IOD值越大代表陽性表達率越高。

7.蛋白免疫印跡法

從-80 ℃中取大鼠心臟組織，冰上研磨，離心取沉淀，加入裂解液提取肺組織蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，加入loading buffer，在EP管中混勻后置于沸水中煮沸5 min使蛋白變性。配置15 %的分離膠和5 %的濃縮膠進行SDS-PAGE電泳，上樣后80 V電泳2 h，60 V轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂奶粉封閉2 h，隨后將條帶放入10 ml VEGF、bFGF兔源一抗稀釋液中，稀釋比例均為1∶1000，4℃過夜，第2日用TBST清洗后加入羊抗兔二抗（1∶2000）37℃孵育2 h，洗膜，滴加發(fā)光液，置凝膠成像系統(tǒng)顯影。內(nèi)參蛋白為GAPDH，Image J軟件分析各個蛋白對應(yīng)的灰度值，計算蛋白的相對表達量，蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 25.0 分析數(shù)據(jù)，實驗重復(fù)3次，計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、各組大鼠心功能指標(biāo)比較

假手術(shù)組、模型組、阿司匹林組、柚皮素高劑量組和柚皮素低劑量組5組間LVEF、LVFS、LVESD和LVEDD指標(biāo)比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F = 21.62、25.67、18.36、15.48，P均< 0.01）。與假手術(shù)組比較，模型組、阿司匹林組、柚皮素高劑量組和柚皮素低劑量組LVEF和LVFS均降低，LVESD和LVEDD均增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均< 0.05）;與模型組比較，阿司匹林組、柚皮素高劑量組和柚皮素低劑量組LVEF和LVFS增加，LVESD和LVEDD降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均< 0.05）;與阿司匹林組比較，柚皮素高劑量組心功能指標(biāo)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均> 0.05），柚皮素低劑量組LVEF和LVFS降低，LVESD和LVEDD增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均< 0.05）;與柚皮素高劑量組比較，柚皮素低劑量組LVEF和LVFS降低，LVESD和LVEDD增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均< 0.05），見表1。

二、HE染色觀察大鼠心肌組織形態(tài)變化

HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組心肌組織結(jié)構(gòu)正常、完整，心肌細(xì)胞分布均勻、有序，輪廓清晰可見，胞核與胞質(zhì)邊緣分明，血管管腔完整;與假手術(shù)組比較，模型組心肌組織則呈現(xiàn)著色較淺、組織排列紊亂、細(xì)胞輪廓不清晰和細(xì)胞破碎現(xiàn)象，伴有炎癥細(xì)胞浸潤;與模型組比較，柚皮素高劑量組心肌組織排列較為整齊，著色均勻，有少量炎癥細(xì)胞浸潤，血管管腔完整度較好，但阿司匹林組和柚皮素低劑量組心肌組織仍存在一定程度排列紊亂和心肌細(xì)胞核質(zhì)不清晰的現(xiàn)象，整體著色較淺;見圖1。

三、Masson染色觀察大鼠心肌膠原組織變化

Masson染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組心肌組織形態(tài)完整、清晰，鏡下視野呈紫紅色，部分血管周圍有少量呈藍色的膠原組織;與假手術(shù)組比較，模型組心肌組織排列紊亂，呈紫紅色的心肌組織明顯減少，存在大量呈藍色的膠原纖維，血管破碎，部分血管呈管腔狹窄和閉合現(xiàn)象;與模型組比較，柚皮素高劑量組和阿司匹林組均以紫紅色心肌組織為主，藍色膠原纖維大量減少，但柚皮素低劑量組仍存在較多的藍色膠原纖維組織，且組織分布較紊亂;見圖2。

四、各組大鼠免疫組化CD31染色及MVD比較

假手術(shù)組、模型組、阿司匹林組、柚皮素高劑量組和柚皮素低劑量組5組間CD31表達水平與MVD數(shù)量比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F = 21.37、16.54，P均< 0.01）。與假手術(shù)組比較，模型組CD31表達水平和MVD數(shù)量增加;與模型組比較，阿司匹林組、柚皮素高劑量組和柚皮素低劑量組CD31表達水平和MVD數(shù)量增加;與阿司匹林組比較，柚皮素高劑量組和柚皮素低劑量組CD31表達水平和MVD數(shù)量增加，其中柚皮素高劑量組CD31表達水平和MVD數(shù)量高于柚皮素低劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）;見圖3、表2。

五、各組大鼠心肌組織VEGF、bFGF蛋白表達水平比較

各組間VEGF、bFGF蛋白表達水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F = 48.36、29.44，P均< 0.01）。與假手術(shù)組比較，模型組、阿司匹林組、柚皮素高劑量組和柚皮素低劑量組VEGF、bFGF蛋白表達水平增加;與模型組比較，阿司匹林組、柚皮素高劑量組和柚皮素低劑量組VEGF、bFGF蛋白表達水平增加，其中柚皮素高劑量組VEGF、bFGF蛋白表達水平高于阿司匹林組和柚皮素低劑量組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均< 0.05），柚皮素低劑量組與阿司匹林組VEGF、bFGF蛋白表達水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均> 0.05）;見圖4、表2。

討論

心肌梗死是心血管疾病相關(guān)的主要死亡原因，常見治療方法包括藥物治療、溶栓治療、介入治療及冠狀動脈搭橋術(shù)等，雖然對于該類疾病的預(yù)防和治療研究已取得成效，但該病的發(fā)病率和病死率依然居高不下，且傳統(tǒng)療法對于冠狀動脈遠(yuǎn)端彌漫性病變、復(fù)發(fā)性病變及無法手術(shù)的嚴(yán)重多支病變效果不佳[10-11]。近年來，治療性血管新生成為冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、心肌梗死等心血管疾病臨床治療的研究熱點。新血管的形成和發(fā)展是對器官病理性損害或血液缺乏的重要潛在補救措施，通過各種療法促使心肌缺血區(qū)血管新生能夠為冠狀動脈提供有效的側(cè)支循環(huán)，從而改善心臟功能和心肌梗死[12]。

柚皮素是廣泛存在于蕓香科植物中的一種二氫黃酮類化合物，也是多種中藥的主要有效成分，研究表明柚皮素對多種原因?qū)е碌男募p傷具有保護作用，能夠改善心肌細(xì)胞凋亡和心肌纖維化，抑制心臟驟停大鼠的心臟衰竭和心肌損傷[13-14]。然而，柚皮素是否具有促進心肌梗死后血管新生的作用尚未可知，本研究構(gòu)建了大鼠心肌梗死模型，旨在觀察柚皮素對心肌梗死大鼠血管新生的促進作用，并初步探究其作用機制。

LVEF、LVFS、LVESD和LVEDD是評價心臟功能的常用指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組LVEF和LVFS均降低，LVESD和LVEDD均增加，與模型組比較，阿司匹林組、柚皮素高劑量組和柚皮素低劑量組LVEF和LVFS增加，LVESD和LVEDD降低，表明心肌梗死后大鼠的心功能降低，出現(xiàn)明顯的心室擴張和重構(gòu)，阿司匹林、高劑量和低劑量的柚皮素處理后可改善大鼠的心臟功能，減輕心肌梗死后出現(xiàn)的失代償性心室擴張。心肌細(xì)胞屬于終末細(xì)胞，當(dāng)發(fā)生心肌梗死時會造成不可逆轉(zhuǎn)的組織缺血壞死，從而誘發(fā)機體產(chǎn)生自我保護反應(yīng)，包括早期無菌性炎癥反應(yīng)和修復(fù)期成纖維細(xì)胞增殖、瘢痕及血管形成等活動，然而，持續(xù)的炎癥損傷和過度的修復(fù)反而加劇細(xì)胞死亡和心肌收縮功能障礙，不利于心功能的改善[15-16]。本研究采用HE染色和Masson染色觀察各組大鼠心肌梗死后心肌組織病理生理學(xué)改變，結(jié)果顯示假手術(shù)組心肌組織結(jié)構(gòu)正常、完整，心肌細(xì)胞分布均勻、有序，輪廓清晰可見，胞核與胞質(zhì)邊緣分明，血管管腔完整，僅部分血管周圍有少量呈藍色的膠原組織;與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織排列紊亂、細(xì)胞輪廓不清晰，呈紫紅色的心肌組織明顯減少，存在大量呈藍色的膠原纖維;與模型組比較，柚皮素高劑量組心肌組織排列較為整齊，血管管腔完整度較好，組織形態(tài)優(yōu)于阿司匹林組和柚皮素低劑量組，Masson染色顯示柚皮素高劑量組和阿司匹林組藍色膠原纖維大量減少，但柚皮素低劑量組仍存在較多的藍色膠原纖維組織，組織分布相對較紊亂，表明一定劑量的柚皮素能夠抑制心肌梗死導(dǎo)致的組織損傷，減輕心肌組織膠原纖維的沉積。

CD31是內(nèi)皮細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，在評價血管新生情況時多采用CD31免疫組織化學(xué)染色來統(tǒng)計MVD數(shù)量，以此反映血管的生成情況[17]。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組CD31表達水平和MVD數(shù)量增加，與模型組比較，阿司匹林及高劑量和低劑量的柚皮素均可增加心肌組織CD31表達水平和MVD數(shù)量，其中柚皮素高劑量組和柚皮素低劑量組CD31表達水平和MVD數(shù)量高于阿司匹林組，表明柚皮素能夠顯著增加大鼠心肌梗死后心梗邊緣區(qū)域CD31的表達，有效促進血管新生。VEGF是特異性最高、作用最強的促血管生成細(xì)胞因子，能夠特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進細(xì)胞增殖、出芽、遷移和血管形成過程，已被證明可促進缺血性心臟病患者血管新生[18]。

bFGF是一種生長刺激因子，能夠特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞，已有研究證實，VEGF和bFGF在促進血管新生過程中有明顯的協(xié)同效應(yīng)[19]。本研究結(jié)果顯示，模型組VEGF、bFGF蛋白表達水平高于假手術(shù)組，表明大鼠心肌梗死后，機體出現(xiàn)代償反應(yīng);與模型組比較，阿司匹林組、柚皮素高劑量組和柚皮素低劑量組VEGF、bFGF蛋白表達水平增加，其中柚皮素高劑量組VEGF、bFGF蛋白表達水平高于阿司匹林組和柚皮素低劑量組，表明柚皮素促進血管新生的作用可能與VEGF、bFGF蛋白表達水平升高有關(guān)。

綜上所述，柚皮素能夠改善心肌梗死大鼠的心功能，減輕心肌梗死后的組織損傷和膠原沉積，有效促進血管新生，其作用機制可能與VEGF、bFGF蛋白表達水平升高有關(guān)。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2020-07-21）

（本文編輯：楊江瑜）