Dectin-1、CARD9基因在角質(zhì)形成細(xì)胞對紅色毛癬菌應(yīng)答中的作用

陳佳沁?陳劍?鄧威威?蘇真?梁盼盼?湛舒婷

【摘要】目的 研究樹突狀細(xì)胞相關(guān)性C型凝集素-1（Dectin-1）和胱天蛋白酶募集域蛋白9（CARD9）基因在角質(zhì)形成細(xì)胞對紅色毛癬菌應(yīng)答中的作用。方法 將紅色毛癬菌與正常HaCaT細(xì)胞、Dectin-1、CARD9基因敲除HaCaT細(xì)胞共培養(yǎng)，用ELISA分析其細(xì)胞上清液中IL-6、? IL-8的表達(dá)情況。結(jié)果 Dectin-1基因敲除導(dǎo)致HaCaT細(xì)胞IL-6和IL-8基礎(chǔ)分泌明顯增加，敲除CARD9基因?qū)е翲aCaT細(xì)胞IL-6基礎(chǔ)分泌增加（P < 0.05）。在紅色毛癬菌的刺激下，和未感染相比，HaCaT細(xì)胞分泌的IL-8明顯減少（P < 0.05）;Dectin-1基因敲除的HaCaT細(xì)胞則表現(xiàn)為IL-6、IL-8分泌量明顯減少（P均< 0.05）;CARD9基因敲除的HaCaT細(xì)胞的IL-6、IL-8分泌則無明顯變化（P均> 0.05）。結(jié)論 Dectin-1基因和CARD9基因可能參與了維持表皮免疫穩(wěn)態(tài)，CARD9基因還可能介導(dǎo)了紅色毛癬菌引起的免疫應(yīng)答。

【關(guān)鍵詞】紅色毛癬菌;HaCaT細(xì)胞;樹突狀細(xì)胞相關(guān)性C型凝集素-1;

胱天蛋白酶募集域蛋白9

The roles of Dectin-1 and CARD9 genes in the response of HaCaT cells against Trichophyton rubrum Chen Jiaqin， Chen Jian， Deng Weiwei， Su Zhen， Liang Panpan， Zhan Shuting. Department of Dermatology， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China

Corresponding author， Chen Jian， E-mail： chj75_0@ 163. com

【Abstract】Objective To investigate the roles of Dectin-1 and caspase recruitment domain-containing protein9 （CARD9） genes in the response of HaCaT cells against Trichophyton rubrum. Methods In this experiment， Trichophyton rubrum was co-cultured with HaCaT cells， Dectin-1-/- HaCaT cells and CARD9-/- HaCaT cells， respectively. The expression levels of IL-6 and IL-8 in the cell supernatant were assessed by ELISA. Results Dectin-1 gene knockout resulted in a significant increase in the secretion of IL-6 and IL-8（both P < 0.05）， CARD9 gene knockout increased the secretion of IL-6 in HaCaT cells（P < 0.05）. After the infection of Trichophyton rubrum， the secretion of IL-8 was significantly decreased in HaCaT cells（P < 0.05）. Dectin-1-/- HaCaT cells showed a significant decrease of IL-6 and IL-8（both P < 0.05）， whereas no evident change was observed in the secretion of IL-6 and IL-8 in CARD9-/- HaCaT cells（both P > 0.05）.Conclusions Dectin-1 and CARD9 genes may play an important role in maintaining the immune homeostasis of the epidermis. CARD9 gene may be involved in mediating the immune response against Trichophyton rubrum.

【Key words】Trichophyton rubrum;HaCaT cell;Dectin-1;

Caspase recruitment domain-containing protein9

皮膚癬菌病是一種全球范圍內(nèi)常見的疾病，紅色毛癬菌為主要致病菌[1-3]。通常為淺部真菌感染，僅累及表皮及附屬器[4]。在免疫低下患者皮膚癬菌病也可表現(xiàn)為深部真菌感染疾病。致病菌侵入宿主的真皮和皮下組織，進(jìn)而播散到淋巴結(jié)和腦，甚至?xí)＜盎颊呱黐5-6]。

研究者發(fā)現(xiàn)樹突狀細(xì)胞相關(guān)性C型凝集素-1（Dectin-1）和胱天蛋白酶募集域蛋白9（CARD9）基因的突變和缺失會損害機(jī)體對真菌的抗感染免疫[7-10]。提示這兩個基因在皮膚癬菌病致病機(jī)制中存在十分重要的作用。HaCaT細(xì)胞是人類永生化表皮細(xì)胞，與正常人類角質(zhì)形成細(xì)胞分化特性相似。本研究通過分別將紅色毛癬菌與正常的HaCaT細(xì)胞、敲除了Dectin-1基因的HaCaT細(xì)胞、敲除了CARD9基因的HaCaT細(xì)胞共培養(yǎng)，檢測共培養(yǎng)前后炎癥相關(guān)因子變化，探討Dectin-1和CARD9基因在角質(zhì)形成細(xì)胞對紅色毛癬菌應(yīng)答中的作用。

材料與方法

一、實驗材料

1. HaCaT細(xì)胞

正常HaCaT細(xì)胞購買于賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司，分離自1例62歲患有黑色素瘤男性的正常外周皮膚。Dectin-1和CARD9基因敲除HaCaT（Dectin-1 ko和CARD9 ko）由課題組參照文獻(xiàn)[11]通過CRISPR-Cas9技術(shù)敲除Dectin-1和CARD9基因構(gòu)建，并經(jīng)過蛋白驗證和兩基因驗證保存于液氮中。

2. 皮膚癬菌

紅色毛癬菌T1a從中國普通微生物菌種保藏管理中心獲得，并經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定以及內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)和rRNA大亞基的D1-D2結(jié)構(gòu)域測序確認(rèn)。

二、主要試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基、TRIZOL試劑購自賽默飛世爾公司;沙保羅氏瓊脂培養(yǎng)基購自江門市凱琳貿(mào)易有限公司;ELISA試劑盒購于聯(lián)科生物;酶標(biāo)儀（EON267603）。

三、方 法

1. 細(xì)胞培養(yǎng)

HaCaT細(xì)胞用含有10%胎牛血清和1%雙抗的高糖改良伊格爾培養(yǎng)基培養(yǎng)至長滿細(xì)胞瓶，以每孔5×105個細(xì)胞接種于六孔板中，培養(yǎng)過夜。

2. 真菌孢子收集

將紅色毛癬菌在沙保羅瓊脂培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)14 d后，加磷酸鹽緩沖液用接種環(huán)刮取真菌孢子，微旋振蕩儀震蕩2 min后，11 μm過濾器過濾，2 ml磷酸鹽緩沖液洗滌（3000 轉(zhuǎn)/分，15 min） 2次。最后用2 ml酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（20%蛋白胨、10%酵母提取物、2%葡萄糖）置于37℃恒溫水浴鍋過夜培養(yǎng)。

3. 細(xì)胞與真菌孢子共培養(yǎng)

以感染復(fù)數(shù)為2將真菌孢子懸浮滴入細(xì)胞，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱（37℃，5% CO2）培養(yǎng)24 h。

4. ELISA檢測細(xì)胞因子IL-6、IL-8

提取培養(yǎng)24 h后細(xì)胞上清液，用ELISA試劑盒（IL-6、IL-8）按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。分別對紅色毛癬菌感染前后的HaCaT細(xì)胞、CARD9 ko和Dectin1 ko上清液進(jìn)行測定并用細(xì)胞用酶標(biāo)儀檢測。

將3次獨立重復(fù)實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

采用GraphPad Prism 7.04和SPSS 24.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量數(shù)據(jù)以表示。2組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Dunnet-t檢驗。P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、Dectin-1基因和CARD9基因敲除細(xì)胞驗證

對基因敲除細(xì)胞進(jìn)行蛋白免疫印跡法驗證，以復(fù)孔數(shù)目為2進(jìn)行凝膠電泳跑膠，可以清晰地看到Dectin-1 ko、CARD9 ko與HaCaT細(xì)胞相比，實驗孔目的條帶缺失，對照孔（WT）條帶明顯，見圖1。進(jìn)一步以β-actin為內(nèi)參抗體，可以發(fā)現(xiàn)實驗孔與對照孔內(nèi)參位置的條帶都十分清晰。結(jié)果表明目的基因已被成功敲除，即基因敲除細(xì)胞構(gòu)建成功，可以用于后續(xù)實驗。

二、 Dectin-1基因和CARD9基因敲除前后HaCaT細(xì)胞上清液中IL-6、IL-8表達(dá)情況

敲除了Dectin-1基因的HaCaT細(xì)胞IL-6（Dunnet-t = 9.607）和IL-8（Dunnet-t = 3.962）的分泌量均高于正常的HaCaT細(xì)胞（P均< 0.05）;而敲除了CARD9基因的HaCaT細(xì)胞相比于正常的HaCaT細(xì)胞，IL-6分泌量增加（Dunnet-t = 2.924），IL-8分泌量有增加趨勢但比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），見圖2（IL-6：F = 34.76，P < 0.001;IL-8：F = 7.344，P = 0.006）。

三、紅色毛癬菌感染前后HaCaT細(xì)胞上清中IL-6、IL-8表達(dá)情況

和未感染紅色毛癬菌的HaCaT細(xì)胞相比，正常的HaCaT細(xì)胞在紅色毛癬菌的感染下IL-8分泌量減少（t = 2.921，P < 0.05），IL-6有減少趨勢但比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）;Dectin-1敲除的HaCaT細(xì)胞在紅色毛癬菌的感染下IL-6（t = 9.134）和IL-8（t = 5.611）分泌量均減少（P均< 0.05）;而將紅色毛癬菌與CARD9基因敲除的HaCaT細(xì)胞共培養(yǎng)后IL-6、 IL-8的分泌量則無明顯改變（P均> 0.05），見圖3。

討論

角質(zhì)形成細(xì)胞是表皮最主要的構(gòu)成細(xì)胞，其表面的模式識別受體可以識別微生物的病原相關(guān)分子模式，誘導(dǎo)產(chǎn)生相應(yīng)的固有免疫信號，對抵御微生物皮膚感染有重要的作用[12-14]。然而皮膚表面有大量的正常菌群寄生，因此相關(guān)的固有免疫必須維持一個合適的強(qiáng)度，以維持表皮的免疫穩(wěn)態(tài)。我們的研究表明敲除Dectin-1和CARD9影響到了角質(zhì)形成細(xì)胞IL-6和IL-8的基礎(chǔ)分泌，這表明Dectin-1、CARD9信號通路對于參與維持表皮的免疫穩(wěn)態(tài)有重要的作用。

紅色毛癬菌是最主要的親人性皮膚癬菌，和親動物性、親土性皮膚癬菌相比，紅色毛癬菌感染所導(dǎo)致的皮損炎癥輕微，感染更傾向于慢性[15]。我們的實驗顯示角質(zhì)形成細(xì)胞被感染后，前炎癥因子IL-6和中性粒細(xì)胞趨化因子IL-8的分泌都有降低趨勢。這表明角質(zhì)形成細(xì)胞識別紅色毛癬菌后產(chǎn)生的一些信號，可以抑制IL-6和IL-8的分泌。這可能是其感染炎癥反應(yīng)輕微的重要機(jī)制。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，敲除Dectin-1并沒有改變這一趨勢，和沒有感染的陰性對照相比，Dectin-1敲除的HaCaT細(xì)胞，在紅色毛癬菌感染下IL-6、IL-8仍是降低趨勢。這表明角質(zhì)形成細(xì)胞并非通過Dectin-1來感受紅色毛癬菌的感染，進(jìn)而下調(diào)IL-6和IL-8的表達(dá)。而敲除CARD9后，紅色毛癬菌感染不能誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞下調(diào)IL-6、IL-8。因此我們推測角質(zhì)形成細(xì)胞通過某一受體，識別紅色毛癬菌，產(chǎn)生的信號經(jīng)由CARD9介導(dǎo)，最終抑制IL-6和IL-8 的表達(dá)。

Dectin-1受體是一個胞外 C 型凝集素樣跨膜受體，可識別真菌細(xì)胞壁碳水化合物中的β-（1，3） -葡聚糖[16]。在髓樣細(xì)胞中，Dectin-1一般通過識別配體觸發(fā)細(xì)胞中多種信號導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脾絡(luò)氨酸激酶（Syk）富集，作用于CBM復(fù)合體誘導(dǎo)激活NF-κB信號通路[17-18]。CARD9屬于CARD家族中的一員，是Dectin-1以及Dectin-2、Dectin-3等其它C型凝集素樣受體下游通路中的一個重要銜接蛋白，在抗真菌免疫中發(fā)揮重要作用[19-21]。我們的研究提示CARD9介導(dǎo)了紅色毛癬菌感染誘導(dǎo)的IL-6、IL-8下調(diào)，而Dectin-1并未參與這一過程。CARD9可能是接受了其它可以識別紅色毛癬菌的受體產(chǎn)生的信號，如Dectin-2、mincle等并進(jìn)一步向下游傳導(dǎo)[22-23]。

我們通過紅色毛癬菌和永生化的角質(zhì)形成細(xì)胞共培養(yǎng)開展體外研究，尚不能完全明確Dectin-1和CARD9基因?qū)t色毛癬菌感染臨床表現(xiàn)和轉(zhuǎn)歸的影響。仍需要進(jìn)行動物感染模型研究，或?qū)ο忍煨訢ectin-1和CARD9缺陷并伴有紅色毛癬菌感染的患者開展臨床研究以明確其作用。

綜上所述，Dectin-1基因和CARD9基因可能參與了維持表皮免疫穩(wěn)態(tài)，CARD9基因還可能介導(dǎo)了紅色毛癬菌引起的免疫應(yīng)答。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2020-06-12）

（本文編輯：楊江瑜）