保元湯提取工藝研究

袁玲玲 丁麗娜 錢如貴 卓純艷 黎恒荷 劉濤 趙明仙

摘要：目的?優(yōu)化保元湯提取工藝，提高有效成分提取率，降低提取物引濕性。方法?以人參、黃芪、甘草中所含特征成分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)選工藝條件。結(jié)果?通過試驗(yàn)優(yōu)選的工藝為：取經(jīng)破碎藥材，按1：10加入70%乙醇，回流提取2次，每次60 min，減壓回收乙醇，以原藥材0.05～0.1 g/mL濃度通過D101大孔樹脂吸附，70～80%乙醇洗脫，濃縮，80℃減壓干燥，得到保元湯提取物，得率為2.06%，人參總皂苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草酸的轉(zhuǎn)移率分別為92.17%、46.52%和42.66%，引濕性為9.67%。結(jié)論?研究?jī)?yōu)選的提取工藝，主要成分轉(zhuǎn)移率高，提取物得率和日服用量低，引濕性改善，工藝穩(wěn)定可行，可為保元湯提取工藝制訂提供依據(jù)，也可為其它中藥方劑開發(fā)和現(xiàn)代化研究提供思路。

關(guān)鍵詞：保元湯;提取;成分轉(zhuǎn)移率;引濕性

中圖分類號(hào)：R285.5?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?文章編號(hào)：1007-2349（2020）11-0066-05

保元湯為古代經(jīng)典方劑，主治元?dú)馓撊醢Y，組方包含人參、黃芪、甘草、肉桂、生姜等5味藥材，其中人參、黃芪為君臣藥味，傳統(tǒng)方為水煎劑，與其他傳統(tǒng)方劑一樣存在提取效率低、服用量大、易吸潮等問題。

現(xiàn)代研究證實(shí)，人參中的人參總皂苷具有多種藥理功能[1-2];黃芪中的毛蕊異黃酮葡萄糖苷具有明顯的抗氧化、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)活性[3-4];甘草中的甘草酸具有抗病毒、抗腫瘤、抗炎、抗心肌缺血等藥理作用[5]。文章以人參總皂苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草酸等3種主要活性成分作為評(píng)價(jià)和控制指標(biāo)，對(duì)提取工藝加以優(yōu)化，解決保元湯提取制備過程中存在的主要問題，為保元湯提取和現(xiàn)代制劑開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，具有較好的理論和實(shí)踐意義。

1?材料與方法

1.1?實(shí)驗(yàn)材料?人參、黃芪、甘草、肉桂，購自云南華優(yōu)中藥科技有限公司;毛蕊異黃酮葡萄糖苷（111920-201606），人參皂苷Rg1（110703-201832），人參皂苷Rb1（110704-201525），人參皂苷Re（110754-201122），甘草酸銨（110731-201720），均來源于中國(guó)食品藥品檢定研究院。

甲醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，20181102）;甲酸（天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，20100722）;乙腈（Fisher Chemical，180890，默克，75-05-8）;食用乙醇（云南楊林工業(yè)開發(fā)區(qū)汕滇藥業(yè)有限公司，20190701）;D101大孔樹脂（西安藍(lán)曉科技新材料股份有限公司）;Agilent ZORBAX Eclipse plus C18色譜柱（250mm × 4.6mm，5μm，用于檢測(cè)毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草酸）;漢邦Phecda C18色譜柱（250mm × 4.6mm，5μm，用于檢測(cè)人參總皂苷）。

1.2?儀器設(shè)備?ME204電子分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）;BT125D電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）;Aglient 1260高效液相色譜儀（Agilent Technologies Inc.，G1311C 1260 Quat pump四元泵，G1329B自動(dòng)進(jìn)樣器，G1316A 1260TCC柱溫箱，G1314F 1260VWD紫外檢測(cè)器）;Waters 2489 高效液相色譜儀（waters Inc.，515泵，2489檢測(cè)器）;SK250LH7超聲波清洗儀（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）;RE-52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）;DZF-6020MBE真空干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）;HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇科析儀器有限公司）。

1.3?保元湯處方?根據(jù)明代醫(yī)學(xué)典籍《簡(jiǎn)明醫(yī)彀》記載的用法用量和文獻(xiàn)[6]報(bào)道的制備方法，保元湯處方為：人參1500 g，黃芪3000 g，甘草750 g，肉桂300 g，生姜1500 g，輔料適量，共制成顆粒劑1000袋，每次1袋、每天2次，相當(dāng)于每天服用原藥材14.10 g。

1.4?分析檢測(cè)

1.4.1?HPLC檢測(cè)條件?毛蕊異黃酮葡萄糖苷，參照文獻(xiàn)[6]，色譜柱為C18，以乙腈（A）-0.2%甲酸溶液（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫（0～20 min，15%～40%A;20～25 min，40%A），流速1.0 mL/min，柱溫25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm。人參總皂苷（包含Rg1、Re、Rb1）、甘草酸，均參照《中國(guó)藥典》中人參、甘草藥材含量測(cè)定項(xiàng)下的方法，各成分均為各藥材特征成分，專屬性較好。

1.4.2?對(duì)照品溶液制備?精密稱取各對(duì)照品適量，其中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、人參皂苷Rg1、Re、Rb1，均用甲醇作為溶劑，甘草酸銨用70%乙醇溶液作為溶劑，配制成對(duì)照品貯備液，分別精密量取適量對(duì)照品儲(chǔ)備液，經(jīng)稀釋得到不同濃度的系列對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液。各對(duì)照品進(jìn)樣量為10～20 μL。

1.4.3?供試品溶液制備?保元湯提取液：取提取液適量（相當(dāng)于處方藥材10 g），減壓濃縮至稠膏，加甲醇超聲溶解，將內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

保元湯提取物：取提取物細(xì)粉適量（相當(dāng)于處方藥材1～2 g），精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇30 mL，超聲處理（功率180W，頻率53kHz）30 min，濾過，濾渣同法再處理一次，合并濾液，蒸至近干，殘?jiān)蛹状歼m量溶解，轉(zhuǎn)移至25～50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。經(jīng)大孔樹脂純化處理的提取物，精密量入25 mL甲醇，超聲處理30 min，放置室溫，補(bǔ)重，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2?結(jié)果與分析

2.1?藥材成分含量測(cè)定?按1.4.2方法制備各對(duì)照品溶液，按照1.4.1色譜條件檢測(cè)藥材，由于甘草與黃芪同含毛蕊異黃酮葡萄糖苷，在該項(xiàng)成分檢測(cè)中，取過四號(hào)篩甘草粉末約5 g，參照黃芪藥材含量測(cè)定項(xiàng)下制備方法進(jìn)行檢測(cè);其余成分均按照《中國(guó)藥典》藥材含量測(cè)定方法進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)樣體積10～20 μl。經(jīng)檢測(cè)，人參藥材中含人參總皂苷0.6317%（包含Rg1、Re、Rb1），黃芪含毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.0478%，甘草含甘草酸2.1678%、毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.0098%。

2.2?提取溶劑選擇?按50 g藥材處方量稱取10～50目粒徑范圍內(nèi)的各組方藥材，共4份，按料液比1：15分別加入水、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇溶液，回流提取1次，每次60min，經(jīng)減壓干燥得到提取物，計(jì)算提取物得率，檢測(cè)主要成分含量，計(jì)算成分轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見表1。

根據(jù)結(jié)果可知，以水作為提取溶劑，即傳統(tǒng)的水提取工藝，提取物得率較高，但3種成分含量和轉(zhuǎn)移率較低;隨著乙醇溶液濃度增加，提取物中人參總皂苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷等成分轉(zhuǎn)移率有增加趨勢(shì)，其中，以70%乙醇為溶劑所得提取物中人參總皂苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷的成分轉(zhuǎn)移率最高;而甘草酸成分轉(zhuǎn)移率變化不呈現(xiàn)規(guī)律，在兼顧君臣藥主成分含量處于較高水平的前提下，選擇70%乙醇作為提取溶劑優(yōu)勢(shì)較為明顯。

2.3?藥材粉碎粒度考察?將人參、黃芪、甘草、肉桂藥材粉碎后，分為大于10、10～24、24～50目等3個(gè)粒度段，生姜分別采取切片、切絲、切丁的處理方式，按50 g藥材處方量稱取不同粒度段的各味藥材，共3份，按料液比1：15分別加入70%乙醇溶液，回流提取1次，每次提取物60min，濃縮、干燥得提取物，計(jì)算提取得率，檢測(cè)主要成分含量，計(jì)算成分轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見表2。

根據(jù)結(jié)果可知，隨著藥材粉碎粒度的增加，保元湯提取物得率增加，但各成分轉(zhuǎn)移率的變化并不呈規(guī)律，可能是由于根或根莖類藥材存在根皮、根體、根須等不同部位成分含量差異，而進(jìn)一步細(xì)化粉碎會(huì)導(dǎo)致相互的配比失衡，出現(xiàn)某粒度段某部位占比較多的現(xiàn)象?？傮w而言，藥材粉碎粒度對(duì)成分轉(zhuǎn)移率影響不大，在保元湯提取過程中，藥材破碎工藝可選取較大的粒徑范圍。

2.4?提取工藝正交試驗(yàn)?結(jié)合2.2、2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果，取同一粒徑范圍為24～50目的人參、黃芪、甘草、肉桂等藥材，生姜切丁，按處方藥材總量100 g稱取各藥材，共9份，按表3設(shè)計(jì)的工藝條件進(jìn)行提取，提取完畢，分別收集各試驗(yàn)提取液，量取1/10體積（即10 g處方藥材），減壓蒸干，計(jì)算提取得率，檢測(cè)含量，計(jì)算成分轉(zhuǎn)移率，各成分檢測(cè)結(jié)果見表4，方差分析見表5。

根據(jù)表4～5結(jié)果，以均方差最低值所在因素列為誤差列進(jìn)行方差分析，對(duì)結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素有A、B、C因素，有明顯影響的指標(biāo)有人參總皂苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷，結(jié)合正交試驗(yàn)極差分析結(jié)果，得到最佳條件為A2B2C3，D折中選擇D2，其中C為提取次數(shù)，而根據(jù)詳細(xì)數(shù)據(jù)來看，差異主要來源于提取1次與提取2、3次數(shù)據(jù)，提取2、3次之間差異較小，由于提取次數(shù)對(duì)工藝能耗影響較明顯，當(dāng)C3優(yōu)勢(shì)不足以明顯時(shí)，可降水平選擇，人參總皂苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷C2：C3檢測(cè)結(jié)果比值分別為1：1.05、1：1.03，差異并不明顯，結(jié)合實(shí)際工藝，最終選擇C2，綜上所述，選擇A2B2C2D2為最佳提取工藝參數(shù)，即提取溶劑為70%乙醇，加10倍量，回流提取2次，每次60min。

2.5?干燥條件考察?取10～50目粒度段的各處方藥材，按處方藥材總量400 g稱取1份，在2.4正交實(shí)驗(yàn)得到的最佳工藝條件下進(jìn)行提取，提取液減壓濃縮至稠膏，混合均勻后分成3份，分別在60、70、80℃溫度下減壓干燥，得到的提取物合計(jì)得率為26.57%，各成分檢測(cè)結(jié)果見表6。

以上結(jié)果表明，成分含量和轉(zhuǎn)移率的不僅是干燥溫度，還與干燥時(shí)間相關(guān)，當(dāng)干燥溫度提高時(shí)，可縮短干燥時(shí)間，更利于成分保留，因此選擇80℃為減壓干燥溫度。

2.6?提取工藝小試?按處方稱取經(jīng)破碎得到的大于10目粒度段的各處方藥材（其中肉桂為細(xì)粉，生姜為?。Q取處方藥材總量140 g，共3份，按照2.4正交實(shí)驗(yàn)得到的最佳工藝進(jìn)行提取，在80℃減壓干燥得到保元湯提取物，批號(hào)分別為20191101、20191102、20191103，提取收率分別為28.44%、32.22%、31.42%，各成分檢測(cè)結(jié)果見表7。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，保元湯提取得率為28.44～32.22%，平均30.69%，較為穩(wěn)定;提取物中人參皂苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草酸成分含量較為穩(wěn)定，人參總皂苷成分轉(zhuǎn)移率能達(dá)到90%以上，毛蕊異黃酮葡萄糖苷成分轉(zhuǎn)移率均能達(dá)到47～50%，甘草酸成分轉(zhuǎn)移率67～79%，見表7。

2.7?成分富集純化?通過觀察小試樣品發(fā)現(xiàn)，2.6制備的保元湯提取物引濕性較強(qiáng)，在實(shí)驗(yàn)條件下暴露較短時(shí)間即出現(xiàn)吸潮現(xiàn)象，可能是由于小分子糖類物質(zhì)含量過高所致[7]，文章采用大孔樹脂純化方法去除提取物中糖類物質(zhì)，以降低提取物引濕性。

稱取處方總藥材140 g，共3份，按2.4正交實(shí)驗(yàn)得到的最佳工藝進(jìn)行提取，提取濃縮至無醇味，加水至1400～2800mL（相當(dāng)于原藥材濃度為0.05～0.1 g/mL），過D101大孔樹脂層析柱（內(nèi)徑5.8cm，高20cm，體積530mL，經(jīng)預(yù)處理），流速3～4BV/h，棄去流出液;用1400mL水洗脫，流速4～5BV/h，棄去水洗液;用75%乙醇1400mL洗脫，流速為1～2BV/h，收集洗脫液，減壓濃縮后干燥，得提取物，批號(hào)為20191104、20191105、20191106，提取收率分別為1.99%、2.10%、2.09%，各成分檢測(cè)結(jié)果見表7。

不同工藝條件下提取物各成分檢測(cè)結(jié)果、轉(zhuǎn)移率結(jié)果見表7，不同工藝下得率、服用量和引濕性比較見表8。

經(jīng)富集純化的提取物主成分人參總皂苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草酸轉(zhuǎn)移率分別為92.17%、46.52%和42.66%。與傳統(tǒng)水提取工藝比較，提取物得率由31.86%降低至2.09%，日服用量由4.49 g降至0.29 g;提取物引濕性由29.12%降至9.67%，吸潮現(xiàn)象得到明顯改善。

3?討論

古代經(jīng)典方劑研究需要在傳承古方的前提下不斷優(yōu)化改進(jìn)，在同等藥效的作用下，可開發(fā)更具優(yōu)勢(shì)的現(xiàn)代化中藥制劑，跨越中藥發(fā)展的瓶頸。本文針對(duì)保元湯提取物傳統(tǒng)制備方法中存在的問題，采用乙醇提取，人參、黃芪、甘草中人參總皂苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草酸等主要活性成分轉(zhuǎn)移率明顯提高。采用大孔樹脂純化工藝，可去除中藥中所含有的大量單糖或低聚糖，制備提取物日服用量降低，藥物引濕性明顯降低，可滿足不同制劑工藝要求，保證制劑產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定、可控，同時(shí)方便目標(biāo)人群使用，達(dá)到了預(yù)期效果。

4?小結(jié)

本文通過單因素實(shí)驗(yàn)、正交試驗(yàn)和小試工藝研究，優(yōu)選得到了保元湯的提取工藝，與傳統(tǒng)水提取工藝相比，主要藥味中有效成分轉(zhuǎn)移率提高，提取物引濕性降低，日服用量減少，本文不僅為保元湯提取工藝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制訂提供依據(jù)，也為其它中藥方劑提取和現(xiàn)代制劑研究提供思路。

此外，研究采用D101大孔吸附樹脂對(duì)保元湯主要成分進(jìn)行富集和純化，由于樹脂對(duì)各成分的選擇性不同，純化前后提取物中人參總皂苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷的轉(zhuǎn)移率變化不大，但甘草酸的轉(zhuǎn)移率明顯降低。大孔樹脂的吸附及解吸工藝受樹脂柱徑比、樣品濃度、吸附流速等多方面因素影響[8]，因此針對(duì)各成分的樹脂選擇和純化工藝條件還需要進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2020-05-06）