生長(zhǎng)抑素聯(lián)合吉西他濱對(duì)人胰腺癌BxPC-3細(xì)胞增殖抑制作用的研究*

劉 力 王文婷

湘南學(xué)院附屬醫(yī)院，湖南省郴州市 423000

胰腺癌患者死亡率高、預(yù)后差，全球范圍內(nèi)5年生存率不足5%，而在我國(guó)僅為4%[1-3],究其原因主要與診斷困難及易侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。大量文獻(xiàn)報(bào)道[4]胰腺癌的主要化療藥物“吉西他濱(Gem)”具有顯著耐藥性，亦被認(rèn)為是預(yù)后差的原因。故如何提高吉西他濱化療效果被廣大學(xué)者重視。針對(duì)于此，發(fā)現(xiàn)多種藥物(姜黃素[5]、維拉帕米[6]、漢防己甲素[7]等)能有效降低吉西他濱的耐藥性，提高化療效果。生長(zhǎng)抑素(SST)為臨床常用于治療胰腺疾病的藥物，被發(fā)現(xiàn)具有多種抗腫瘤作用，其中包括降低腫瘤對(duì)化療藥物的耐藥性。筆者前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)抑素可抑制胰腺導(dǎo)管狀乳頭癌細(xì)胞早期侵襲轉(zhuǎn)移和增強(qiáng)吉西他濱化療效果。為進(jìn)一步明確生長(zhǎng)抑素在胰腺原位癌細(xì)胞中是否同樣具有以上效應(yīng)，本課題組進(jìn)行了下述實(shí)驗(yàn)。通過觀察生長(zhǎng)抑素聯(lián)合吉西他濱對(duì)人原位胰腺癌細(xì)胞 BxPC-3進(jìn)行干預(yù)，監(jiān)測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞增殖抑制的影響，尋找臨床治療原位胰腺癌更有效的化療方案。

1 材料與方法

1.1 材料 人胰腺癌細(xì)胞株BxPC-3購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，吉西他濱及生長(zhǎng)抑素購(gòu)于揚(yáng)子江集團(tuán)藥業(yè)有限公司，DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)于MP Biomedicals公司，胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):BxPC-3細(xì)胞在DMEM完全培養(yǎng)基中(包含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、50μl/ml青霉素和100μl/ml鏈霉素雙抗)進(jìn)行培養(yǎng)。將其置于體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中，設(shè)置為37℃，待細(xì)胞生長(zhǎng)良好后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，使用胰酶進(jìn)行消化，用來配制為細(xì)胞懸液；調(diào)整細(xì)胞密度約為5×104細(xì)胞/ml，接種于96孔板中，每孔約5 000細(xì)胞數(shù)；同樣條件下培養(yǎng)24h后使細(xì)胞貼壁。取細(xì)胞進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)。分別得出吸光度值(OD值)后進(jìn)行計(jì)算，公式：細(xì)胞增殖抑制率 = (1-實(shí)驗(yàn)組OD值)/對(duì)照組OD值。記錄結(jié)果并制表。

1.2.2 MTT比色法檢測(cè)生長(zhǎng)抑素對(duì)細(xì)胞增殖影響：(1)在細(xì)胞中加入0、100、200、400、600、800μg/ml的SST，分別加入5復(fù)孔(此為實(shí)驗(yàn)組均為5復(fù)孔)，處理24、48、72h；(2)培養(yǎng)好后，吸去各孔內(nèi)的反應(yīng)液，使用無菌磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗2次，洗去剩余的殘留液，在5孔內(nèi)分別加入20μl MTT(5mg/ml)溶液，加入相應(yīng)培養(yǎng)液直至100μl，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h；(3)在每孔內(nèi)吸干MTT培養(yǎng)液，加入150μl二甲基亞砜(DMSO)，使用室溫?fù)u床進(jìn)行震蕩，震蕩時(shí)間5～10min，在波長(zhǎng)約490nm處采用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔的OD 值，通過公式計(jì)算各組細(xì)胞增殖抑制率；(4)由以上結(jié)果計(jì)算SST半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.2.3 MTT比色法檢測(cè)吉西他濱對(duì)細(xì)胞增殖影響：(1)在細(xì)胞中加入0、0.1、1、5、10、20、40、60μmol/L Gem，按SST IC50的濃度時(shí)間，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)處理；(2)干預(yù)方法同1.2.2；(3)由以上結(jié)果計(jì)算出Gem IC50 濃度。

1.2.4 MTT比色法檢測(cè)聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)胞增殖影響：(1)根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)得出SST、Gem IC50濃度，使用該濃度藥物處理，并進(jìn)行分組：A組:空白對(duì)照組，B組：SST IC50，C組：Gem IC50，D組：1/2(SST IC50+Gem IC50)，按SST IC50的時(shí)間進(jìn)行處理。(2)干預(yù)方法同1.2.2，計(jì)算各組細(xì)胞增殖抑制率。計(jì)算兩藥相互作用：q=D組抑制率/B及C組抑制率之和-B及C組抑制率之積。當(dāng)q值<0.85時(shí)，表示SST、Gem具有拮抗作用；當(dāng)0.85≤q值≤1.15，表示SST、Gem具有相加作用；當(dāng)q值>1.15時(shí)，表示SST、Gem具有協(xié)同作用。

2 結(jié)果

2.1 各濃度SST對(duì)BxPC-3細(xì)胞的增殖抑制作用 MTT實(shí)驗(yàn)觀察SST在不同濃度(0、100、200、400、600、800μg/ml)及不同作用時(shí)間(24、48、72h)的情況下，對(duì)BxPC-3細(xì)胞的抑制效率。SST干預(yù)24h后，僅800μg/ml濃度的生長(zhǎng)抑素對(duì)BxPC-3有抑制作用(P<0.05)；處理48h后，藥物濃度為600～800μg/ml處理組較陰性對(duì)照組的BxPC-3細(xì)胞增殖受到明顯抑制(P<0.05)，但是二組組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；處理72h后，濃度為400～800μg/ml處理組細(xì)胞增殖抑制率增加，800μg/ml處理組較600μg/ml處理組顯著增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)ANOVA分析，得出F值為9.279(P<0.01)，表明隨時(shí)間的增加其抑制率亦增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。當(dāng)濃度為600μg/ml的SST，在處理72h后，達(dá)到半數(shù)抑制(SST IC50)。見表1。

表1 SST對(duì)BxPC-3細(xì)胞增殖抑制

2.2 各濃度Gem對(duì)BxPC-3細(xì)胞的增殖抑制作用 依據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取Gem干預(yù)時(shí)間為72h。MTT 實(shí)驗(yàn)觀察Gem在不同濃度(0、0.1、1、5、10、20、40、60μmol/L)對(duì)BxPC-3細(xì)胞的抑制效率。結(jié)果顯示：各濃度Gem對(duì)BxPC-3細(xì)胞均具有抑制作用(P<0.05)，并且隨著藥物濃度增加其抑制率增加，呈正相關(guān)。當(dāng)藥物濃度為60μmol/L時(shí)，BxPC-3細(xì)胞增殖抑制率達(dá)90%以上。在濃度為20μmol/L Gem干預(yù)時(shí)達(dá)到半數(shù)抑制。見表2。

2.3 兩藥聯(lián)合對(duì)BxPC-3細(xì)胞的增殖抑制作用 MTT實(shí)驗(yàn)觀察600μg/ml SST(B組),20μmol/L Gem(C組)及兩藥聯(lián)合(SST 300μg/ml+Gem 10μmol/L)(D組)對(duì)BxPC-3細(xì)胞的抑制效率。結(jié)果顯示：B、C組均能抑制BxPC-3細(xì)胞的增殖，但D組抑制率明顯大于B、C組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。經(jīng)公式計(jì)算兩藥相互作用q=0.887，提示聯(lián)合用藥具有相加作用。

表2 Gem對(duì)BxPC-3O細(xì)胞增殖抑制作用

表3 SST和Gem聯(lián)合作用對(duì)BxPC-3細(xì)胞增殖抑制作用

3 討論

胰腺癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一，全球5年生存率低于5%。據(jù)國(guó)家癌癥中心的統(tǒng)計(jì)，中國(guó)每年新增約1.3%的胰腺癌患者，2015年，胰腺癌的發(fā)病概率一路攀升到惡性腫瘤排行的第九位，死亡率排名第六[8]。全球胰腺癌的發(fā)病率和死亡率也在迅速增長(zhǎng)[9]。預(yù)計(jì)到2030年，胰腺癌極有可能化身成為美國(guó)第二大致命癌癥。隨著醫(yī)學(xué)生物技術(shù)的發(fā)展，各種新的癌癥治療方案，如靶向治療、生物治療等紛紛出現(xiàn)[10]，然而，由于胰腺癌的復(fù)雜解剖學(xué)和病理學(xué)特征，治療效果差強(qiáng)人意。其預(yù)后如此差的主要原因[11-12]：(1)早期癥狀不明顯，有效診斷難度大；(2)腫瘤存在早期侵襲和轉(zhuǎn)移發(fā)生的可能，多數(shù)患者無法進(jìn)行根治性外科手術(shù)；(3)對(duì)一線化療藥物“吉西他濱”存在顯著耐藥性。

生長(zhǎng)抑素臨床常用于治療急性胰腺炎、胰腺手術(shù)后、胃泌素瘤、胰島素瘤等疾病，并有大量報(bào)道發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)抑素具有多種抗腫瘤作用[13-15]，包括誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡、阻斷癌細(xì)胞增殖周期、抑制腫瘤血管生成、抑制癌細(xì)胞侵襲等。高元平等[16]綜合報(bào)道了生長(zhǎng)抑素的抗腫瘤作用，其中提到生長(zhǎng)抑素能降低腫瘤對(duì)化療藥物的耐藥性，包括垂體腫瘤、肺癌、膽囊癌等。針對(duì)于此，筆者設(shè)想生長(zhǎng)抑素在胰腺癌化療中有同樣效果，降低吉西他濱耐藥性，有效提高化療效果。故開展了本系列實(shí)驗(yàn)。通過前期研究，發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)抑素可抑制人胰腺導(dǎo)管乳頭狀癌PANC-1和人轉(zhuǎn)移性胰腺癌AsPC-1細(xì)胞的增殖，并且能有效增強(qiáng)吉西他濱對(duì)人胰腺導(dǎo)管乳頭狀癌PANC-1的化療效果。而因胰腺癌早期原位癌病理類型在臨床上也很常見，為了進(jìn)一步闡明生長(zhǎng)抑素是否對(duì)原位胰腺癌細(xì)胞具有相同的作用，本研究小組繼續(xù)進(jìn)行了這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。BxPC-3細(xì)胞株源自原位胰腺癌細(xì)胞，故本實(shí)驗(yàn)采用胰腺癌BxPC-3細(xì)胞作為模式細(xì)胞。

在MTT實(shí)驗(yàn)中，干預(yù)24h后，僅800μg/ml處理組有抑制作用(P<0.05)。在48h后600～800μg/ml處理組具有抑制作用(P<0.05)，但是二組組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而在72h后，濃度為400～800μg/ml處理組均具有抑制作用，且800μg/ml處理組較600μg/ml處理組顯著增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說明生長(zhǎng)抑素需在一定濃度及作用時(shí)間方能對(duì)BxPC-3細(xì)胞起到顯著抑制作用。而作為胰腺癌主要化療藥物吉西他濱，它的抑制作用顯著存在。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知各濃度吉西他濱對(duì)BxPC-3細(xì)胞均具有抑制作用(P<0.05)，并且抑制率與藥物濃度呈正相關(guān)。依據(jù)以上結(jié)果計(jì)算出生長(zhǎng)抑素和吉西他濱半數(shù)抑制濃度，用此濃度聯(lián)合進(jìn)行干預(yù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：兩者聯(lián)合用藥組抑制率明顯大于單藥組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過計(jì)算兩藥相互作用率q=0.887,表面聯(lián)合用藥具有相加作用，能有效地提高吉西他濱化療效果，但能否應(yīng)用于臨床尚需在后續(xù)臨床試驗(yàn)中進(jìn)行驗(yàn)證。