葉酸對(duì)大鼠肺缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

夏艷，馬曉冬，謝云斌，邵東華

(1.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科，江蘇 鎮(zhèn)江 212001；2.江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院麻醉科，江蘇 鎮(zhèn)江 212002；3.常州市第一人民醫(yī)院麻醉科，江蘇 常州 213000)

肺缺血再灌注損傷(lung ischemia reperfusion injury，LIRI)是指缺血的肺在血流灌注恢復(fù)后，其組織病理損傷進(jìn)一步加重的一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，常發(fā)生于肺栓塞溶栓術(shù)后、體外循環(huán)、肺移植術(shù)后等，臨床表現(xiàn)常與急性呼吸窘迫綜合征的急性階段類似[1]。LIRI的進(jìn)展直接導(dǎo)致機(jī)械通氣時(shí)間延長，增加患者入住ICU的風(fēng)險(xiǎn)，延長住院時(shí)間并致患者死亡率升高[2]。葉酸是臨床一線使用的B族維生素，已證實(shí)能從細(xì)胞水平改善能量代謝，從而減少腦缺血再灌注的損傷[3]，亦能改善心肌缺血期間的心功能、減輕心肌再灌注損傷[4]。但是，葉酸在肺缺血再灌注中是否具有保護(hù)作用尚不明確，本研究將就此作一探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量300～350 g，由江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證編號(hào)：201708847，201709565。本研究過程中遵從國際有關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究的基本倫理和準(zhǔn)則，并通過江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院倫理審查委員會(huì)審查批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑和儀器 葉酸片購自常州制藥廠有限公司；大鼠血清IL-8 ELISA檢測(cè)試劑盒購自廈門慧嘉生物科技有限公司；大鼠血清TNF-α ELISA試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)公司；小動(dòng)物呼吸機(jī)購自加拿大Mexico公司；酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組與喂養(yǎng) 維持大鼠自然晝夜節(jié)律，自由進(jìn)食水。隨機(jī)均分為假手術(shù)組、肺缺血再灌注組和葉酸組(5、10、20 mg/d)，每組6只，其中葉酸組于造模前分別以葉酸劑量5、10、20 mg/d灌胃1周。

葉酸片溶于生理鹽水，配制成2.5 mg/mL的葉酸懸浮液，保存于4 ℃冰箱備用。葉酸組大鼠分別按每只每天2、4、8 mL灌胃?？紤]到大鼠的胃容量，實(shí)際操作時(shí)每日分2次分別于8:00和17:00各灌胃1、2、4 mL。

1.2.2 肺缺血再灌注模型構(gòu)建 7%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.5 mL/100 g)?？v行剪開頸部氣管前皮膚，鈍性分離皮下組織、頸部肌肉，將甲狀腺牽拉至氣管一側(cè)，顯露氣管。大約于第二、三氣管軟骨環(huán)位置橫行切開氣管，并向下做約0.5 cm長的T形切口，插入自備的氣管導(dǎo)管(臨床用頭皮鋼針上的橡膠軟管的外徑適合插入大鼠氣管，內(nèi)徑滿足機(jī)械通氣的阻力和流量要求，可用作本實(shí)驗(yàn)中大鼠的氣管導(dǎo)管)1 cm，絲線結(jié)扎固定。連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，吸空氣，容量控制模式，設(shè)置壓力0.02～0.25 MPa，頻率70 r/min，吸呼比1 ∶2.5，潮氣量10～12 mL/kg。缺血再灌注組和葉酸組以改良的Eppinger法[5]手術(shù)，結(jié)扎左側(cè)肺門30 min后再灌注2 h；假手術(shù)組氣管插管后只打開胸腔不結(jié)扎肺門，機(jī)械通氣2.5 h。術(shù)中根據(jù)需要間斷追加水合氯醛(誘導(dǎo)量的1/4～1/3)維持麻醉。

手術(shù)結(jié)束后，顯露大鼠心臟，注射器垂直刺入左心室取血，處死大鼠。所取血液經(jīng)4 ℃行3 000 r/min離心10 min；取上清液保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2.3 肺組織病理觀察及評(píng)分

1.2.3.1 HE染色觀察肺組織病理 處死大鼠后即取左側(cè)肺組織0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，浸泡于4%低聚甲醛溶液中固定24～48 h。標(biāo)本經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯浸泡透明、浸蠟、包埋、切片、烘烤脫蠟、梯度乙醇脫苯、蘇木素核染、清洗和組織分化、伊紅工作液質(zhì)染、梯度乙醇脫水、二甲苯浸泡透明、中性樹膠封片后，光鏡下觀察肺組織病理變化。

1.2.3.2 肺組織病理評(píng)分 按Smith法[6-7]從肺水腫、肺泡及間質(zhì)炎癥、肺泡及間質(zhì)出血、肺不張和透明膜形成等方面對(duì)肺組織損傷進(jìn)行病理評(píng)分，標(biāo)準(zhǔn)如下：0分，無損傷；1分，病變范圍<25%；2分，25%<病變范圍≤50%；3分，50%<病變范圍≤75%；4分，病變范圍>75%。高倍鏡下觀察10個(gè)視野，取其平均值。

1.2.4 ELISA法測(cè)定血清IL-8和TNF-α濃度 96孔板設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。標(biāo)準(zhǔn)孔和待測(cè)樣品孔加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100 μL，空白孔不加樣；37 ℃(或室溫)反應(yīng)2 h；棄液、洗孔，每孔加生物素化的抗IL-8(或TNF-α)抗體100 μL，37 ℃(或室溫)反應(yīng)1 h；棄液、洗孔，每孔加HRP標(biāo)記的親和素100 μL，37 ℃(或室溫)反應(yīng)1 h(或20 min)；棄液、洗孔，每孔加入TMB溶液90 μL(或100 μL)，37 ℃(或室溫)避光顯色30 min(或20 min)左右，至肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品孔呈現(xiàn)明顯的梯度藍(lán)色；每孔依次加入終止液50 μL，見藍(lán)色轉(zhuǎn)為黃色；用酶標(biāo)儀在450 nm波長依序測(cè)量各孔的光密度(D值)；計(jì)算樣品濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 葉酸減輕大鼠肺缺血再灌注后肺組織損傷

HE染色光鏡下可見，假手術(shù)組肺組織內(nèi)結(jié)構(gòu)大致完整，肺泡間隔大致正常；肺泡內(nèi)未見明顯滲出液，肺間質(zhì)未見明顯水腫和炎癥。缺血再灌注組彌漫性肺泡和肺間質(zhì)出血、水腫，部分肺泡破裂融合，肺泡間隔增厚。3個(gè)葉酸組大鼠肺組織損傷均較缺血再灌注組減輕。Smith評(píng)分結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，缺血再灌注組大鼠肺組織損傷明顯較重(P<0.01)；與缺血再灌注組比較，3個(gè)葉酸組大鼠肺組織病理損傷明顯較輕(P均<0.01)；與5 mg/d葉酸組比較，10 mg/d與20 mg/d葉酸組大鼠肺組織病理損傷明顯較輕(P均<0.01)，而后兩組間比較未見顯著性差異(P>0.05)。見圖1和圖2。

圖1 各組大鼠肺組織病理變化比較(×200)

a:P<0.01，與假手術(shù)組比較；b:P<0.01，與缺血再灌注組比較；c:P<0.01，與5 mg/d葉酸組比較圖2 各組大鼠肺組織損傷的Smith評(píng)分比較

2.2 葉酸降低大鼠肺缺血再灌注后血清IL-8和TNF-α表達(dá)

由圖3可見，與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組、葉酸組IL-8表達(dá)水平均明顯增高 (P均<0.01)；與缺血再灌注組比較，3個(gè)葉酸組IL-8表達(dá)水平明顯降低，且呈劑量依賴性(P<0.05)。

由圖4可見，與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組、葉酸組TNF-α表達(dá)水平均明顯增高 (P均<0.01)；與缺血再灌注組比較，3個(gè)葉酸組TNF-α表達(dá)水平明顯降低(P均<0.01)；與5 mg/d葉酸組比較，10 mg/d與20 mg/d葉酸組TNF-α表達(dá)水平明顯降低(P均<0.05)，而后兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

a:P<0.01，與假手術(shù)組比較；b:P<0.01，與缺血再灌注組比較；c:P<0.05，與5 mg/d葉酸組比較；d:P<0.05，與10 mg/d葉酸組比較圖3 各組大鼠血清IL-8水平比較

3 討論

LIRI臨床特征表現(xiàn)為微血管通透性增加、肺血管阻力增加、肺水腫、氧合受損以及肺動(dòng)脈高壓[8]。其他組織學(xué)標(biāo)志包括肺泡毛細(xì)血管間質(zhì)水腫、沿肺泡管的透明膜化和中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、多形核細(xì)胞浸潤[9-11]。

a:P<0.05，與假手術(shù)組比較；b:P<0.01，與缺血再灌注組比較；c:P<0.05，與5 mg/d葉酸組比較圖4 各組大鼠血清TNF-α水平比較

本研究成功構(gòu)建LIRI大鼠模型，缺血再灌注后肺損傷病理表現(xiàn)為肺泡和肺間質(zhì)出血、水腫，肺泡間隔增厚等。而葉酸組的病理損傷較缺血再灌注組輕，提示葉酸在LIRI過程中有保護(hù)作用。

血漿或支氣管肺泡灌洗標(biāo)本中存在多種潛在的生物標(biāo)志物。在促炎細(xì)胞因子中，TNF-α，IL-1b，IL-6，IL-8和IL-18是預(yù)測(cè)發(fā)病率和死亡率的比較有價(jià)值的分子生物標(biāo)志物[12]。Fisher等[13]研究顯示，供體支氣管肺泡灌洗液中IL-8水平升高與早期嚴(yán)重移植物功能障礙和移植受體早期死亡率相關(guān)。再灌注后2 h IL-8水平與PaO2/FiO2、氣道壓力和ICU停留時(shí)間相關(guān)[14]。TNF-α是LIRI完全性進(jìn)展中最重要的炎癥因子之一，其過量生成是誘導(dǎo)炎癥基因表達(dá)、細(xì)胞死亡以及免疫細(xì)胞聚集和激活的關(guān)鍵[15]。另有研究表明，TNF-α在調(diào)控上皮通透性和調(diào)節(jié)肺微血管內(nèi)皮中發(fā)揮作用[16]，TNF-α抗體的應(yīng)用使肺血管損傷降低49%[17]。在肺微血管通透性增加的初始和后期階段都與IL-8和TNF-α密切相關(guān)[18]。上述研究表明，LIRI越重，IL-8和TNF-α表達(dá)水平越高。本研究中，葉酸組血清IL-8、TNF-α表達(dá)水平均明顯低于缺血再灌注組，說明葉酸組大鼠肺損傷程度較缺血再灌注組輕，提示葉酸預(yù)喂養(yǎng)抑制組織IL-8和TNF-α產(chǎn)生和(或)釋放，從而在LIRI過程中起到保護(hù)作用。

研究表明[4]，受試者接受200～1 000 mg葉酸，均證實(shí)在心肌缺血再灌注損傷中具有保護(hù)作用，顯示葉酸寬廣的治療和安全范圍。本研究中3個(gè)治療劑量葉酸均對(duì)大鼠LIRI有保護(hù)作用，并隨劑量增加，保護(hù)作用增強(qiáng)。但是，10 mg/d與20 mg/d葉酸組大鼠肺損傷病理評(píng)分及血清TNF-α水平未見顯著性差異，而IL-8水平呈劑量依賴性降低，故10 mg/d與20 mg/d葉酸對(duì)大鼠LIRI的保護(hù)作用是否有差異、葉酸對(duì)大鼠LIRI的保護(hù)作用的有效治療劑量范圍尚需更多實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)探討和支持。多項(xiàng)研究證實(shí)，葉酸在全身各組織器官的缺血再灌注損傷過程中有保護(hù)作用：通過影響同型半胱氨酸水平[19]、自噬過度激活[20]等發(fā)揮在腦缺血再灌注中的保護(hù)作用；通過維持心肌高能磷酸鹽的水平從而維持缺血期間的心功能并且減輕再灌注損傷[4]；通過改善回腸毛細(xì)血管內(nèi)血液的流動(dòng)性減輕腸缺血再灌注損傷[21]；通過清除氧自由基、維持有效的抗氧化活性而用于男性不育癥的治療[22-23]等。本研究顯示葉酸在大鼠LIRI中有保護(hù)作用，但并未涉及相關(guān)機(jī)制的探討。研究顯示[4]，缺血心肌的ATP和ADP下降超過66%，而兩者的水平在葉酸預(yù)處理心肌中均能較好地維持。ATP作為機(jī)體活細(xì)胞中共有的直接能量來源，其水解為ADP遵循固定的公式，即在心肌和肺中的代謝是統(tǒng)一的過程，故推測(cè)葉酸在大鼠LIRI中的保護(hù)作用亦可能與細(xì)胞高能磷酸鹽的代謝有關(guān)，此可作為后續(xù)相關(guān)保護(hù)機(jī)制探索的一個(gè)參考方向。