ACSS2通過PI3K/AKT信號通路調(diào)控食管鱗癌細(xì)胞的順鉑敏感性

高星宇，王景芝，凌銳，周月鵬，毛朝明，陳德玉

(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院 1.腫瘤治療中心；2.腫瘤學(xué)實(shí)驗(yàn)室；3.核醫(yī)學(xué)科，江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

乙酸鹽或乙酸對維持哺乳動物體內(nèi)能量平衡起著重要作用[1]。最新研究表明，在應(yīng)激條件下如低糖、營養(yǎng)受限等，游離乙酸鹽可以作為腫瘤細(xì)胞脂肪生成、能量代謝的重要碳源，其中乙酰輔酶A合成酶2(acetyl-CoA synthetase 2，ACSS2)發(fā)揮著關(guān)鍵樞紐作用[2]。目前已在膀胱癌[3]、腎癌[4]、乳腺癌[5]、肝癌[6]等腫瘤發(fā)現(xiàn)，ACSS2參與腫瘤浸潤、侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性進(jìn)程，其異常表達(dá)常提示著不良預(yù)后。本研究以食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)組織樣本及細(xì)胞株作為研究對象，結(jié)合順鉑處理并通過靶向調(diào)控ACSS2蛋白表達(dá)，探究ACSS2在順鉑敏感性調(diào)控過程中的關(guān)鍵作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 組織標(biāo)本、細(xì)胞株 選取2017年4月至2019年2月間于江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院外科住院的40例食管鱗癌患者，于手術(shù)中收集每位患者的食管鱗癌瘤體及癌旁組織(距瘤體邊緣2～3 cm左右)標(biāo)本，均為初診同時術(shù)前未接受任何腫瘤治療，所有樣本經(jīng)病理科確診并得到江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

食管鱗癌細(xì)胞株TE-1、ECA-109 及KYSE-150(上海吉凱基因技術(shù)公司)，正常食管鱗狀上皮細(xì)胞Het-1A(廣州吉尼歐生物科技有限公司)。

1.1.2 主要試劑 ACSS2抗體(美國Santa Cruz 公司)；p-PI3K、AKT/p-AKT、p-mTOR、p-Erk、cleaved-Caspase-3以及β-肌動蛋白單克隆抗體(美國Cell Signaling公司)；順鉑(Cisplatin，DPP)購自美國Selleck公司；PI3K通路抑制劑LY290042(美國Med Chem Express公司)；HRP標(biāo)記的抗鼠或抗兔二抗(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司)；CCK8以及Annexin-V/PI凋亡試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司)；siRNA-ACSS2和siRNA陰性對照，陰性對照病毒CON238及過表達(dá)ACSS2慢病毒LV-ACSS2(上海吉凱基因技術(shù)公司)。

1.2 免疫組化檢測食管鱗癌及癌旁組織中ACSS2的表達(dá)

組織樣本經(jīng)4%多聚甲醛固定后以石蠟進(jìn)行包埋，連續(xù)切片(厚度4 μm)，切片經(jīng)脫蠟水化以3%過氧化氫孵育，PBS沖洗并抗原修復(fù)后置于含ACSS2抗體稀釋液(1 ∶200)中，于4 ℃冰箱中浸染過夜，次日沖洗3次后加入對應(yīng)二抗工作液結(jié)合，再次清洗后DAB顯色封片觀察。腫瘤組織及癌旁組織樣本均以200倍鏡下隨機(jī)選取5個視野進(jìn)行免疫組化評分，其中ACSS2表達(dá)強(qiáng)度分為：陰性為0分，弱陽性為1分，陽性為2分，強(qiáng)陽性為3分；表達(dá)程度評分標(biāo)準(zhǔn)如下：<25%者為0分，<50%但≥25%者為1分，≥50%同時<75%者為2分，≥75%者為3分。上述兩項(xiàng)得分相乘計(jì)為總得分：0分記為“-”，1～5分記為“+”，6～9分記為“++”。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)以及脂質(zhì)體、慢病毒轉(zhuǎn)染

食管鱗癌細(xì)胞株TE-1、ECA-109 及KYSE-150培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素和1%鏈霉素混合的RPMI-1640培養(yǎng)基，正常食管鱗狀上皮細(xì)胞Het-1A培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素和1%鏈霉素混合的DMEM培養(yǎng)基，均在37℃ 、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞，以(3～4)×104個/mL密度接種于6孔板中，并將其隨機(jī)分為3組：siRNA-ACSS2組(siRNA-ACSS2轉(zhuǎn)染)，siRNA-NC組(siRNA陰性對照)及對照組(未做任何處理)。依照Lipofectamine 2000試劑說明轉(zhuǎn)染上述不同組細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基內(nèi)轉(zhuǎn)染6 h后更換為含血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，再行收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。序列如下，siRNA-ACSS2-1：正義鏈5′-CAUCUGUCAUCAGUCACCUTT-3′；反義鏈5′-AGGUGACUGA-UGACAGAUGTT-3′；siRNA-ACSS2-2：正義鏈5′-CAGGAUGGCUAUUACUGGATT-3′；反義鏈5′-UCCAGUAAUAGCCAUCCUGTT-3′；siRNA-ACSS2-3：正義鏈5′-CGGGAUCGUUUGCAAGUAATT-3′；反義鏈5′-UUACUUGCAAACGAUCCCGTT-3′；siRNA-NC：正義鏈5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′；反義鏈5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。陰性對照病毒CON238及LV-ACSS2感染72 h后利用含嘌呤霉素培養(yǎng)基(4 μg/mL)篩選出轉(zhuǎn)染細(xì)胞并運(yùn)用免疫印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證過表達(dá)效果。

1.4 蛋白質(zhì)印跡檢測食管鱗癌組織及細(xì)胞中ACSS2蛋白的表達(dá)

食管鱗癌及癌旁組織蛋白提取需先去除壞死等組織，以每50 mg組織取500 μL的比例加入含蛋白酶抑制劑的RIPA細(xì)胞裂解液，玻璃研磨棒冰上研磨10 min；細(xì)胞蛋白(食管鱗癌細(xì)胞株TE-1、ECA-109 及KYSE-150，正常食管鱗狀上皮細(xì)胞Het-1A)以6孔板為例：細(xì)胞經(jīng)PBS清洗3次后加入100 μL裂解液冰上處理10 min，收集后4℃條件下12 000×g離心10 min，經(jīng)BCA法測定蛋白含量后加入上樣緩沖液，100 ℃下熱變性10 min。根據(jù)目的蛋白分子大小于10%～12%的SDS-PAGE凝膠電泳后，將蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5%牛血清白蛋白的TBST于37 ℃水浴搖床上封閉60 min，加入稀釋好的一抗ACSS2(1 ∶2 000配置)，4 ℃冰箱孵育過夜。次日TBST 洗3次，每次10 min；抗鼠二抗室溫孵育60 min后，TBST 再次清洗3次，每次10 min，最后加入曝光液顯影、拍攝、計(jì)算灰度值。

1.5 CCK8實(shí)驗(yàn)檢測ACSS2干擾對TE-1細(xì)胞順鉑IC50值的影響

將TE-1細(xì)胞設(shè)置為4組：未處理(空白對照)組，siRNA-NC組(陰性對照組)，siRNA-ACSS2-1組和siRNA-ACSS2-3組。于96孔板中種植5×103個細(xì)胞/孔，待細(xì)胞貼壁后分別進(jìn)行siRNA處理24 h，每組處理設(shè)6個平行孔。順鉑按濃度梯度(3.125、6.25、12.5、25、50 μg/mL)加入處理 24 h，并于實(shí)驗(yàn)終止前每孔加10 μL的CCK8，振蕩、孵育2 h后在酶聯(lián)檢測儀上檢測 450 nm 波長下每孔光密度(D)值，按公式(實(shí)驗(yàn)組D值/空白孔D值)×100%求出細(xì)胞活力值，根據(jù)細(xì)胞活力值擬合函數(shù)曲線計(jì)算IC50值。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測下調(diào)ACSS2對TE-1細(xì)胞凋亡的影響

TE-1細(xì)胞種于6孔板，設(shè)置為6組：陰性對照組，順鉑(5 μg/mL)組，siRNA-ACSS2-1組，siRNA-ACSS2-3組，siRNA-ACSS2-1+順鉑組，siRNA-ACSS2-3+順鉑組。待細(xì)胞貼壁后行siRNA-ACSS2、siRNA-NC處理48 h，順鉑(5 μg/mL)單獨(dú)處理24 h或者siRNA-ACSS2處理24 h后聯(lián)合順鉑(5 μg/mL)處理24 h。隨后，細(xì)胞經(jīng)消化離心后用4℃預(yù)冷的PBS洗3次，每孔細(xì)胞收集于流式管內(nèi)用500 μL緩沖液重懸，每管避光加入5 μL的Annexin V-FITC，上機(jī)前15 min加入5 μL碘化丙啶后檢測凋亡水平。

1.7 蛋白質(zhì)印跡檢測PI3K/AKT信號通路及cleaved-Caspase-3蛋白的表達(dá)

TE-1細(xì)胞種于6孔板，設(shè)置為6組：陰性對照組，siRNA-ACSS2-3組，LV-ACSS2組，順鉑組，siRNA-ACSS2-3+順鉑組與LV-ACSS2+順鉑組。細(xì)胞蛋白提取、濃度測定等步驟同“1.4”。加入稀釋好的一抗p-mTOR、p-Erk1/2、p-PI3K、AKT/p-AKT、cleaved-Caspase-3(均按1 ∶1 000配置)，孵育、清洗后抗鼠或抗兔二抗再次孵育后，經(jīng)曝光、拍攝并根據(jù)灰度值計(jì)算各蛋白表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 ACSS2在食管鱗癌及癌旁組織中的表達(dá)

免疫組化可見，食管鱗癌細(xì)胞胞質(zhì)中ACSS2多呈陽性或強(qiáng)陽性；癌旁組織中除基底、固有腺區(qū)域內(nèi)細(xì)胞中有較高的ACSS2表達(dá)外，整體表達(dá)強(qiáng)度均較低(圖1)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，食管鱗癌組織中ACSS2表達(dá)總得分++、+的比例分別為47.5%(19/40)和50%(20/40)，癌旁組織中++、+的比例分別是22.5%(9/40)和37.5%(15/40)，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-3.79，P<0.001，表1)。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果證實(shí)，食管鱗癌瘤體中ACSS2蛋白表達(dá)水平顯著高于癌旁組織(Z=6.668，P<0.001，圖2)。

圖1 食管鱗癌及癌旁組織中ACSS2的表達(dá)(免疫組化，×200)

表1 食管鱗癌及癌旁組織中ACSS2表達(dá)總得分結(jié)果

N1-N3:癌旁組織；T1-T3:食管鱗癌組織圖2 蛋白質(zhì)印跡檢測食管鱗癌組織中ACSS2表達(dá)

2.2 食管鱗癌細(xì)胞中ACSS2蛋白表達(dá)水平

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果表明，與Het-1A細(xì)胞相比，食管鱗癌細(xì)胞TE-1、ECA-109及KYSE-150均有較強(qiáng)的ACSS2表達(dá)(圖3)。siRNA-ACSS2-3干擾效果最明顯，siRNA-ACSS2-1和-2的效果較為一致且均弱于siRNA-ACSS2-3(圖4)。

*：P<0.01；#：P<0.001，與Het-1A比較圖3 蛋白質(zhì)印跡檢測正常食管鱗狀上皮細(xì)胞與食管鱗癌細(xì)胞中ACSS2表達(dá)差異

*：P<0.01；#：P<0.001，與空白對照組及陰性對照組比較圖4 蛋白質(zhì)印跡驗(yàn)證TE-1細(xì)胞靶向干擾ACSS2效果

2.3 食管鱗癌細(xì)胞中ACSS2表達(dá)對順鉑的IC50值的影響

CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相同濃度(除12.5 μg/mL濃度外)的順鉑條件下，siRNA-ACSS2-1、3處理組的TE-1細(xì)胞活力較空白對照組、陰性對照組均顯著下降(P<0.05)；空白對照組TE-1細(xì)胞順鉑的 IC50值為23.24 μg/mL，陰性對照組為24.82 μg/mL，siRNA-ACSS2-1和-3處理后下降到15.88 μg/mL和14.57 μg/mL (F=6.496，P<0.01，圖5)。

圖5 CCK8檢測ACSS2干擾對TE-1細(xì)胞順鉑IC50值的影響

2.4 食管鱗癌細(xì)胞中ACSS2表達(dá)改變對順鉑殺傷能力的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，siRNA-ACSS2處理48 h后，陰性對照組、siRNA-ACSS2-1組和siRNA-ACSS2-3組TE-1細(xì)胞凋亡率分別為(2.05±0.04)%，(4.34±0.12)%和(3.24±0.12)%，3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=367.897，P<0.001)。5 μg/mL順鉑處理24 h后TE-1細(xì)胞凋亡率為(9.68±0.57)%，而經(jīng)siRNA-ACSS2-1、siRNA-ACSS2-3預(yù)處理24 h，再順鉑處理24 h后TE-1細(xì)胞凋亡率分別上調(diào)至(13.81±0.60)%和(15.82±0.13)%，3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=62.778，P<0.001)。結(jié)果表明，下調(diào)ACSS2表達(dá)可以增強(qiáng)TE-1細(xì)胞對順鉑的敏感性(圖6)。

*：P<0.01，#：P<0.001圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測ACSS2干擾對TE-1細(xì)胞順鉑敏感性的影響

2.5 ACSS2對PI3K/AKT信號通路和凋亡相關(guān)蛋白的影響

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，過表達(dá)ACSS2后PI3K/AKT信號通路出現(xiàn)持續(xù)活化，而PI3K通路靶向抑制劑LY290042處理(10 μmol/L)24 h可以有效逆轉(zhuǎn)這一進(jìn)程發(fā)生(圖7)。順鉑處理可以誘導(dǎo)TE-1細(xì)胞中ACSS2的表達(dá)上調(diào)以及PI3K/AKT信號通路活化；在靶向下調(diào)ACSS2后可見TE-1細(xì)胞中p-PI3K、p-AKT表達(dá)顯著降低而凋亡相關(guān)cleaved-Caspase-3 蛋白表達(dá)量明顯升高，過表達(dá)ACSS2維持PI3K/AKT信號活化，同時可逆轉(zhuǎn)cleaved-Caspase-3的表達(dá)(圖8)。

圖7 蛋白質(zhì)印跡檢測ACSS2過表達(dá)后PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白

圖8 蛋白質(zhì)印跡檢測PI3K/AKT通路及cleaved-Caspase-3的表達(dá)

3 討論

食管鱗癌早期癥狀隱匿，多數(shù)患者初次確診即為中晚期，造成臨床工作中較易見早期局部或者遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散，患者喪失了手術(shù)切除的機(jī)會，需要放療、化療等綜合手段干預(yù)[7-9]。對于不具備手術(shù)切除條件的食管鱗癌患者，目前標(biāo)準(zhǔn)治療方案為同步放化療，其中聯(lián)合化療最常用方案為5-氟尿嘧啶和順鉑[10]。有研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)后化療采用順鉑可以有效地控制發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、局部復(fù)發(fā)腫瘤進(jìn)展，但是當(dāng)前同步放化療處理后5年生存率僅在27%左右，超過40%的患者未見明顯改善或出現(xiàn)復(fù)發(fā)[11-13]。本研究探討食管鱗癌細(xì)胞順鉑敏感性的關(guān)鍵信號通路和調(diào)控機(jī)制，以期為提高化療效果和改善患者預(yù)后提供理論依據(jù)。

現(xiàn)代研究認(rèn)為，腫瘤的快速生長不可避免地會導(dǎo)致代謝壓力，而代謝重編程作為腫瘤惡性特征之一賦予了腫瘤細(xì)胞克服代謝壓力并維持生長和增殖的能力，其中最常見的代謝表型就是瓦博格(Warburg)效應(yīng)，即腫瘤細(xì)胞在氧氣充足的情況下仍以糖酵解為主。研究證實(shí)，腫瘤細(xì)胞在不斷攝取葡萄糖的同時對其他代謝物質(zhì)如乙酸鹽的依賴也會增加，而ACSS2可以利用乙酸鹽大量合成乙酰輔酶A提供能量和物質(zhì)基礎(chǔ)，因此ACSS2的異常表達(dá)勢必影響著腫瘤發(fā)生、發(fā)展[2]。例如，在腎癌組織中不僅可觀察到ACSS2的累積，而且高表達(dá)ACSS2的患者表現(xiàn)為較高的腫瘤分期、易轉(zhuǎn)移性以及更低的生存率[4]；當(dāng)乳腺癌細(xì)胞處于缺氧、脂質(zhì)缺乏條件下，ACSS2的表達(dá)上調(diào)是維持腫瘤細(xì)胞增殖的關(guān)鍵分子基礎(chǔ)[5]。然而需要注意的是，在不同類型腫瘤中ACSS2表達(dá)水平與惡性進(jìn)程間的關(guān)系尚存較大爭議：肝癌細(xì)胞株及瘤體內(nèi)ACSS2的表達(dá)強(qiáng)度均較低；下調(diào)ACSS2表達(dá)可以阻斷HIF-2α乙?；瘡亩龠M(jìn)轉(zhuǎn)移發(fā)生[6]。因此本研究首先通過免疫組化檢測了食管鱗癌組織及癌旁組織中的ACSS2表達(dá)，發(fā)現(xiàn)多數(shù)腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)中可見ACSS2強(qiáng)表達(dá)；而在癌旁組織中處于固有腺和基底膜附近增殖較旺盛區(qū)域的正常細(xì)胞亦可見陽性甚至強(qiáng)陽性ACSS2；統(tǒng)計(jì)免疫組化結(jié)果以及進(jìn)一步通過組織勻漿蛋白質(zhì)印跡檢測顯示，食管鱗癌組織中ACSS2蛋白總體表達(dá)水平要明顯高于癌旁組織。已有文獻(xiàn)報(bào)道，對膀胱癌細(xì)胞進(jìn)行ACSS2的靶向抑制劑處理可以顯著提高順鉑的殺傷作用[3]。本研究結(jié)果表明，靶向下調(diào)ACSS2能明顯降低食管鱗癌細(xì)胞的順鉑IC50值；流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，siRNA-ACSS2單獨(dú)處理即可引發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡，并可以顯著增強(qiáng)順鉑對食管鱗癌的殺傷作用。上述結(jié)果表明，食管鱗癌細(xì)胞中高表達(dá)的ACSS2可能參與順鉑敏感性的調(diào)控。

眾多研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT信號通路在多種類型惡性腫瘤的增殖、抗凋亡、轉(zhuǎn)移發(fā)生等一系列進(jìn)程中發(fā)揮著重要調(diào)控作用[14-15]。在腎癌細(xì)胞相關(guān)研究中證實(shí)，ACSS2可通過PI3K/AKT信號通路調(diào)控浸潤、侵襲發(fā)生[4]；而最新的研究表明，食管鱗癌中PI3K/AKT信號通路的過度激活會通過作用于凋亡相關(guān)蛋白如Caspase家族蛋白等表達(dá)參與順鉑敏感性調(diào)控[16-18]。本研究中，上調(diào)或下調(diào)食管鱗癌細(xì)胞中ACSS2的表達(dá)可直接促進(jìn)或者抑制p-PI3K、p-AKT的活化水平；結(jié)合PI3K/AKT信號通路靶向抑制劑證實(shí)，ACSS2通過影響PI3K/AKT下游靶蛋白cleaved-Caspase-3 形成調(diào)控食管鱗癌細(xì)胞對順鉑的敏感性。

綜上所述，食管鱗癌細(xì)胞中異常高表達(dá)的ACSS2可能通過PI3K/AKT信號通路活化以及凋亡蛋白cleaved-Caspase-3形成參與順鉑敏感性調(diào)控，表明ACSS2或可作為提高食管鱗癌化療療效和改善患者預(yù)后的潛在干預(yù)靶點(diǎn)。