自噬對粒細(xì)胞樣髓源性抑制細(xì)胞生存與功能的影響

郭紅葉，朱棟煒，芮棵，田潔，王勝軍

(1.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

在機(jī)體免疫系統(tǒng)內(nèi)，髓系細(xì)胞是造血細(xì)胞中最豐富的類型，在多種生理和病理情況下發(fā)揮作用[1]。正常的情況下，造血干細(xì)胞分化為髓系前體細(xì)胞然后進(jìn)一步分化為未成熟髓系細(xì)胞(不具備免疫抑制功能)，這群細(xì)胞會(huì)遷移到不同外周器官后進(jìn)行分化。然而，在急慢性感染、創(chuàng)傷、敗血癥以及在腫瘤微環(huán)境下，這群未成熟髓系細(xì)胞在局部大量聚集，正常途徑的成熟分化過程發(fā)生阻滯，并發(fā)生活化，成為了一群具有免疫抑制功能的髓源性抑制細(xì)胞(myeloid derived suppressor cells，MDSCs)，其在許多病理?xiàng)l件下發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能[2]。MDSCs由兩大類細(xì)胞組成：粒細(xì)胞樣MDSCs(granulocytic MDSCs，G-MDSCs)和單核細(xì)胞樣MDSCs(monocytic MDSCs，M-MDSCs)。在形態(tài)上，G-MDSCs與中性粒細(xì)胞相似，而M-MDSCs則像單核細(xì)胞[1]；在表型上，小鼠體內(nèi)總MDSCs的表型為CD11b+Gr-1+,G-MDSCs表型為CD11b+Ly-6G+Ly-6Clow，M-MDSCs表型為CD11b+Ly-6GlowLy-6Chigh[3]。

在病理情況下，髓樣細(xì)胞前體中的可溶性腫瘤壞死因子通過結(jié)合腫瘤壞死因子受體1激活STAT3信號通路，導(dǎo)致正常髓系前體增殖并分化為MDSCs[4]。MDSCs是腫瘤微環(huán)境中重要的組成部分，可以通過介導(dǎo)免疫抑制來促進(jìn)腫瘤的發(fā)展[5]。MDSCs可以促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的形成[5]，然而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是適應(yīng)性免疫應(yīng)答的重要參與者，能夠促進(jìn)免疫耐受；MDSCs通常分化為免疫抑制性腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞[6]，并且可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞分化為癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞[7]。MDSCs不僅參與調(diào)控腫瘤免疫應(yīng)答，還可以通過促進(jìn)腫瘤血管生成、腫瘤細(xì)胞侵襲以及轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的形成來促進(jìn)腫瘤發(fā)展[8]。

腫瘤晚期患者體內(nèi)大量存在的MDSCs，往往意味著較差的生存率[9]。自噬途徑是在缺氧條件下誘導(dǎo)的，然而缺氧是大多數(shù)腫瘤的主要特征，在腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移和對治療的反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[10]。自噬是細(xì)胞內(nèi)一種保守的自降解系統(tǒng)，屬于溶酶體分解代謝途徑[11]，參與胞質(zhì)中長壽命蛋白、蛋白聚集物以及受損傷細(xì)胞器降解后再循環(huán)利用，在維持組織、器官穩(wěn)定性及抗腫瘤免疫中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[12]。

雖然大多數(shù)研究集中于自噬在腫瘤細(xì)胞中的作用[13]，但是在腫瘤微環(huán)境中自噬如何影響免疫應(yīng)答特別是MDSCs的作用仍需要進(jìn)一步的探討。有研究間接表明自噬在調(diào)節(jié)MDSCs功能方面發(fā)揮重要作用，能夠調(diào)節(jié)缺氧誘導(dǎo)因子1α促進(jìn)MDSCs向腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞分化[14-16]。本研究擬通過檢測自噬對小鼠G-MDSCs存活以及功能的影響，初步探討自噬是否為影響G-MDSCs在腫瘤中大量聚集的原因之一，為臨床上針對免疫抑制細(xì)胞的免疫療法提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

雄性，6～8周齡，體重(20±2)g，SPF級C57BL/6小鼠20只購自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)動(dòng)物中心。Lewis肺癌細(xì)胞系為本課題組保存；髓源性抑制細(xì)胞分離試劑盒(德國Miltenyi Biotec公司)；PE標(biāo)記抗小鼠Ly-6G抗體、FITC標(biāo)記抗小鼠Ly-6C抗體、PE/Cy5標(biāo)記抗小鼠CD11b抗體(美國Biolegend公司)；LC3B抗體(美國CST公司)；雷帕霉素、氯喹、3-甲基腺嘌呤(美國Sigma公司)；FlowCellectTM自噬LC3抗體檢測試劑盒(德國MERK公司)；QuantiChromTM精氨酸酶測定試劑盒(美國BioAssay Systems公司)。

1.2 模型構(gòu)建、細(xì)胞分離

小鼠Lewis肺癌細(xì)胞系用含10%小牛血清DMEM培養(yǎng)，皮下注射至C57BL/6小鼠。移植后第30 d摘取脾臟，獲得的細(xì)胞懸液4℃、500×g離心5 min，棄上清液；加5 mL ACK紅細(xì)胞裂解液，靜置5 min；加RPMI 1640培養(yǎng)液，混勻，500×g離心5 min，棄上清液；計(jì)數(shù)。加PBE緩沖液(PBS中加入EDTA和小牛血清)后加入FcR封閉液，冰上孵育10 min；加入抗-Ly-6G生物素孵育30 min；加PBE，離心5 min，棄上清液；加抗-Ly-6G-生物素磁珠，30 min；加入PBE，4 ℃、500×g離心5 min，棄上清液；加入500 μL PBE，將分選柱置于分選器上，加入細(xì)胞懸液用PBE洗滌3次；將分選柱懸于離心管中，加入PBE，推動(dòng)柱栓得到細(xì)胞懸液，即G-MDSCs。

1.3 G-MDSCs純度鑒定

收集1×106個(gè)G-MDSCs于EP管中，加1 mL PBS將細(xì)胞重懸，離心5 min，棄部分上清液后余約100 μL；重懸后加抗Ly-6G、抗Ly-6C、抗CD11b，4 ℃孵育30 min；加1 mL PBS，4 ℃、500×g離心5 min，棄上清液。加200 μL PBS重懸，上機(jī)檢測。

1.4 G-MDSCs形態(tài)鑒定

將1×106個(gè)G-MDSCs細(xì)胞懸液加入到1.5 mL EP管中，加入PBS，混勻，4℃、500×g離心5 min，棄掉部分上清液后余大約100 μL，混勻細(xì)胞；取10 μL涂片，待涂片自然干燥，滴加試劑A(瑞氏-吉姆薩復(fù)合染液)，室溫放置，染色1～2 min；加入等量的試劑B(PBS)，混勻，室溫靜置3～10 min。流水沖洗，至液體無色，大約30 s。干燥后，先低倍鏡觀察，然后油鏡下觀察并拍照保存。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測雷帕霉素對G-MDSCs自噬的影響

1.5.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將含有G-MDSCs的細(xì)胞懸液加入24孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)為2×106個(gè)，在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，體系為1 mL，加入1 μL氯喹(原液10 mmol/L，終濃度10 μmol/L)作為對照組。在上述體系中加入20 μL雷帕霉素(原液500 nmol/L，終濃度10 nmol/L)作為雷帕霉素處理組。培養(yǎng)12 h，4℃、500×g離心5 min，棄上清液。

1.5.2 蛋白提取 加入1 mL PBS，離心5 min，棄上清液。細(xì)胞沉淀中加50 μL RIPA，每10 min振蕩1次，每次2 min，共3次；4 ℃、14 000×g離心5 min，收集上清液，測定蛋白濃度。加入5×上樣緩沖液于樣品中，沸水浴10 min后置冰上。14 000×g離心10 min，收集上清液備用。

1.5.3 蛋白電泳及顯色 配制濃縮膠(5%)和分離膠(12%)，每個(gè)上樣孔加80 μg蛋白樣品。80 V電泳，待溴酚藍(lán)染料進(jìn)入分離膠時(shí)，電壓調(diào)為100 V繼續(xù)電泳至結(jié)束，取出膠，浸泡在轉(zhuǎn)膜緩沖液中。確定目的蛋白的大致位置，組裝電轉(zhuǎn)移裝置，350 mA、2 h后關(guān)閉電源，取出PVDF膜。室溫下封閉1 h，加入稀釋抗β-肌動(dòng)蛋白抗體(1 ∶3 000)、抗LC3B抗體(1 ∶1 000)，將PVDF膜浸在一抗中4 ℃孵育過夜，將PVDF膜用1×TBST洗滌3次。加入羊抗鼠HRP-IgG抗體(1 ∶5 000)、羊抗兔HRP-IgG抗體(1 ∶8 000)，室溫孵育1 h。取出PVDF膜，1×TBST洗滌3次。顯色，凝膠成像系統(tǒng)及分析儀掃描保存圖像。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測雷帕霉素對G-MDSCs自噬的影響

1.6.1 細(xì)胞培養(yǎng) G-MDSCs處理方法同“1.5.1”。

1.6.2 熒光抗體標(biāo)記及檢測 加入1 mL PBS重懸細(xì)胞，4℃、500×g離心5 min，棄上清液。加100 μL 1×自噬試劑A，4 ℃、500×g離心5 min，棄上清液。加100 μL 1×自噬試劑B，4 ℃、500×g離心5 min，棄上清液。加95 μL分析緩沖液和5 μL 20×抗LC3/FITC抗體，避光孵育30 min。加500 μL分析緩沖液，4℃、500×g離心5 min，棄上清液。加200 μL分析緩沖液重懸，上機(jī)檢測。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測自噬對G-MDSCs存活的影響

1.7.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將G-MDSCs加入24孔板中，每孔2×106個(gè)細(xì)胞，在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，體系為1 mL，加入10 μL雷帕霉素(原液1 μmol/L，終濃度10 nmol/L)，此為雷帕霉素組；另一組加入雷帕霉素，同時(shí)加入3-甲基腺嘌呤(3-MA，原液200 mmol/L，終濃度5 mmol/L)，此為雷帕霉素+3-MA組。培養(yǎng)12 h，混勻，將細(xì)胞加入到1.5 mL EP管中，4 ℃、500×g離心5 min，棄上清液。

1.7.2 標(biāo)記及檢測 加入1 mL PBS后混勻細(xì)胞，4℃、500×g離心5 min，棄上清液。加入500 μL結(jié)合緩沖液和2 μL 7-AAD，室溫避光孵育10 min，上機(jī)檢測。

1.8 ELISA檢測自噬對G-MDSCs效應(yīng)分子精氨酸酶的影響

1.8.1 細(xì)胞培養(yǎng) G-MDSC處理方法同“1.7.1”。

1.8.2 檢測與計(jì)算 加入哺乳動(dòng)物蛋白抽提試劑，4 ℃、14 000×g離心10 min，取上清液。按照說明書加樣后37 ℃孵育1.5 h。每孔加200 μL尿素制劑，加入10 μL 5×底物緩沖液到樣本空白孔中，室溫避光下放置15 min，選擇波長520 nm測各個(gè)樣本光密度(D)值；根據(jù)說明書計(jì)算精氨酸酶活性。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 G-MDSCs純度的鑒定

分離純化G-MDSCs細(xì)胞，小鼠體內(nèi)G-MDSCs表型為CD11b+Ly-6G+Ly-6Clow，對細(xì)胞進(jìn)行熒光抗體染色標(biāo)記后通過流式細(xì)胞術(shù)檢測磁珠分選獲得的G-MDSCs純度，結(jié)果顯示G-MDSCs純度達(dá)95%以上(圖1)。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)分析G-MDSCs的細(xì)胞純度

2.2 G-MDSCs形態(tài)的鑒定

獲得G-MDSCs之后，采用瑞士-吉姆薩染色對其形態(tài)進(jìn)行鑒定(圖2)。結(jié)果顯示涂片染色良好，細(xì)胞完整，細(xì)胞核呈環(huán)狀或分葉狀，與文獻(xiàn)中所描述的G-MDSCs形態(tài)一致[3]。

圖2 油鏡下G-MDSCs的細(xì)胞形態(tài)(瑞吉染色，×1 000)

2.3 雷帕霉素促進(jìn)G-MDSCs自噬

對獲得的G-MDSCs純度和形態(tài)鑒定后，在體外，首先觀察雷帕霉素這種常用的自噬誘導(dǎo)劑是否能誘導(dǎo)G-MDSCs發(fā)生自噬。結(jié)果顯示，與對照組相比，雷帕霉素處理組LC3-Ⅱ的水平顯著升高而LC3-Ⅰ水平降低，表明大量LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)變?yōu)長C3-Ⅱ，提示雷帕霉素上調(diào)了G-MDSCs自噬的水平(圖3)。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證雷帕霉素對G-MDSCs細(xì)胞自噬的作用，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ。結(jié)果顯示，雷帕霉素處理后，增強(qiáng)了細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ的熒光強(qiáng)度，表明雷帕霉素上調(diào)了G-MDSCs自噬的水平(圖3)。

圖3 雷帕霉素對G-MDSCs自噬的影響

2.4 自噬有利于G-MDSCs存活

加入自噬抑制劑3-MA后，觀察自噬對G-MDSCs體外存活的影響。結(jié)果顯示，處理細(xì)胞12 h后，雷帕霉素+3-MA組與雷帕霉素組相比，活細(xì)胞比例明顯降低(t=3.075，P<0.05)，表明自噬對G-MDSCs體外存活發(fā)揮了一定的促進(jìn)作用。見圖4。

2.5 自噬上調(diào)G-MDSCs 中精氨酸酶的活性

結(jié)果顯示，處理細(xì)胞12 h后，雷帕霉素+3-MA組精氨酸酶活性(6.967±0.848)U/106個(gè)細(xì)胞與雷帕霉素組(11.250±0.635)U/106個(gè)細(xì)胞相比顯著降低(t=4.046，P<0.05)，提示抑制細(xì)胞內(nèi)自噬水平后，細(xì)胞免疫抑制功能有所下降，這很可能將利于機(jī)體更好地與腫瘤細(xì)胞進(jìn)行對抗。

3 討論

自噬發(fā)生的標(biāo)志分子LC3存在兩種形式，即LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ。細(xì)胞中的LC3蛋白合成后在Atg4蛋白酶的作用下形成LC3-Ⅰ。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)發(fā)生自噬時(shí)，自噬小體分隔膜開始形成，可溶性的LC3-Ⅰ分子與磷脂酰乙醇胺結(jié)合形成LC3-Ⅱ，并且始終定位于自噬小體的外膜和內(nèi)膜上直至與溶酶體融合。在本研究中，在對細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)加入氯喹以抑制自噬小體與溶酶體融合，使得自噬小體無法降解，從而保留了LC3-Ⅱ，作為自噬小體的標(biāo)記，利于結(jié)果觀察并判斷細(xì)胞內(nèi)生成自噬小體的水平，來反映發(fā)生自噬的水平；在采用流式細(xì)胞術(shù)展開實(shí)驗(yàn)時(shí)，由于在培養(yǎng)時(shí)也加入了氯喹，自噬小體以及內(nèi)容物無法降解，并且通過自噬試劑B作用后，使得染色過的細(xì)胞內(nèi)只保留了存在于自噬小體膜上的LC3-Ⅱ，這樣就可以通過LC3-Ⅱ-FITC的熒光強(qiáng)度的變化來分析判斷細(xì)胞內(nèi)自噬發(fā)生的水平。

很多研究已經(jīng)證實(shí)腫瘤發(fā)生時(shí)，機(jī)體內(nèi)會(huì)有大量的MDSCs聚集，然而對于其數(shù)量增多的原因，絕大多數(shù)研究的關(guān)注點(diǎn)在MDSCs的增殖和分化方面。為了探究細(xì)胞自噬是否參與了腫瘤患者體內(nèi)MDSCs大量聚集，首先需要解決的問題就是如何檢測G-MDSCs這群特殊的免疫抑制性細(xì)胞其細(xì)胞內(nèi)自噬水平。有研究表明，荷瘤小鼠來源的M-MDSCs胞內(nèi)mTOR通路下調(diào)[17]。所以本研究選擇了通過下調(diào)mTOR通路來上調(diào)細(xì)胞自噬的雷帕霉素，這種常用來在其他細(xì)胞中誘導(dǎo)自噬的誘導(dǎo)劑開展研究。結(jié)果顯示，檢測細(xì)胞自噬的兩種經(jīng)典方法(蛋白質(zhì)印跡法和流式細(xì)胞術(shù))都可以用來反映這一特殊細(xì)胞群體的自噬水平，并且在培養(yǎng)體系中加入自噬抑制劑后，活細(xì)胞比例降低，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)分子精氨酸酶水平下調(diào)。精氨酸酶是MDSCs用來抑制T細(xì)胞活化和功能的經(jīng)典分子之一，能夠大量消耗精氨酸，然而精氨酸是T細(xì)胞活化和發(fā)揮免疫功能所必需的氨基酸，G-MDSCs細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)的精氨酸酶將環(huán)境中的精氨酸耗竭后，導(dǎo)致T細(xì)胞無法活化，從而抗腫瘤活性下降[18]。本研究結(jié)果表明，自噬不僅有利于G-MDSCs細(xì)胞體外存活，還可能通過上調(diào)效應(yīng)分子精氨酸酶來抑制T細(xì)胞功能，從而提示自噬參與了MDSCs促進(jìn)腫瘤發(fā)展的這一過程。由此表明，可以通過調(diào)控細(xì)胞自噬減少腫瘤患者體內(nèi)這群發(fā)揮抑制腫瘤免疫的細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)機(jī)體抗腫瘤免疫，提高免疫治療的效果。盡管很多研究均表明可能自噬與MDSCs功能的相關(guān)，但是該途徑的直接作用以及與自噬在MDSCs介導(dǎo)的抗腫瘤抑制中發(fā)揮作用的具體分子機(jī)制并不十分明確，需要進(jìn)一步研究。

MDSCs于2007年首次被描述為新的治療藥物[3]，直到2016年，人們才意識到MDSCs在免疫療法中的重要作用[3]，學(xué)者開始研究消除MDSCs的方法。這種消除MDSCs的免疫治療手段已經(jīng)在患者身上發(fā)揮一定療效[19]。

多種病理?xiàng)l件下，MDSCs在負(fù)向調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞不同，MDSCs在機(jī)體的生理?xiàng)l件下并不存在，這有可能靶向這群細(xì)胞進(jìn)行治療的同時(shí)避免一些不良反應(yīng)。對調(diào)控MDSCs聚集以及功能的機(jī)制進(jìn)行深入研究，可以促進(jìn)更加精確地進(jìn)行靶向治療。自噬很可能是一個(gè)很好的減少M(fèi)DSCs聚集的切入點(diǎn)，隨著對這個(gè)領(lǐng)域研究的不斷深入，作為一種潛在的新的細(xì)胞治療手段，MDSCs在腫瘤以及免疫相關(guān)疾病治療中將會(huì)得到越來越廣泛的應(yīng)用。