大蒜素預(yù)處理對急性心肌梗死模型大鼠心肌病理改變的影響

方 燕 鄭旭旭 李麗燕

急性心肌梗死（acute myocadical infraction，AMI）屬于急性冠脈綜合征的嚴(yán)重類型，是心源性猝死的主要原因[1]。近年來隨著高血壓、高血脂等基礎(chǔ)疾病患病人群的增加，AMI 發(fā)病率呈逐年上升且年輕化趨勢[2]，具有起病急、進(jìn)展快的特點，有效預(yù)防AMI 對高危人群具有重要意義。大蒜素是三硫代烯丙醚類化合物，天然存在于百合科蔥屬植物蒜的鱗莖，既往研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素具有抑制心肌缺血再灌注大鼠心律失常、抑制糖尿病大鼠心肌組織纖維化的作用[3-4]。本實驗以臨床治療AMI 一線用藥維拉帕米做為陽性對照，探討大蒜素預(yù)處理對AMI 模型大鼠心肌病理改變的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 180 只無特定病原微生物級健康成年Sprague-Dawley（SD）大鼠，動物質(zhì)量合格證號：201911007，體質(zhì)量（230±20）g，購自溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心[SYXK（浙）2016-0006]，清潔環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，環(huán)境條件設(shè)置：12h 光照黑暗交替、溫度（25±1）℃、相對濕度（65±5）%。本實驗通過浙江省溫州市中醫(yī)院倫理委員會審核，倫理審批號：WZLL[K]字2019-032。數(shù)字編碼180 只大鼠，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、AMI 組、維拉帕米2.5 mg·kg-1·d-1預(yù)處理組和大蒜素5、10、20mg·kg-1·d-1預(yù)處理組（給藥劑量根據(jù)實驗動物與人等效劑量換算公式計算[5]），每組30 只。

1.2 主要藥物與試劑 大蒜素注射液（徐州萊恩藥業(yè)有限公司，規(guī)格2mL:30mg，批號20181006）；鹽酸維拉帕米注射液（上海禾豐制藥有限公司，規(guī)格2mL:5mg，批號20190130）；硝基藍(lán)四氮唑（nitroblue tetrazolium，NBT，上海前進(jìn)試劑廠，批號190327）；蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）、原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)（terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dUTP-biotin nick end labeling，TUNEL）試劑盒（北京博奧森生物科技有限公司，批號20190517、20190605）。

1.3 主要儀器 動物心電圖機(jī)（上海精密科學(xué)儀器有限公司，型號：BL-A420）；動物呼吸機(jī)（上海精密科學(xué)儀器有限公司，型號：ALC-V8）；小動物超聲儀（加拿大Visual Sonics 公司，型號：Vevo2100）；石蠟組織切片機(jī)（德國Leica 公司，型號：RM2125）；圖像分析系統(tǒng)（北京麥克奧迪儀器儀表有限公司，型號：Image-Pro Plus 6.0）；熒光顯微鏡（日本Nikon 公司，型號：TE2000-M）；超薄切片機(jī)（瑞典LKB 公司，型號：LKB-Ⅲ）；透射電子顯微鏡（日本Hitachi 公司，型號：H-7650）；倒置光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯公司，型號：AI09）。

1.4 實驗方法

1.4.1 給藥預(yù)處理與模型制備 給藥預(yù)處理[6]：加入適量生理鹽水制備濃度為2.5、5、10mg/mL 的大蒜素溶液和濃度為1.25mg/mL 的維拉帕米溶液；大蒜素5、10、20mg·kg-1·d-1預(yù)處理組予濃度為2.5、5、10mg/mL的大蒜素溶液，維拉帕米2.5mg·kg-1·d-1預(yù)處理組予濃度為1.25mg/mL 的維拉帕米溶液，假手術(shù)組和AMI 組予生理鹽水；各組均于造模手術(shù)前7 天開始腹腔注射給藥，給藥容積2mg·kg-1·d-1，1 天1 次。模型制備[7]：各組大鼠實施麻醉后，仰位固定、連接二導(dǎo)聯(lián)心電圖（BL-A420 型動物心電圖機(jī)，上海精密科學(xué)儀器有限公司）實時監(jiān)測，氣管切開并連接動物呼吸機(jī)（ALC-V8 型，上海精密科學(xué)儀器有限公司，參數(shù)設(shè)置：頻率90 次/min、潮氣量10mg/kg），采用0 號手術(shù)縫合線于左第3、4 肋間開胸暴露心臟，于左心耳下2～3mm 處結(jié)扎左冠狀動脈前降支；造模成功判斷標(biāo)準(zhǔn)[8]：結(jié)扎部位心肌蒼白或發(fā)紺、心電圖示ST 段弓背持續(xù)抬高、T 波高聳。假手術(shù)組行手術(shù)通路但不結(jié)扎。造模手術(shù)24h 后行各指標(biāo)檢測。

1.4.2 心功能指標(biāo)檢測 每組大鼠隨機(jī)取10 只，通過小動物超聲儀（Vevo2100 型，加拿大Visual Sonics公司）取左室乳頭肌水平短軸切面，檢測舒張末期左室內(nèi)徑（left ventricμLar end-diastolic diameter，LVIDd）、收縮末期左室內(nèi)徑（left ventricμLar diameter at the end of systole，LVIDs）、射血分?jǐn)?shù)（ejection fraction，EF）和每搏輸出量（stroke volume，SV），每只動物均連續(xù)測量3 個心動周期，取平均值。

1.4.3 心臟指數(shù)和心肌梗死體積百分比計算 （1）取上述心功能指標(biāo)檢測后各組10 只大鼠，稱量體質(zhì)量（W體），頸椎脫臼處死后迅速開胸取心臟、生理鹽水沖洗干凈后稱重（W心），心臟指數(shù)=（W心/W體）。（2）稱重后心臟組織置-20℃冰箱凍存30min，取左心室沿平行于房室溝方向橫切為4～5 片（MICROM HM340E 型病理組織切片機(jī)，德國美康公司），于37℃濃度2%的NBT 溶液中孵育1h，每5min 翻動心肌切片1 次使著色均勻。通過Image-Pro Plus 6.0 圖像分析系統(tǒng)（北京麥克奧迪儀器儀表有限公司）測算心肌梗死體積百分比（缺血區(qū)呈蒼白色、正常區(qū)呈紫黑色），心肌梗死體積百分比（%）=（心肌梗死面積×切片厚度/總心肌體積）×100%。

1.4.4 心肌組織病理學(xué)檢查及損傷評分 每組大鼠隨機(jī)取10 只，頸椎脫臼處死后迅速開胸取心臟，切取左心室心肌置4%多聚甲醛溶液固定72h，依次行脫水、浸蠟包埋、5μm 厚度切片（RM2125 型石蠟切片機(jī)，德國Leica 公司）、脫蠟水化后，行HE 染色（蘇木素溶液染色10min、伊紅水溶液染色3min、1%鹽酸酒精分化3s），脫水和透明處理后中性樹膠封片，通過倒置光學(xué)顯微鏡觀察心肌組織病理學(xué)改變；損傷評分[9]：正常心肌計0 分，呈病灶型病變且病變視野比例＜1/4 計1 分，呈病灶型病變且病變視野比例為1/4～1/2 計2 分，呈彌漫性病變且病變視野比例＞1/2 計3 分，分別從變性壞死、出血、間質(zhì)水腫、中性粒細(xì)胞浸潤四方面計分后求和即為損傷評分。

1.4.5 細(xì)胞凋亡觀察及凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI）計算 取1.4.3 制備的左心室心肌組織切片并脫蠟水化處理后，按照TUNEL 試劑盒說明書逐步進(jìn)行操作，37℃避光孵育1h 并洗滌后，用5μg/mL 濃度的DAPI 溶液染色5min 使細(xì)胞核著色，洗滌后用50%甘油封片，通過熒光顯微鏡（TE2000-M 型，日本Nikon 公司）觀察并拍照（凋亡細(xì)胞核著綠色）；AI 計算：每張切片隨機(jī)取5 個不重疊視野分別計數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，取平均值，AI（%）=（凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)）×100%。

1.4.6 心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察 取各組剩余10 只大鼠，頸椎脫臼處死后迅速開胸取心臟，切取左心室5mm 厚心肌組織，置4℃濃度4%的戊二醛溶液中固定24h 后PBS 溶液浸泡洗滌3 次（30min/次），置4℃濃度1%鋨酸固定3h 后雙蒸水浸泡洗滌3 次（10min/次），梯度酒精和無水丙酮脫水、氧化丙烯置換、Epon812 環(huán)氧樹脂浸透包埋后，經(jīng)半薄切片定位，以70～90nm 厚度超薄切片（LKB-Ⅲ型超薄切片機(jī)，瑞典），通過醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛雙重電子染色后使用透射電子顯微鏡（H-7650 型，日本Hitachi 公司）觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)并拍照。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 15.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（） 表示，多組間比較行單因素方差分析，兩兩比較行LSD-t 檢驗，檢驗水準(zhǔn)取α=0.05，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大蒜素預(yù)處理對AMI 模型大鼠心功能指標(biāo)的影響 與假手術(shù)組比較，AMI 組大鼠LVIDd、LVIDs升高且EF、SV 降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P 均＜0.01）；經(jīng)大蒜素10、20mg·kg-1·d-1或維拉帕米2.5mg·kg-1·d-1預(yù)處理7 天能夠有效抑制LVIDd、LVIDs 升高及EF、SV 降低，與AMI 組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01）；與維拉帕米2.5mg·kg-1·d-1預(yù)處理組比較，大蒜素20mg·kg-1·d-1預(yù)處理組對LVIDs 升高和SV 降低的抑制作用更優(yōu)（P＜0.05）。見表1。

表1 大蒜素預(yù)處理對AMI 模型大鼠心功能指標(biāo)的影響（）

表1 大蒜素預(yù)處理對AMI 模型大鼠心功能指標(biāo)的影響（）

注：AMI 為急性心肌梗死；LVIDd 為舒張末期左室內(nèi)徑；LVIDs 為收縮末期左室內(nèi)徑；EF 為射血分?jǐn)?shù)；SV 為每搏輸出量；與假手術(shù)組比較，aP＜0.01；與AMI 組比較，bP＜0.05，bbP＜0.01；與維拉帕米2.5mg·kg-1·d-1 預(yù)處理組比較，cP＜0.05

表2 大蒜素預(yù)處理對AMI 模型大鼠心臟指數(shù)、心肌梗死體積百分比、損傷評分和AI 的影響（）

表2 大蒜素預(yù)處理對AMI 模型大鼠心臟指數(shù)、心肌梗死體積百分比、損傷評分和AI 的影響（）

注：AMI 為急性心肌梗死；AI 為凋亡指數(shù)；與假手術(shù)組比較，aP＜0.01；與AMI 組比較，bP＜0.05，bbP＜0.01；與維拉帕米2.5mg·kg-1·d-1 預(yù)處理組比較，cP＜0.05，ccP＜0.01

2.2 大蒜素預(yù)處理對AMI 模型大鼠心臟指數(shù)和心肌梗死體積的影響 與假手術(shù)組比較，AMI 組大鼠心臟指數(shù)和心肌梗死體積百分比均顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；經(jīng)大蒜素10、20mg·kg-1·d-1或維拉帕米2.5mg·kg-1·d-1預(yù)處理7 天能有效抑制心臟指數(shù)和心肌梗死體積百分比升高，與AMI 組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01）；與維拉帕米2.5mg·kg-1·d-1預(yù)處理組比較，大蒜素20mg·kg-1·d-1預(yù)處理組對心肌梗死體積百分比升高的抑制作用更優(yōu)（P＜0.01）、兩組間心臟指數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見插頁圖1 和表2。

圖1 各組大鼠心肌組織梗死狀況（NBT 染色，蒼白色為梗死區(qū)）

2.3 大蒜素預(yù)處理對AMI 模型大鼠心肌組織病理改變和損傷評分的影響 經(jīng)HE 染色后觀察，假手術(shù)組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)完整、心肌纖維條路清晰，細(xì)胞排列整齊規(guī)則、形態(tài)正常；AMI 組大鼠呈現(xiàn)心肌纖維腫脹、斷裂、條路紊亂無序，心肌細(xì)胞排列不規(guī)則、核固縮偏移，可見大量中性粒細(xì)胞浸潤；與AMI 組比較，經(jīng)大蒜素5、10、20mg·kg-1·d-1或維拉帕米2.5mg·kg-1·d-1預(yù)處理7 天能夠不同程度抑制上述病理性形態(tài)結(jié)構(gòu)改變，其中大蒜素20mg·kg-1·d-1預(yù)處理組效果更優(yōu)。與假手術(shù)組比較，AMI 組大鼠心肌組織損傷評分升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；經(jīng)大蒜素10、20mg·kg-1·d-1或維拉帕米2.5mg·kg-1·d-1預(yù)處理7 天能夠有效抑制心肌組織損傷評分升高，與AMI 組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01）；與維拉帕米2.5mg·kg-1·d-1預(yù)處理組比較，大蒜素20mg·kg-1·d-1預(yù)處理組對心肌組織損傷評分升高的抑制作用更優(yōu)（P＜0.05）。見插頁圖2 和表2。

圖2 大蒜素預(yù)處理對AMI 模型大鼠心肌組織病理改變的影響（HE，×200）

2.4 大蒜素預(yù)處理對AMI 模型大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響 經(jīng)TUNEL 染色后觀察，假手術(shù)組大鼠心肌組織僅可見極少量凋亡細(xì)胞；與假手術(shù)組比較，AMI組大鼠心肌組織凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增多，AI 顯著升高（P＜0.01）；經(jīng)大蒜素5、10、20mg·kg-1·d-1或維拉帕米2.5mg·kg-1·d-1預(yù)處理7 天能夠不同程度抑制AMI 大鼠心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量增多和AI 升高，與AMI組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與維拉帕米2.5mg·kg-1·d-1預(yù)處理組比較，大蒜素20mg·kg-1·d-1預(yù)處理組對心肌細(xì)胞凋亡的抑制作用更優(yōu)（P＜0.01）。見插頁圖3 和表2。

圖3 大蒜素預(yù)處理對AMI 模型大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響（TUNEL，×200）

2.5 大蒜素預(yù)處理對AMI 模型大鼠超微結(jié)構(gòu)改變的影響 經(jīng)透射電子顯微鏡觀察，假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)未見異常；AMI 組呈現(xiàn)胞膜破裂、碎片，肌絲溶解斷裂，線粒體數(shù)量減少、腫脹、嵴斷裂溶解，核膜破裂、核仁邊界不清等超微結(jié)構(gòu)病變；經(jīng)大蒜素5、10、20mg·kg-1·d-1或維拉帕米2.5mg·kg-1·d-1預(yù)處理7 天能夠不同程度抑制上述病理性超微結(jié)構(gòu)改變，其中大蒜素20mg·kg-1·d-1預(yù)處理組效果較優(yōu)。見插頁圖4。

圖4 大蒜素預(yù)處理對AMI 模型大鼠超微結(jié)構(gòu)改變的影響（TEM，×10000）

3 討論

AMI 是臨床較為常見的急危重癥，多由動脈粥樣硬化狹窄、斑塊脫落聚集形成血栓所致，引發(fā)心源性休克、惡性心律失常等而致死[10]，AMI 起病急、進(jìn)展快，死亡多發(fā)生在發(fā)病1～2h 以內(nèi)，部分患者無法在最佳治療窗內(nèi)得到有效救治[11]。所以，研究能夠有效抑制AMI 后心肌組織損傷的藥物，對AMI 患病高危人群具有重要意義。

大蒜素是百合科蔥屬植物大蒜鱗莖的主要活性物質(zhì)，藥理研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素具有保護(hù)心血管系統(tǒng)、擴(kuò)張血管、改善血液循環(huán)等作用[12]，本實驗結(jié)果顯示，經(jīng)大蒜素預(yù)處理能夠有效抑制AMI 模型大鼠LVIDd、LVIDs 升高和EF、SV 降低，并且大蒜素20mg·kg-1·d-1預(yù)處理對LVIDs 升高和SV 降低的抑制作用優(yōu)于維拉帕米，提示大蒜素預(yù)處理具有抑制大鼠AMI 后心功能降低的作用。

NBT 是一種水溶性的光敏感復(fù)合物，水溶液呈淡黃色，能夠被正常心肌組織中的脫氫酶催化還原生成紫黑色的甲臢顆粒、沉積于胞漿中，而梗死區(qū)心肌組織內(nèi)缺少脫氫酶而不能染色，因此NBT 可用于心肌組織梗死的檢測。本實驗NBT 染色結(jié)果顯示，AMI 模型大鼠左心室可見明顯梗死灶，與王佳等[13]研究結(jié)果一致；計算心臟指數(shù)發(fā)現(xiàn)AMI 模型大鼠心臟變大，與陳恒文等[14]研究結(jié)果一致；經(jīng)大蒜素預(yù)處理能夠有效抑制AMI 模型大鼠心肌梗死體積百分比和心臟指數(shù)升高，并且大蒜素20mg·kg-1·d-1預(yù)處理對心肌梗死體積百分比和心臟指數(shù)升高的抑制作用優(yōu)于維拉帕米，提示大蒜素預(yù)處理具有抑制AMI 模型大鼠心肌組織壞死的作用。

通過HE 染色對心肌組織行病理學(xué)檢查，發(fā)現(xiàn)AMI 模型大鼠缺血區(qū)心肌組織呈現(xiàn)心肌纖維腫脹、斷裂，心肌細(xì)胞排列不規(guī)則、核固縮偏移，大量中性粒細(xì)胞浸潤等病理性形態(tài)結(jié)構(gòu)改變，與施洋等[15]研究結(jié)果一致；通過TUNEL 染色法觀察心肌細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn)AMI 模型大鼠缺血區(qū)心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增多，與張杰等[16]研究結(jié)果一致；通過TEM 觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)AMI 大鼠呈現(xiàn)胞膜破裂，肌絲溶解斷裂，線粒體數(shù)量減少、腫脹、嵴斷裂溶解，核膜破裂、核仁邊界不清等超微結(jié)構(gòu)病變，與張麗萍[17]研究結(jié)果一致。經(jīng)大蒜素預(yù)處理能夠明顯抑制AMI 大鼠心肌組織病理學(xué)改變并抑制損傷評分升高，抑制心肌細(xì)胞凋亡及AI 升高，抑制心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變，并且大蒜素20mg·kg-1·d-1預(yù)處理組的上述作用優(yōu)于維拉帕米，提示大蒜素預(yù)處理具有抑制AMI 后心肌組織病理改變的作用。

綜上所述，大蒜素預(yù)處理對AMI 模型大鼠心肌組織病理改變、心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)病理改變和心功能具有保護(hù)作用。