獨(dú)活寄生湯對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下軟骨細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)和凋亡的影響

林 晴，王文義，潘丹虹，黃艷峰，付長(zhǎng)龍，葉錦霞*

1 福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州350122；2 福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州350122

* 通信作者：葉錦霞，E-mail：xiaoyezi1203@126.com

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量的慢性、退行性關(guān)節(jié)疾病。 隨著我國(guó)人口老齡化趨勢(shì)加重，該病發(fā)病率顯著增高，預(yù)計(jì)到2020 年將成為第4 大致殘性疾?。?］。其發(fā)病的中心環(huán)節(jié)是關(guān)節(jié)軟骨退變和繼發(fā)性骨質(zhì)增生，主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、腫脹晨僵、活動(dòng)不利、甚者關(guān)節(jié)畸形等［2-3］?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡有著密切關(guān)系［4］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是Ca2＋主要儲(chǔ)存場(chǎng)所，Ca2＋作為細(xì)胞凋亡信號(hào)之一，當(dāng)細(xì)胞受到外源性化合物影響時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的Ca2＋穩(wěn)態(tài)破壞，代謝紊亂，繼而激發(fā)ERS 出現(xiàn)細(xì)胞凋亡［5］。 毒胡蘿卜素（Thapsigargin，TG）是Ca2＋-ATP 酶抑制劑，可使未折疊或異常折疊的蛋白在軟骨細(xì)胞內(nèi)蓄積或使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2＋穩(wěn)定失衡，常被用來(lái)制作軟骨細(xì)胞ERS 模型［6］。前期臨床試驗(yàn)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，獨(dú)活寄生湯通過(guò)緩解關(guān)節(jié)軟骨退變對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎有良好療效［7-9］。目前對(duì)于骨關(guān)節(jié)炎的治療手段頗多，主要以減輕癥狀，延緩病程進(jìn)展為主要目的，但仍缺乏特效療法［10］。本研究通過(guò)觀察獨(dú)活寄生湯在ERS 下對(duì)Ca2＋平衡及軟骨細(xì)胞凋亡的影響，以期探討其防治骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)SD 大鼠20 只，雄性，4 周齡，體質(zhì)量90～100 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005。 本實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展已獲得福建中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)審批（批準(zhǔn)文號(hào)：〔2019〕福中醫(yī)倫理審字第007 號(hào)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

獨(dú)活寄生湯購(gòu)自福建省第三人民醫(yī)院，全方由獨(dú)活9 g，桑寄生、杜仲、牛膝、細(xì)辛、秦艽、茯苓、肉桂、防風(fēng)、川芎、人參、甘草、當(dāng)歸、芍藥、干地黃各6 g 組成。 采用70%乙醇回流提取的方法制備，合并濾液，濃縮、干燥。 將獨(dú)活寄生湯提取物用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基配制成64 mg／mL 溶液，置于-20 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?使用前用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基配成所需濃度，并用0.22 μm 的無(wú)菌型微孔濾膜過(guò)濾。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑和設(shè)備

見(jiàn)表1。

表1 主要試劑及設(shè)備Table 1 Main reagents and instruments

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)體系的建立及鑒定 用1%戊巴比妥將2 只SD 大鼠麻醉后脫頸處死，用75%酒精浸泡5 min，用骨剪截取膝關(guān)節(jié)，用75%酒精浸泡10 min 后帶入超凈工作臺(tái)操作：先用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）充分漂洗，刮除關(guān)節(jié)周?chē)街慕M織如肌肉、骨膜、滑膜。 用手術(shù)刀片削取每個(gè)關(guān)節(jié)表面的軟骨，以不滲血為度。 PBS充分漂洗軟骨小塊3 次。 用手術(shù)刀片切碎至1 mm大小，PBS 沖洗2 次后，置入含8 mL 0.2%Ⅱ型膠原酶的玻璃瓶中，置于37 ℃，100 r／min 水浴搖床消化，每2 h 吸取1 次上清液，120 目尼龍網(wǎng)篩過(guò)濾，所得濾液1 000 r／min，離心5 min，棄上清液，收集細(xì)胞沉淀，重復(fù)3 次。 用含10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基（Dulbecco's modified eagle media，DMEM）重懸細(xì)胞，吹打混勻后接種至培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱原代培養(yǎng)，48 h 后倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁情況，以后2～3 d 更換培養(yǎng)液1 次，直到長(zhǎng)成細(xì)胞單層，選第2 代軟骨細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化備用。 第3 代軟骨細(xì)胞采用甲苯胺藍(lán)染色法鑒定并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 CCK-8 法檢測(cè)軟骨細(xì)胞的存活率 第2 代軟骨細(xì)胞以1.0×105個(gè)／mL 的密度接種于96 孔板，每孔100 μL，24 h 后觀察細(xì)胞生長(zhǎng)，至50%～60%時(shí)，將細(xì)胞分為空白組，模型組，獨(dú)活寄生湯低、中、高劑量組，每組設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔。

1.4.2.1 空白組 孔中加入含10%胎牛血清培養(yǎng)基100 μL。

1.4.2.2 模型組 孔中加入劑量為25 μmol／L TG（DMEM 完全培養(yǎng)基配制）100 μL 作用4 h［11］。

1.4.2.3 獨(dú)活寄生湯低、中、高劑量組 孔中加入劑量為25 μmol／L TG 的含血清培養(yǎng)基100 μL 作用4 h后，吸棄培養(yǎng)基換成100、200、400 μg／mL 不同濃度的獨(dú)活寄生湯（DMEM 完全培養(yǎng)基配制）。 作用24 h后，每孔直接加入CCK-8 溶液10 μL，37 ℃、5%CO2，孵育4 h，終止培養(yǎng)，在450 nm 波長(zhǎng)的酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值［12-13］。

1.4.3 Hoechst 33342 檢測(cè)軟骨細(xì)胞凋亡情況 各組干預(yù)后，棄除培養(yǎng)基，用PBS 洗1 次，加入4%多聚甲醛，固定15 min。 棄除固定液，用PBS 洗3 次，每次搖晃3 min，加入10 μg／mL Hoechst 33342 染色液1 mL，染色30 min，期間搖晃幾次使其染色充分均勻，去染色液，用PBS 洗3 次，每次搖晃3 min，最后加入200 μL PBS，用共聚焦顯微鏡觀察軟骨細(xì)胞的凋亡情況。

1.4.4 雙轉(zhuǎn)盤(pán)激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)變化 采用Ca2＋敏感熒光探針Fluo-3／AM 進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)Ca2＋熒光標(biāo)記，配制終濃度為50 μmol／L Fluo-3／AM 和10 μg／mL Hoechst 33342混合液（DMEM 培養(yǎng)基配制），加于培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞樣品上，置于5% CO2孵箱中孵育30 min。PBS 液漂洗1 次，雙轉(zhuǎn)盤(pán)激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察，選擇適當(dāng)?shù)膮?shù)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行動(dòng)態(tài)掃描（Fluo-3／AM：激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)526 nm；Hoechst 33342：激發(fā)波長(zhǎng)350 nm，發(fā)射波長(zhǎng)460 nm），每組選取5 個(gè)細(xì)胞，采用系統(tǒng)自帶軟件，根據(jù)熒光強(qiáng)度變化-時(shí)間的曲線圖，得出反映細(xì)胞內(nèi)游離Ca2＋濃度動(dòng)態(tài)變化的曲線。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以（±s）表示，數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布使用單因素方差分析，若方差齊則使用LSD-t檢驗(yàn)，若方差不齊則采用Gams-Howell 檢驗(yàn)；數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布，采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 軟骨細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)及鑒定

2.1.1 甲苯胺藍(lán)染色鑒定 接種后，細(xì)胞呈圓形，漂浮于培養(yǎng)液中，24 h 后，大多數(shù)軟骨細(xì)胞開(kāi)始貼壁，伸展并形成偽足樣突起。 培養(yǎng)第7 天，軟骨細(xì)胞增殖逐漸融合成單層，呈不規(guī)則“鋪路石”樣。 第2 代、第3 代軟骨細(xì)胞形態(tài)規(guī)則、大小一致，邊界清晰。 第4 代開(kāi)始軟骨細(xì)胞逐漸呈長(zhǎng)梭形，分化為成纖維細(xì)胞。 選取第3 代軟骨細(xì)胞進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色，可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)藍(lán)紫色異染顆粒，細(xì)胞周?chē)梢?jiàn)異染顆粒。見(jiàn)圖1。

圖1 甲苯胺藍(lán)染色鑒定（×200）Figure 1 Identification using toluidine blue staining (×200)

2.1.2 軟骨細(xì)胞形態(tài)變化 倒置顯微鏡下觀察各

組軟骨細(xì)胞的形態(tài)，空白組呈單層鋪路石狀生長(zhǎng)；

模型組和獨(dú)活寄生湯各劑量組細(xì)胞形態(tài)由鋪路石

狀呈現(xiàn)多角形增加，偽足變長(zhǎng)，細(xì)胞呈皺縮狀態(tài)、細(xì)胞間隙變大、數(shù)量變少，懸浮死細(xì)胞增多。 獨(dú)活寄生湯各劑量組與模型組比較，細(xì)胞數(shù)量明顯增多，細(xì)胞胞質(zhì)均勻。 見(jiàn)圖2。

圖2 第3 代軟骨細(xì)胞形態(tài)（×100）Figure 2 Morphological observation of the third chondrocytes （×100）

2.2 CCK-8 法檢測(cè)獨(dú)活寄生湯對(duì)軟骨細(xì)胞存活率的影響

與空白組相比，模型組的存活率較低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而獨(dú)活寄生湯各劑量組的存活率均比模型組高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其對(duì)軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用隨劑量的升高而增高，具有一定的量效關(guān)系（P＜0.05）。 見(jiàn)表2。

2.3 Hoechst 33342 檢測(cè)軟骨細(xì)胞凋亡情況

共聚焦顯微鏡下觀察，空白組細(xì)胞核出現(xiàn)彌散均勻的低密度亮藍(lán)色熒光，凋亡細(xì)胞較少。 模型組的凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著增多，其細(xì)胞核固縮、呈顆粒狀熒光，部分呈半月形增加。 獨(dú)活寄生湯各劑量組的細(xì)胞凋亡數(shù)比模型組明顯減少，只有少量凋亡細(xì)胞呈高密度的亮藍(lán)色或半月形，且獨(dú)活寄生湯各組的細(xì)胞凋亡數(shù)量伴隨劑量增高而減少，呈現(xiàn)一定量效關(guān)系（P＜0.05）。 見(jiàn)圖3、圖4。

表2 5 組軟骨細(xì)胞活性比較（±s）Table 2 Comparison of the activity of chondrocytes in five groups （±s）

表2 5 組軟骨細(xì)胞活性比較（±s）Table 2 Comparison of the activity of chondrocytes in five groups （±s）

注：與模型組比較，1） P＜0.05。Note: Compared with the model group, 1) P＜0.05.

細(xì)胞活性（吸光值）3.68±0.051）1.91±0.13 2.50±0.061）2.64±0.081）2.76±0.101）組別空白組模型組獨(dú)活寄生湯低劑量組獨(dú)活寄生湯中劑量組獨(dú)活寄生湯高劑量組n 5 5 5 5 5劑量／（μmol／L）—25 100 200 400

圖3 Hoechst 33342 檢測(cè)軟骨細(xì)胞凋亡情況（×400）Figure 3 Detection of chondrocyte apoptosis by Hoechst 33342 staining (×400)

圖4 5 組軟骨細(xì)胞凋亡率Figure 4 The apoptosis rate of chondrocytes in five groups

圖5 雙轉(zhuǎn)盤(pán)激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度（×400）Figure 5 Observation of Ca2+ fluorescence intensity in cells by double rotary laser confocal microscope (×400)

2.4 雙轉(zhuǎn)盤(pán)激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)變化

空白組Ca2＋熒光強(qiáng)度較弱且均一，觀察30 min后，仍處于穩(wěn)定的狀態(tài)。 與空白組比較，模型組中Ca2＋釋放明顯增多，熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，熒光波譜顯示Ca2＋火花較頻繁，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，獨(dú)活寄生湯中、高劑量組（200、400 μg／mL）軟骨細(xì)胞Ca2＋火花明顯減少，且能較快恢復(fù)到Ca2＋穩(wěn)態(tài)，獨(dú)活寄生湯低劑量組（100 μg／mL）雖然仍有部分Ca2＋火花，但熒光強(qiáng)度明顯比模型組弱，熒光強(qiáng)度-時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化曲線趨于平緩。 見(jiàn)圖5、圖6。

圖6 5 組Ca2+濃度動(dòng)態(tài)變化Figure 6 Dynamic changes of Ca2+concentration in five groups

3 討 論

3.1 TG 可建立穩(wěn)定的軟骨細(xì)胞ERS 模型

本研究采用機(jī)械-0.2%Ⅱ型膠原酶消化法獲取大量軟骨細(xì)胞， 甲苯胺藍(lán)染色可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)藍(lán)紫色異染顆粒， 證實(shí)本研究建立了穩(wěn)定的軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)體系［11］。 課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在OA 患者的軟骨細(xì)胞中存在ERS， 且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過(guò)載會(huì)誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞的凋亡，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞外基質(zhì)合成和降解代謝失衡，從而加速OA 的病理進(jìn)程［12］。

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用Ca2＋-ATP 酶抑制劑TG 建立軟骨細(xì)胞ERS 模型［13］。ERS 可通過(guò)激活未折疊蛋白反應(yīng)觸發(fā)細(xì)胞凋亡［14－15］。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，25 μmol／L TG作用于軟骨細(xì)胞4 h，顯微鏡下可觀察到軟骨細(xì)胞變形、間隙變大、數(shù)量變少，CCK－8 檢測(cè)結(jié)果顯示軟骨細(xì)胞存活率顯著降低，Hoechst 33342 染色可見(jiàn)明顯的細(xì)胞核固縮、碎裂，或呈月牙狀等細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，故25 μmol／L TG 干預(yù)第3 代軟骨細(xì)胞4 h 即可建立合適而穩(wěn)定的軟骨細(xì)胞ERS 模型。 TAKADA 等［16］研究結(jié)果亦證實(shí)了ERS 相關(guān)蛋白與OA 軟骨細(xì)胞變性及凋亡均呈正相關(guān)。

3.2 獨(dú)活寄生湯可維持軟骨細(xì)胞內(nèi)Ca2＋平衡

過(guò)度的ERS 會(huì)刺激Ca2＋通道活化，Ca2＋作為凋亡過(guò)程中重要的信號(hào)，可通過(guò)調(diào)節(jié)Ca2＋敏感的關(guān)鍵酶誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［17-19］。研究表明，獨(dú)活寄生湯含藥血清可抑制因ERS 反應(yīng)引起的軟骨細(xì)胞凋亡［20］，但尚未深入探索其是否通過(guò)維持細(xì)胞內(nèi)Ca2＋平衡而發(fā)揮作用。 本研究采用雙轉(zhuǎn)盤(pán)激光共聚焦顯微鏡實(shí)時(shí)觀察發(fā)現(xiàn)，模型組細(xì)胞內(nèi)Ca2＋釋放增多、火花出現(xiàn)頻繁、熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，與空白組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可見(jiàn)在TG 誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞ERS 模型中存在Ca2＋穩(wěn)態(tài)失衡現(xiàn)象。 謝文斌［21］在進(jìn)行人膝關(guān)節(jié)OA 原位軟骨細(xì)胞自發(fā)性Ca2＋信號(hào)特征分析時(shí)亦證實(shí)了人膝關(guān)節(jié)原位軟骨深層細(xì)胞自發(fā)性Ca2＋信號(hào)與軟骨退變程度呈負(fù)相關(guān)。 當(dāng)加入獨(dú)活寄生湯中、高劑量進(jìn)行干預(yù)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)Ca2＋火花釋放減少，熒光強(qiáng)度減弱，熒光強(qiáng)度-時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化曲線趨于平緩，能很快地恢復(fù)到鈣平衡狀態(tài)。Hoechst 33342染色可見(jiàn)獨(dú)活寄生湯干預(yù)時(shí)軟骨細(xì)胞凋亡數(shù)量減少，CCK－8 檢測(cè)亦提示獨(dú)活寄生湯組細(xì)胞存活率較模型組高。 這提示，獨(dú)活寄生湯可維持軟骨細(xì)胞內(nèi)鈣平衡，減輕ERS 反應(yīng)和軟骨細(xì)胞凋亡。

4 小 結(jié)

在OA 的病理過(guò)程中，Ca2＋介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡在骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病中起重要作用。 由于關(guān)節(jié)軟骨中Ca2＋穩(wěn)態(tài)失衡，ERS 持續(xù)激活，進(jìn)而引起軟骨細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致軟骨合成和降解代謝失衡，最終造成軟骨細(xì)胞外基質(zhì)和關(guān)節(jié)軟骨破壞。 本研究證實(shí)，獨(dú)活寄生湯可通過(guò)維持關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)鈣平衡，減輕ERS，減少軟骨細(xì)胞凋亡，從而對(duì)關(guān)節(jié)軟骨產(chǎn)生保護(hù)作用，但是目前獨(dú)活寄生湯如何通過(guò)調(diào)控相關(guān)蛋白表達(dá)以及信號(hào)通路維持鈣穩(wěn)態(tài)尚未完全闡明，未來(lái)可基于以上研究進(jìn)一步深入探討?yīng)毣罴纳鷾淖饔脵C(jī)制，為OA 的早期預(yù)防及治療提供新思路。