從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討洋金花治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制

付長(zhǎng)龍，梅陽陽，李西海，邱志偉，4，陳長(zhǎng)興，鄭春松

1 福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州350122；2 福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州350122；3 福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建 福州350101；4 福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院，福建 福州350003

* 通信作者：陳長(zhǎng)興，E-mail: 1125452554@qq.com

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一類以滑膜炎、關(guān)節(jié)進(jìn)行性破壞為主要病理基礎(chǔ)的慢性自身免疫性疾病，具有易反復(fù)、病程長(zhǎng)、高致殘率等特點(diǎn)，其受累關(guān)節(jié)常伴有疼痛、腫脹、功能障礙甚至畸形，嚴(yán)重影響類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的健康及生活質(zhì)量［1-2］。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎歸屬于中醫(yī)“痹癥”范疇，基本病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，即以肺、脾、腎3 個(gè)臟腑功能減弱為本，風(fēng)、寒、濕等外邪及痰濁致氣滯血瘀，引起經(jīng)絡(luò)痹阻為標(biāo)實(shí)［3-4］。

洋金花又名鬧洋花、醉心花、鳳茄花、風(fēng)茄花、白花曼陀羅，其味辛性溫，具有行痹通絡(luò)、止痛鎮(zhèn)靜之效，可用于治療風(fēng)濕痹痛、跌打損傷及慢驚風(fēng)之痙攣抽搐等，是臨床治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎常用藥物之一。 《本草綱目》記載：“諸風(fēng)及寒濕腳氣，煎湯洗之，又主驚癇及脫肛，并入麻藥”，2015 年版《中國藥典》亦刊載其具有重要的藥用價(jià)值。 隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的深入發(fā)展，洋金花及其提取成分已被藥學(xué)、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)及臨床應(yīng)用等領(lǐng)域?qū)＜覐V泛研究，并成為新的研究熱點(diǎn)。 研究表明，洋金花具有調(diào)節(jié)免疫、抗炎、抑制增殖等功能［5］，其多種活性成分可有效治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，減輕類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的滑膜炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，阻止其病理進(jìn)程進(jìn)一步發(fā)展。 此外，洋金花臨床治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎具有獨(dú)特療效［6-7］。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，構(gòu)建洋金花作用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)模型和“疾病-藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，篩選與分析網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點(diǎn)以及相應(yīng)的功能富集和信號(hào)通路，為闡明洋金花治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫和軟件

數(shù)據(jù)庫和軟件具體應(yīng)用情況，見表1。

表1 數(shù)據(jù)庫與軟件匯集Table 1 Collections of database and software

1.2 洋金花有效化合物及靶點(diǎn)篩選

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP），檢索與洋金花相關(guān)的所有化學(xué)成分，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性（drug likeness，DL）≥0.18 作為篩選指標(biāo)，篩選出洋金花的有效化合物，通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫將有效化合物的所有蛋白名稱轉(zhuǎn)化為基因名。

1.3 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎靶點(diǎn)的獲取

通過GeneCards 數(shù)據(jù)庫和OMIM 數(shù)據(jù)庫中的Gene map 以“rheumatoid arthritis”為關(guān)鍵詞進(jìn)行已知的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎靶點(diǎn)檢索。

1.4 疾病-藥物-有效化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

用R 3.6.3 的韋恩圖（Venn Diagram）包將洋金花靶點(diǎn)和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎靶點(diǎn)取交集并作韋恩圖，作為洋金花治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的預(yù)測(cè)靶基因，利用網(wǎng)絡(luò)圖編輯軟件Cytoscape 3.7.1 對(duì)獲取的預(yù)測(cè)靶基因和洋金花有效化合物進(jìn)行可視化處理，構(gòu)建疾病-藥物-有效化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.5 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

STRING 數(shù)據(jù)庫是一個(gè)在線搜索已知蛋白相互作用關(guān)系的數(shù)據(jù)庫，本研究采用STRING 7.8 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建預(yù)測(cè)靶基因的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，去除游離節(jié)點(diǎn)，為提高可信度，置信度設(shè)置為0.9，建立蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction network，PPI）。 將獲得的網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1 進(jìn)行可視化處理，用cytoHubba 插件獲取度值（degree）最高的30 個(gè)基因作為核心基因，度值可以反映網(wǎng)絡(luò)中某個(gè)節(jié)點(diǎn)與其他節(jié)點(diǎn)相連接的數(shù)目，度值越高的節(jié)點(diǎn)更傾向于是網(wǎng)絡(luò)中的核心基因。

1.6 GO 功能富集分析和KEGG 信號(hào)通路分析

利用R 3.6.3 ClusterProfiler 包對(duì)洋金花治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的預(yù)測(cè)靶基因進(jìn)行GO 功能富集分析和KEGG 信號(hào)通路分析， 獲得洋金花治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的主要功能富集信息和信號(hào)通路。

2 結(jié) 果

2.1 洋金花有效化合物和作用靶點(diǎn)

在TCMSP 中共檢測(cè)到洋金花有效化合物27 個(gè)，對(duì)應(yīng)的靶基因318 個(gè)，主要化合物包括槲皮素、山柰酚、東莨菪堿、白曼陀羅素、阿托品等。 見表2。

2.2 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎靶點(diǎn)

在GeneCards 數(shù)據(jù)庫和OMIM 數(shù)據(jù)庫中共檢索到類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)靶點(diǎn)4 360 個(gè)。

2.3 疾病-藥物-有效化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

用Venn Diagram 包共篩選出洋金花治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的預(yù)測(cè)靶基因125 個(gè)，見圖1。將預(yù)測(cè)靶基因和有效化合物導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1 進(jìn)行可視化處理，見圖2。該網(wǎng)絡(luò)共有142 個(gè)節(jié)點(diǎn)，352 條邊。網(wǎng)絡(luò)中包含27 個(gè)有效化合物，槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、阿托品（scopolamine）、異落葉松脂素［（2R，3R，4S）-4-（4-hydroxy-3-methoxy-phenyl）-7-methoxy-2，3-dimethylol-tetralin-6-ol］、天仙子堿（apohyoscine）、東莨菪堿（hyoscine），分別為104、37、11、11、10。 提示以上關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)的化合物可能是洋金花治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的重要組成。

表2 洋金花活性化合物Table 2 Active compounds of hindu datura

2.4 洋金花治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎預(yù)測(cè)靶基因的PPI網(wǎng)絡(luò)

125 個(gè)靶點(diǎn)基因基于STRING 數(shù)據(jù)庫的PPI 網(wǎng)絡(luò)，隱藏游離節(jié)點(diǎn)，置信度0.9，見圖3。 該網(wǎng)絡(luò)共有125 個(gè)節(jié)點(diǎn)，452 條邊，平均度值7.23。 每個(gè)節(jié)點(diǎn)代表一個(gè)靶基因， 邊代表節(jié)點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系，邊越多說明該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中越重要。 將該網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 進(jìn)行可視化處理，利用cytoHubba 插件獲得度值最高的30 個(gè)基因作為核心基因，見圖4。 由圖可見，Ju-Nana 原癌基因（JUN）、蛋白激酶Bα（PKBα或AKT1）、V-rel 網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞過多癥病毒原癌基因同源物A（RELA）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）度值（degree 依次為：30、29、28、27）明顯高于其余靶點(diǎn)度值（degree均＜22），這提示以上靶點(diǎn)在PPI網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮了重要的關(guān)聯(lián)作用，可能是洋金花與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎產(chǎn)生關(guān)聯(lián)的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。

2.5 基因本體功能富集分析

圖1 洋金花靶點(diǎn)與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎靶點(diǎn)韋恩圖Figure 1 Venn diagram of the hindu datura target and rheumatoid arthritis target

圖2 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎-洋金花-預(yù)測(cè)靶點(diǎn)-有效化合物網(wǎng)絡(luò)Figure 2 Network of rheumatoid arthritis-hindu daturapredicted target-effective compound

圖3 預(yù)測(cè)靶基因構(gòu)建的PPI 網(wǎng)絡(luò)Figure 3 Prediction of PPI network constructed by target genes

基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析包括生物學(xué)過程（biological process，BP）、細(xì)胞組分（cell component，CC）和分子功能（molecular functions，MF），見圖5。利用R 3.6.3 的ClusterProfiler 包對(duì)125 個(gè)預(yù)測(cè)靶基因進(jìn)行分析，GO 分析中涉及2 313 個(gè)條目，包括BP 2 086 條、CC 75 條、MF 152條。 洋金花治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的預(yù)測(cè)靶基因BP 主要涉及脂多糖反應(yīng)、細(xì)菌源性分子的反應(yīng)、對(duì)活性氧的反應(yīng)、對(duì)金屬離子反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、類固醇激素反應(yīng)、活性氧代謝過程、對(duì)氧含量的反應(yīng)等。CC包括膜筏、膜區(qū)、質(zhì)膜筏、突觸前膜的組成部分。 MF涉及到核受體的活性、轉(zhuǎn)錄因子活性（直接配體調(diào)控序列特異性DNA 結(jié)合）、類固醇激素受體活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活劑活性、RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、 激酶調(diào)節(jié)活動(dòng)、受體配體活動(dòng)等。

圖4 PPI 網(wǎng)絡(luò)中的核心基因Figure 4 Core genes in the PPI network

2.6 京都基因和基因組百科全書信號(hào)通路分析

利用R 3.6.3 的ClusterProfiler 包，對(duì)洋金花治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的預(yù)測(cè)靶基因進(jìn)行京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信號(hào)通路分析，前20 結(jié)果，見表3。 主要涉及AGE-RAGE 信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路和Toll 樣受體信號(hào)等關(guān)鍵通路。

3 討 論

洋金花在中國古代已被應(yīng)用于疾病治療。 據(jù)《后漢書·華佗傳》記載，古代醫(yī)家華佗開展“刳破腹背，抽割積聚”以及“刮骨療毒”等外科手術(shù)，與其所創(chuàng)“能令人麻醉，忽而不知人事，任人劈剖，不曉痛癢”的麻沸散密切相關(guān)［8］；清代《傷科匯纂》卷七方名的整骨麻藥以“鬧羊花倍用，胡加子、姜黃、川烏、草烏、麻黃各等分”構(gòu)成，則具有“開取箭頭，服之不痛”之功效［9］，以上組方均以洋金花為主藥，充分驗(yàn)證了洋金花具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化等作用。 因此，洋金花被廣泛應(yīng)用于治療風(fēng)濕痹痛、癲癇、蛇傷、狂犬病等。 在南美洲、歐洲、中東等國外醫(yī)學(xué)中，洋金花也被用于治療各類疾病，如風(fēng)濕病、潰瘍、傷口、炎癥、坐骨神經(jīng)痛等，故又被稱為“萬能神藥”。 此外，還發(fā)現(xiàn)洋金花在改善免疫系統(tǒng)疾病方面（類風(fēng)濕、銀屑病等）也具有良效［10-11］，尤其在干預(yù)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病程進(jìn)展方面療效獨(dú)特［12］。 這可能與洋金花以下的作用機(jī)制有關(guān)。

3.1 從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討洋金花治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制

3.1.1 抗炎鎮(zhèn)痛作用 本研究TCMSP 檢測(cè)到洋金花有效化合物27 個(gè)，對(duì)應(yīng)的靶基因318 個(gè)，主要化合物包括槲皮素、山柰酚、東莨菪堿等。 有研究表明，槲皮素可降低類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞中炎癥因子（interleukin，IL）-1β、6、8 與基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-1、3、13 的含量表達(dá)，這可能與抑制NF-κB 的表達(dá)相關(guān)［13］；山柰酚（3，4'，5，7-四羥基黃酮）作為一種具有羥基苯基鉻酮結(jié)構(gòu)的次生植物代謝物，可調(diào)控炎癥反應(yīng)過程，改善致炎狀態(tài)［14］；東莨菪堿對(duì)大腦皮層及皮下部位產(chǎn)生抑制作用，其可能通過誘導(dǎo)腦電波由低幅快波轉(zhuǎn)變?yōu)椴灰?guī)則高波幅慢波，增加腦電總功率和低頻成分及其主頻率，進(jìn)而促使意識(shí)喪失，產(chǎn)生麻醉止痛功效［15-16］。這提示，洋金花發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用以治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎可能與以上活性成分物質(zhì)密切相關(guān)。 這與劉振明等［17-18］研究發(fā)現(xiàn)洋金花具有很明顯的鎮(zhèn)痛作用，顯著提高小鼠的痛閾值的研究結(jié)果一致。

圖5 GO 功能富集分析Figure 5 GO functional enrichment analysis

表3 KEGG 信號(hào)通路Table 3 KEGG signaling pathway

3.1.2 抗氧化作用 在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎介導(dǎo)的慢性疼痛中，外周敏化發(fā)揮了重要作用，而外周致敏機(jī)制通常因關(guān)節(jié)炎癥或結(jié)構(gòu)異常損傷直接誘導(dǎo)激活致敏傷害感受器（例如低閾值傷害性纖維），伴隨刺激累及，可最終促使脊髓神經(jīng)元致敏發(fā)生［19］。 在此過程中，多類型激素與趨化因子扮演了重要角色，其中異常氧自由基的含量表達(dá)可直接介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，引起疼痛，進(jìn)而加劇類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病理進(jìn)程。 其具體機(jī)制為：以自由電子的形式形成局部負(fù)電位，釋放電子匯聚成電子流，并趨向高電位的痛覺神經(jīng)末梢，當(dāng)電子流刺激達(dá)到閾值電位時(shí)，Na+、K+通道開放，膜電位翻轉(zhuǎn)，產(chǎn)生了動(dòng)作電位，引起疼痛［20］。 有研究表明，洋金花甲醇提取物、總生物堿、有效活性成分（槲皮素、山柰酚）等具有較強(qiáng)的抗氧化作用［21-23］，可增加抗氧化劑的表達(dá)酶表達(dá)，提高血液中超氧化歧化酶的活力，抑制丙二醛含量，降低細(xì)胞損傷，從而調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)過程。 這提示，洋金花治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎可能與其抗氧化作用有關(guān)。

3.2 洋金花通過調(diào)控與炎癥反應(yīng)相關(guān)信號(hào)途徑發(fā)揮治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎作用

本研究網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果顯示，洋金花通過調(diào)控與炎癥反應(yīng)相關(guān)信號(hào)途徑發(fā)揮治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎作用，其具體作用途徑及過程包括：

3.2.1 調(diào)節(jié)活化階段 受病理性致炎因素刺激后，炎癥因子可與細(xì)胞膜受體發(fā)生特異性結(jié)合，通過跨膜信息遞進(jìn)，誘導(dǎo)胞內(nèi)絲／蘇氨酸蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）信號(hào)活化。活化后的MAPK 信號(hào)可進(jìn)一步啟動(dòng)級(jí)聯(lián)效應(yīng)，直至將跨膜信息移至細(xì)胞核內(nèi)，并特異性激活相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄效應(yīng)，進(jìn)而參與細(xì)胞的多種生物學(xué)反應(yīng)。

3.2.2 調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄階段 受到壓應(yīng)力異常改變或炎癥刺激因素影響，其信息調(diào)控從胞外向胞內(nèi)傳遞，再到引起生物學(xué)效用，需要MAPK 途徑的級(jí)聯(lián)反應(yīng)（三級(jí)激酶）的參與。 在此過程中激活型Ras 通過級(jí)聯(lián)反應(yīng)活化Raf 轉(zhuǎn)錄因子，一旦發(fā)動(dòng)該反應(yīng)后續(xù)又可依次激活絲裂原活化蛋白激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase，MAPKK 或MEK）與細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）（其中ERK2 即MAPK1），而ERK 作為Ras 途徑的重要下游部分，是連接胞質(zhì)至細(xì)胞核內(nèi)信息轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵媒介，一旦被磷酸化激活，即轉(zhuǎn)變?yōu)閜-ERK1／2，可引起下游相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（C-JUN 等）活化，由此介導(dǎo)炎癥反應(yīng)［24］。

3.2.3 調(diào)控效應(yīng)（致炎）階段 有研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α與ERK 信號(hào)途徑具有密切聯(lián)系，TNF-α 可產(chǎn)生放大ERK 信號(hào)途徑的活化效用［25］，此外，IL-1β 可上調(diào)細(xì)胞中C-MYC 含量表達(dá)，并影響C-MYC 等相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)錄過程［26］。 受磷酸化作用而被活化的p-ERK1／2 可作用于多類活性底物，其中可針對(duì)內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitricoxide synthase，eNOS）與誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）并致使其活化，誘導(dǎo)精氨酸發(fā)生氧化產(chǎn)生NO，參與氧化應(yīng)激反應(yīng)［27］。而AKT1（又稱為蛋白激酶B）作為絲／蘇氨酸蛋白激酶家族中的重要成員之一，亦參與了多種生物學(xué)過程（代謝、增殖、血管生成等）。 研究表明，RELA 基因在調(diào)控炎癥的細(xì)胞信號(hào)系統(tǒng)—NF-κB 信號(hào)通路中起著極其重要的作用［28］。 而當(dāng)其遭受外界壓力變化、異常細(xì)胞因子（脂多糖、TNF-α 與IL-1 等）與自由基（NO 等）作用、紫外線照射影響及細(xì)菌或病毒抗原發(fā)生結(jié)合反應(yīng)等一系列刺激后，可激活NF-κB 經(jīng)典途徑，而此通路的活化又可加劇炎癥反應(yīng)的程度［29］。 綜上，洋金花可能通過調(diào)控以上相關(guān)信號(hào)途徑及信號(hào)分子發(fā)揮作用。

4 小 結(jié)

隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的普及應(yīng)用，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)已成為一種研究中藥有效成分及其作用機(jī)理的新途徑。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)洋金花可通過多途徑、多靶點(diǎn)發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛及抗氧化作用治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；推測(cè)其機(jī)制可能與槲皮素、山柰酚、東莨菪堿等活性物質(zhì)有關(guān)，并調(diào)控相關(guān)信號(hào)分子及信號(hào)途徑抑制炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)。 這可為進(jìn)一步開展洋金花防治類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎作用機(jī)制的基礎(chǔ)研究提供一定的理論依據(jù)［30-31］。

但本研究仍存在一些不足之處，如：①洋金花治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎作用途徑間的交互影響機(jī)制及其是否通過影響關(guān)聯(lián)的非編碼長(zhǎng)鏈RNA 或微小RNA等微介質(zhì)成分的調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步研究；②洋金花的活性成分（槲皮素、山柰酚、東莨菪堿等）治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的深層次效用機(jī)制及有效成分間的聯(lián)合應(yīng)用研究亦需要進(jìn)一步探討。