巨噬細(xì)胞在脊髓損傷后自我修復(fù)中的作用及其治療應(yīng)用進展

林俊卿，鄭憲友，鮑丙波，李星瑋，高 濤，黃騰立

上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院骨科，上海200233

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是骨科臨床上常見的一種創(chuàng)傷性疾病，由于脊髓的完整性及連續(xù)性受到外力破壞而導(dǎo)致機體感覺、運動及自主神經(jīng)障礙。據(jù)統(tǒng)計，世界范圍內(nèi)共有超過2 000萬的患者正遭受著脊髓損傷所帶來的痛苦，并以每年約70萬人的速度增長[1]。相關(guān)研究[2-3]報道，我國有超過100萬患者正遭受著脊髓損傷疾病的困擾，并以每年1萬～6萬人的速度增長。脊髓損傷的“三高一低”（高發(fā)病率、高致殘率、高耗費及低齡化）特點，給整個社會帶來了巨大的負(fù)擔(dān)。脊髓損傷后的炎癥反應(yīng)是損傷修復(fù)過程中的第一步，大量關(guān)于創(chuàng)面愈合的研究對炎癥在傷口愈合中的作用進行了詳細(xì)闡述，明確了巨噬細(xì)胞在創(chuàng)面修復(fù)中發(fā)揮的關(guān)鍵作用[4]。同時也有大量的研究對巨噬細(xì)胞在脊髓損傷中的作用進行探討，并提出了通過對不同種類巨噬細(xì)胞的干預(yù)，以緩解炎癥從而促進脊髓損傷修復(fù)的觀點[5]。本文總結(jié)了不同種類的巨噬細(xì)胞在脊髓損傷后自我修復(fù)過程中發(fā)揮的作用及機制，并對目前通過干預(yù)巨噬細(xì)胞治療脊髓損傷的最新進展進行綜述。

1 參與脊髓損傷后自我修復(fù)中的巨噬細(xì)胞種類及其作用機制

脊髓損傷后隨即出現(xiàn)大量的炎癥細(xì)胞浸潤，其中巨噬細(xì)胞為炎癥反應(yīng)中關(guān)鍵細(xì)胞之一。巨噬細(xì)胞往往在SCI后的1 d開始浸潤，7 d時達到頂峰并持續(xù)存在。不同的巨噬細(xì)胞在脊髓損傷過程中的作用不盡相同[5]。

1.1 M1型巨噬細(xì)胞

M1型巨噬細(xì)胞是一種巨噬細(xì)胞亞型，又稱為經(jīng)典活化型巨噬細(xì)胞，主要通過吞噬死亡細(xì)胞或組織碎片，并釋放大量炎癥因子募集更多炎癥細(xì)胞局部浸潤而發(fā)揮作用[6]。單核細(xì)胞經(jīng)過脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）及干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）刺激能夠從M0型巨噬細(xì)胞極化為分化抗原68 （cluster of differentiation 68，CD68）、組織相容性復(fù)合體Ⅱ（major histocompatibility complex Ⅱ，MHCⅡ）及CD80特異性標(biāo)記M1型巨噬細(xì)胞[7]。位于損傷部位脊髓組織中的膠質(zhì)細(xì)胞（少突膠質(zhì)細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞等）在早期便開始活化，隨后釋放大量的細(xì)胞因子及趨化因子。12～24 h內(nèi)，中性粒細(xì)胞第一時間向損傷部位募集，其釋放的大量細(xì)胞因子進一步加劇血脊髓屏障的破壞，使得M1型巨噬細(xì)胞不斷向損傷中心募集浸潤[8]。浸潤的M1型巨噬細(xì)胞在損傷部位吞噬大量的髓鞘碎片及崩解的神經(jīng)元細(xì)胞。Burda等[9]認(rèn)為，炎癥反應(yīng)在脊髓損傷中具有兩面性，過多的M1型巨噬細(xì)胞作用會使損傷周圍環(huán)境紊亂，進一步加劇脊髓的損傷，但M1型巨噬細(xì)胞作用過少會導(dǎo)致壞死組織堆積過多，這同樣不利于損傷脊髓的修復(fù)。因此在脊髓損傷的早期階段，M1型巨噬細(xì)胞的作用在一定程度上有利于局部損傷組織的康復(fù)。這一觀點也在皮膚創(chuàng)面愈合中得以驗證[10]。在創(chuàng)面愈合過程中，M1型巨噬細(xì)胞在浸潤后的1～3 d開始逐漸減少，炎癥反應(yīng)隨之減弱。但在脊髓損傷后，組織中的M1型巨噬細(xì)胞遲遲不能得以清除。在急性期、亞急性期甚至是慢性期依舊會有M1型巨噬細(xì)胞浸潤[11]。M1型巨噬細(xì)胞長期浸潤引起的持久炎癥反應(yīng)可能是導(dǎo)致脊髓損傷后無法完全修復(fù)的機制之一。

脊髓損傷后，M1型巨噬細(xì)胞吞噬壞死物質(zhì)并刺激核因子活化B細(xì)胞κ輕鏈增強子（nuclear factor kappalight-chain-enhancer of activated B cells，NF-κB）、 信 號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活蛋白1（signal transducer and activator of transcription 1，STAT1）及干擾素調(diào)節(jié)因子5（interferon regulatory 5，IRF5）等信號通路，活化并釋放大量的白介素 6（interleukin 6，IL-6）、白介素 1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor，TNF-α）及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）等炎癥因子，進一步加重炎癥細(xì)胞募集。TNF-α作為M1型巨噬細(xì)胞在脊髓損傷后分泌的主要細(xì)胞因子，通過激活NF-κB加劇炎癥反應(yīng)，同時使周圍細(xì)胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)表達上調(diào)并誘導(dǎo)周圍細(xì)胞發(fā)生凋亡，不利于受損脊髓組織修復(fù)[12]。由于TNF-α的大量分泌，蛋白酶體的清除增加，NF-κB通路的激活，導(dǎo)致iNOS釋放增加[13]。iNOS具有影響神經(jīng)細(xì)胞活性的作用并進一步加劇炎癥因子的富集，如多米諾骨牌式造成脊髓損傷后的“炎癥瀑布”效應(yīng)，對周圍未受損的脊髓組織帶來巨大的損傷。此外，M1型巨噬細(xì)胞還能釋放IL-1β等炎癥因子，同時具有激活Th1細(xì)胞的作用從多方面加重脊髓損傷后的細(xì)胞損傷，不利于組織的恢復(fù)。總之，M1型巨噬細(xì)胞在脊髓損傷早期，雖發(fā)揮了清除壞死組織的作用，但卻引起“炎癥瀑布”效應(yīng)，致使更多的組織出現(xiàn)損傷，因此減少M1型巨噬細(xì)胞的浸潤或許是今后通過干預(yù)免疫來治療脊髓損傷的方式之一。

1.2 M2型巨噬細(xì)胞

M2型巨噬細(xì)胞為巨噬細(xì)胞另一種亞型，又被稱為抗炎型巨噬細(xì)胞，在組織損傷后其能夠向M2a、M2b及M2c型巨噬細(xì)胞極化。不同亞型的M2型巨噬細(xì)胞在脊髓損傷過程中發(fā)揮其獨特的作用。

1.2.1 M2a型巨噬細(xì)胞 M2a型巨噬細(xì)胞是一種高水平表達精氨酸酶1（arginase 1，Arg-1）及Ym1的M2型巨噬細(xì)胞亞型，IL-4及IL-13能夠誘導(dǎo)單核細(xì)胞極化形成M2a型巨噬細(xì)胞[14]。脊髓損傷后伴隨血脊髓屏障的破壞，大量骨髓來源的單核細(xì)胞募集到損傷區(qū)域形成M1型巨噬細(xì)胞。Kigerl等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，在脊髓損傷修復(fù)中，M1型巨噬細(xì)胞的大量浸潤往往伴隨著M2a型巨噬細(xì)胞浸潤。Gensel等[5]證實此現(xiàn)象也同樣發(fā)生于創(chuàng)面修復(fù)中。該種巨噬細(xì)胞能夠通過分泌Arg-1及髓系細(xì)胞表面觸發(fā)受體 2（triggering receptor expressed on myeloid cells 2，TREM2）等因子控制局部炎癥反應(yīng)，分泌胰島素樣生長因子1（insulin-like growth factor，IGF-1）及轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF-β）等生長因子促進局部組織生長。此外其還具有穩(wěn)定局部血管及促進膠原沉積的作用[16]。M2a型巨噬細(xì)胞在創(chuàng)面愈合及脊髓損傷的過程中都起著抗炎的作用，同時該類細(xì)胞在創(chuàng)面及脊髓損傷的愈合中具有啟動損傷部位修復(fù)的能力。但目前損傷脊髓組織中的M2a型巨噬細(xì)胞來源依舊不明確。新近研究認(rèn)為M2a型巨噬細(xì)胞可能由M1型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來。Ghosh等[17]的研究中發(fā)現(xiàn)在脊髓損傷中，cAMP及IL-4在M1向M2a型巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)化中起到關(guān)鍵作用，聯(lián)合使用2種細(xì)胞因子進行刺激能夠很好地使M1型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為M2a型巨噬細(xì)胞。M2a型巨噬細(xì)胞在SCI中如來源、作用機制等問題目前還未能得到深入闡明。

1.2.2 M2b型巨噬細(xì)胞 M2b型巨噬細(xì)胞是以釋放大量的IL-10為特征的一種M2型巨噬細(xì)胞亞型，又稱為調(diào)節(jié)型巨噬細(xì)胞，通過刺激Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）使M0型巨噬細(xì)胞向M2b型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化。在組織修復(fù)的過程中，M2b型巨噬細(xì)胞作為修復(fù)期主要的巨噬細(xì)胞類型，通過釋放大量的IL-10抵制組織炎癥反應(yīng)以起到組織修復(fù)的作用。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后IL-10的表達在3 d后開始下降，并在7 d時到達低谷。而Novak等[18]認(rèn)為，在創(chuàng)面愈合后的第7日IL-10的表達水平達到最高峰值。2種研究結(jié)果的差異說明脊髓損傷后M2b型巨噬細(xì)胞較少活化，這或許是導(dǎo)致?lián)p傷組織不能順利修復(fù)的又一原因。

1.2.3 M2c型巨噬細(xì)胞 M2c型巨噬細(xì)胞為M2型巨噬細(xì)胞的一種亞型，作為組織重塑期中重要的細(xì)胞之一，具有TGF-β分泌增加、CD206表達上升及Arg-1表達下降的特征。在組織損傷過程中，M2c型巨噬細(xì)胞通過釋放基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase-8，MMP8）、多功能蛋白聚糖（polyclonal antibody to versican，VCAN）及TGF-β等因子促進局部組織重塑及增殖以達到組織修復(fù)的目的[19]。目前M2c型巨噬細(xì)胞在脊髓損傷中的報道較少，其是否具有與創(chuàng)面愈合類似的作用，有待進一步深入研究。

M2型巨噬細(xì)胞在脊髓損傷的過程中，由于種種原因，不易從單核細(xì)胞或M1型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化形成，阻礙了損傷部位脊髓從炎癥期順利過渡到修復(fù)期。雖目前部分研究認(rèn)為在脊髓損傷后的3d內(nèi)會有M2型巨噬細(xì)胞出現(xiàn)[5]，但具體其在脊髓損傷后充當(dāng)何種作用仍舊未知。因此，對于M2型巨噬細(xì)胞在脊髓損傷修復(fù)中的作用有待進一步研究闡明。

2 對巨噬細(xì)胞進行干預(yù)治療脊髓損傷

巨噬細(xì)胞作為參與脊髓損傷修復(fù)的重要細(xì)胞類型之一，發(fā)揮了其清除壞死物質(zhì)、促進組織修復(fù)的作用。但在SCI的自我修復(fù)中，M1型的巨噬細(xì)胞更多地引起脊髓二次損傷，阻礙脊髓的自我修復(fù)。同時，M2型巨噬細(xì)胞雖具有抗炎作用，但由于活化數(shù)量過少，其抗炎作用未能在SCI自我修復(fù)過程中得以體現(xiàn)。因此，如何抑制脊髓損傷后M1型巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，同時促進M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量的增多，有望成為治療脊髓損傷新的突破點。

2.1 抑制M1型巨噬細(xì)胞的增殖及分化

脊髓損傷急性期，損傷部位浸潤的巨噬細(xì)胞絕大多數(shù)為M1型巨噬細(xì)胞[15]。M1型巨噬細(xì)胞為導(dǎo)致脊髓損傷炎癥反應(yīng)的核心細(xì)胞。諸多研究[20]認(rèn)為，通過抑制M1型巨噬細(xì)胞增殖及分化是潛在抑制急性期炎癥反應(yīng)方法。巨噬細(xì)胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF）具有促進巨噬細(xì)胞的增殖及分化的作用。目前認(rèn)為通過干預(yù)M-CSF受體能夠抑制巨噬細(xì)胞的增殖，并阻礙“炎癥瀑布”效應(yīng)的發(fā)生，促進脊髓損傷的修復(fù)。但目前有研究[21-22]認(rèn)為M-CSF具有一定的神經(jīng)保護作用，阻斷M-CSF后可能會對帕金森病、阿爾茨海默病等神經(jīng)病理性疾病產(chǎn)生一定的影響。因此還需更多的研究對阻斷M-CSF作用后抑制巨噬細(xì)胞增殖及分化、改善脊髓損傷后炎癥反應(yīng)進行驗證。

2.2 抑制M1型巨噬細(xì)胞活化通路

M1型巨噬細(xì)胞在脊髓損傷后，通過分泌大量的TNF-α及IL-1β等促炎因子，局部炎癥反應(yīng)進一步惡化并導(dǎo)致嚴(yán)重的“炎癥瀑布”效應(yīng)。因此通過抑制巨噬細(xì)胞分泌的炎癥因子，影響巨噬細(xì)胞活化通路，可起到抗炎作用。Peng等[23]及Khalatbary等[24]的研究認(rèn)為在不同的動物模型中，阻斷巨噬細(xì)胞分泌TNF-α有不同的效果，但在SCI后拮抗TNF-α能夠顯著改善脊髓損傷模型的預(yù)后。SCI后，TNF-α的表達在短時間內(nèi)出現(xiàn)升高。Vidal等[25]的研究顯示，延遲使用TNF-α拮抗劑對脊髓損傷后的修復(fù)并無作用。因此對TNF-α的干預(yù)應(yīng)盡可能快地在脊髓損傷發(fā)生后進行[26]。除了直接采用拮抗劑阻斷TNF-α外，還有其他方法包括減弱TNF-α的活性、阻斷TNF-α靶向受體等方式來抑制M1型巨噬細(xì)胞活化通路。此外還能通過阻斷IL-1β、iNOS等的促炎癥作用，或通過抑制NF-κB活性等方式以抑制M1型巨噬細(xì)胞活化通路從而降低炎癥反應(yīng)。

2.3 促進損傷區(qū)域M2型巨噬細(xì)胞的浸潤

脊髓損傷后，大量的M1型巨噬細(xì)胞在損傷部位浸潤。由于脊髓的特殊性，M1型巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化出現(xiàn)障礙，以此導(dǎo)致?lián)p傷區(qū)域的M1型巨噬細(xì)胞浸潤增加，炎癥因子不斷分泌，并影響組織再生。諸多研究報道，M2型巨噬細(xì)胞在創(chuàng)面中起到促修復(fù)及重塑作用，但在脊髓損傷中M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量較少、作用較弱，這或許是脊髓損傷不完全修復(fù)的原因之一。因此增加M2型巨噬細(xì)胞的數(shù)量有望成為脊髓損傷修復(fù)治療的方法之一。

2.3.1 過氧化物酶體增殖激活受體-γ的作用 過氧化物酶體增殖激活受體-γ（peroxisome proliferater-activated receptor γ，PPAR-γ）與巨噬細(xì)胞膽固醇穩(wěn)態(tài)及炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。目前的研究認(rèn)為激活PPAR-γ可用于治療炎癥性疾病，包括酒精性肝病及炎性腸病等[27-29]。研究證實，在脊髓損傷患者中使用PPAR-γ激動劑（如羅格列酮等）在體內(nèi)及體外均發(fā)揮了神經(jīng)保護作用。Bouhlel等[30]認(rèn)為其保護作用可能是通過將M1型巨噬細(xì)胞向抗炎型M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)換實現(xiàn)，同時其還具有促進外周血單核細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用。Li等[31]研究者卻認(rèn)為，PPAR-γ激動劑在脊髓損傷的治療中很可能是通過減少自噬而起到對神經(jīng)的保護作用。此外，PPAR-γ激動劑還具有穩(wěn)定脊髓損傷后線粒體的功能而起到對神經(jīng)的保護作用[32]。PPAR-γ是否能夠通過增加M2型巨噬細(xì)胞的浸潤起到神經(jīng)保護作用尚有待深入研究。

2.3.2 干細(xì)胞治療 干細(xì)胞治療成為目前SCI治療的重要方向之一。大量的關(guān)于干細(xì)胞運用于治療脊髓損傷的研究結(jié)果顯示，干細(xì)胞治療后能夠有效地恢復(fù)脊髓損傷后的運動及感覺功能。Zhang等[33]研究認(rèn)為，間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有使得單核細(xì)胞極化為M2型巨噬細(xì)胞的能力從而起到抑制炎癥并促進創(chuàng)面愈合的作用。Nakajima等[34]的研究顯示，MSCs治療組中，損傷部位M2型巨噬細(xì)胞增多，M1型巨噬細(xì)胞減少，這一現(xiàn)象與脊髓損傷后運動功能的恢復(fù)密切相關(guān)。除MSCs外，神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）也被運用于脊髓損傷的治療。研究表明，向損傷部位使用NSCs治療后能夠減少損傷部位M1型巨噬細(xì)胞的浸潤及TNF-α等炎癥因子的釋放；此外通過改善局部微環(huán)境使得更多的M2型巨噬細(xì)胞浸潤，以達到促進軸突出芽、功能恢復(fù)的目的[35-36]。干細(xì)胞外泌體近年來成為研究的熱點內(nèi)容之一。在脊髓損傷后，Sun等[37]將臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體用于脊髓損傷治療后發(fā)現(xiàn)，其能促進骨髓來源的M1型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為M2型巨噬細(xì)胞，此外還能下調(diào)如TNF-α等炎癥因子的作用，從而達到促進脊髓損傷修復(fù)的目的。雖然干細(xì)胞及其外泌體在實驗研究過程中都顯示了其對脊髓損傷的治療作用是通過促進M2型巨噬細(xì)胞浸潤而實現(xiàn)的，但將其向臨床轉(zhuǎn)化仍有很長一段路要走，需要通過多方面的研究驗證干細(xì)胞及其外泌體的安全性及有效性方可實現(xiàn)向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化。

2.3.3 相關(guān)炎癥因子的干預(yù) Bao等[38]的相關(guān)研究表明，脊髓損傷后，將IL-7受體阻斷后能夠調(diào)節(jié)Th1及Th2細(xì)胞的活性從而有利于巨噬細(xì)胞向M2型極化，并以此改善脊髓損傷后的功能。此外，將IL-6信號進行阻斷后，能夠在脊髓損傷后抑制M1型巨噬細(xì)胞活性，并促進M2型巨噬細(xì)胞激活，以達到減弱炎癥反應(yīng)并促進神經(jīng)功能恢復(fù)[36]的作用。研究顯示，使用胍丁胺能夠使得損傷局部IL-10表達的上升，以此降低損傷部位的M1型巨噬細(xì)胞，并促進M2型巨噬細(xì)胞浸潤，起到對脊髓損傷的修復(fù)[39]。

2.4 損傷部位移植M2型巨噬細(xì)胞

針對局部M2型巨噬細(xì)胞浸潤較少的問題，諸多研究者對向脊髓損傷部位移植特定的M2型巨噬細(xì)胞是否有助于改善損傷后的脊髓功能及形態(tài)恢復(fù)這一問題進行探索。Ma等[40]在體外將骨髓來源的巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)為M2型巨噬細(xì)胞輸注回體內(nèi)后發(fā)現(xiàn)其能夠減少脊髓損傷的病灶大小，同時起到促進軸突髓鞘化及保護神經(jīng)元的作用。此外Shechter等[41]的研究證明，M2型巨噬細(xì)胞的募集來源于血腦脊液屏障及脈絡(luò)膜。腦脊液及脈絡(luò)膜維持了M2型巨噬細(xì)胞的抗炎作用，通過向腦室內(nèi)直接注射CD115單核細(xì)胞能夠減小脊髓損傷病灶，并促進損傷后神經(jīng)康復(fù)。該項研究為脊髓損傷后巨噬細(xì)胞移植提供了新的思路。但目前的研究并不完全支持移植M2型巨噬細(xì)胞具有促進脊髓損傷修復(fù)作用這一觀點。Ren等[42]使用IL-4在體外誘導(dǎo)M2a型巨噬細(xì)胞后注入脊髓損傷部位，脊髓損傷后的運動及感覺功能并未恢復(fù)。因此移植M2型巨噬細(xì)胞是否能夠治療脊髓損傷有待進一步研究。

3 小結(jié)

巨噬細(xì)胞在脊髓損傷后的炎癥反應(yīng)中作為核心細(xì)胞起到了關(guān)鍵作用。不同種類的巨噬細(xì)胞在SCI中的功能不盡相同。目前的研究對巨噬細(xì)胞在脊髓損傷后的組成并沒有完全闡明，M2型巨噬細(xì)胞在脊髓損傷中的來源、組成及作用也并未能得以完全揭示。此外，大量的研究通過干預(yù)巨噬細(xì)胞后起到了恢復(fù)脊髓損傷后神經(jīng)功能作用，說明干預(yù)巨噬細(xì)胞可能成為潛在的治療脊髓損傷修復(fù)的方法。通過對巨噬細(xì)胞在脊髓損傷修復(fù)中的作用的深入了解，可望為脊髓損傷的治療帶來新的契機。