非擴(kuò)增性干細(xì)胞治療理念的形成及其應(yīng)用前景

戴尅戎

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院骨科，上海 200011

非擴(kuò)增性干細(xì)胞治療技術(shù)是通過(guò)非體外培養(yǎng)、非細(xì)胞增殖的方式，從組織或組織液中直接獲取干細(xì)胞，通過(guò)物理方式或依靠細(xì)胞本身的特性濃縮聚集干細(xì)胞（如離心、富集等），直接應(yīng)用或與材料混合后回植患者體內(nèi)，進(jìn)行細(xì)胞治療。該類(lèi)技術(shù)具有耗時(shí)短、污染可能性小、倫理問(wèn)題少等優(yōu)勢(shì)。其中，利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞本身黏附特性的干細(xì)胞篩選-富集-復(fù)合循環(huán)系統(tǒng)[screen-enrich-combine（-biomaterials） circulating system，SECCS]作為一種非擴(kuò)增性干細(xì)胞治療技術(shù)，已經(jīng)用于230 余例臨床的骨修復(fù)病例，療效滿意[1-4]。

自20 世紀(jì)下葉起，人體干細(xì)胞的研究和應(yīng)用逐步成為熱點(diǎn)，干細(xì)胞多能性和無(wú)限增殖能力備受關(guān)注，特別是多能干細(xì)胞應(yīng)用技術(shù)越來(lái)越多地受到相關(guān)科學(xué)家和臨床醫(yī)生的重視，被認(rèn)為具有巨大的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用潛力。干細(xì)胞可望治療多種疾病，在組織再生和延緩衰老方面將發(fā)揮重要作用，是一種可以改變現(xiàn)代治療模式的新型技術(shù)，可以帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)貢獻(xiàn)。1999 年，Science 雜志將人類(lèi)胚胎干細(xì)胞研究成果評(píng)為當(dāng)年世界十大科技進(jìn)展之首。但是，近20 年來(lái)，干細(xì)胞的應(yīng)用研究發(fā)展并未加速。其中一個(gè)重要因素是倫理問(wèn)題。胚胎干細(xì)胞等相關(guān)的核轉(zhuǎn)移技術(shù)涉及人源性祖細(xì)胞，受到廣泛質(zhì)疑甚至反對(duì)。相對(duì)而言，成體干細(xì)胞的應(yīng)用獲得多數(shù)學(xué)者的認(rèn)可。但這同時(shí)也存在一些難以回避的問(wèn)題。傳統(tǒng)技術(shù)通過(guò)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)、誘導(dǎo)，從而得到有效數(shù)量的干細(xì)胞，這通常需要在分離干細(xì)胞之后通過(guò)體外培養(yǎng)以擴(kuò)增干細(xì)胞數(shù)量。但體外培養(yǎng)過(guò)程時(shí)間久、操作繁瑣，并且存在干細(xì)胞干性下降、污染等一系列問(wèn)題。更重要的是，體外培養(yǎng)擴(kuò)增往往需要使用動(dòng)物血清，或受到不良的理化因素影響而出現(xiàn)非二倍體的細(xì)胞。因此，在應(yīng)用上一直受到倫理學(xué)限制。

細(xì)胞治療實(shí)質(zhì)上是通過(guò)將某些特定細(xì)胞輸注患者體內(nèi)，通過(guò)歸巢效應(yīng)，或直接植入特定區(qū)域，利用細(xì)胞特性形成組織、修復(fù)器官，以治療相關(guān)的臨床疾病。21 世紀(jì)以來(lái)，隨著人們對(duì)細(xì)胞研究的深入，細(xì)胞治療也不斷發(fā)展。目前，細(xì)胞治療已開(kāi)始應(yīng)用于不少臨床領(lǐng)域，如利用嵌合抗原受體T 細(xì)胞療法（chimeric antigen receptor T cell therapy，CAR-T）治療急性淋巴細(xì)胞白血病和淋巴瘤[5]，應(yīng)用胰島細(xì)胞移植治療1 型糖尿病，應(yīng)用角膜緣干細(xì)胞移植修復(fù)角膜，應(yīng)用神經(jīng)干細(xì)胞移植治療腦外傷和帕金森病，應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)骨軟骨再生修復(fù)長(zhǎng)節(jié)段骨缺損，應(yīng)用施萬(wàn)（Schwann）細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞或祖細(xì)胞、嗅鞘細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞或間充質(zhì)干細(xì)胞治療脊髓損傷[6]等。而人類(lèi)多能干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)更是有望從根本上重塑再生醫(yī)學(xué)和人類(lèi)對(duì)復(fù)雜疾病的研究，目前已開(kāi)展多項(xiàng)有關(guān)人誘導(dǎo)多向潛能干細(xì)胞的相關(guān)臨床試驗(yàn)[7]。

傳統(tǒng)干細(xì)胞治療技術(shù)包括樣本采集，干細(xì)胞分離、培養(yǎng)、移植等過(guò)程。而通過(guò)干細(xì)胞分離得到的干細(xì)胞數(shù)量往往較少，因此需要體外培養(yǎng)擴(kuò)增以獲得足量細(xì)胞數(shù)。利用Ficoll 或Percoll 等分離液的密度梯度離心法，是實(shí)驗(yàn)室常用的從骨髓血中分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞（包含骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞）的方法。研究人員應(yīng)用該方法分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞并用于臨床研究[8]。而為了得到足量的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，則需進(jìn)一步通過(guò)體外培養(yǎng)。這時(shí)除了上述細(xì)胞體外培養(yǎng)的常見(jiàn)問(wèn)題外，密度梯度離心所需的分離液等相關(guān)試劑毒性，也成為干細(xì)胞治療過(guò)程中的阻礙。因此，如何規(guī)避這些繁瑣步驟，直接獲得足夠數(shù)量的干細(xì)胞用于臨床治療，成為細(xì)胞治療向前發(fā)展的重要挑戰(zhàn)之一，這也正是發(fā)展非擴(kuò)增性干細(xì)胞治療技術(shù)的由來(lái)。

離心技術(shù)是細(xì)胞治療最常用的一種非擴(kuò)增性方式。獲取的組織或組織液，通過(guò)離心濃縮富集獲得組織中的干細(xì)胞成分，但往往還混有一些其他細(xì)胞。如直接一起應(yīng)用，有時(shí)也起到一定的相輔相成作用[2]。離心分離是最早期常用的非體外培養(yǎng)干細(xì)胞富集技術(shù)。離心技術(shù)包括差速離心和密度梯度離心。差速離心根據(jù)大小不同的細(xì)胞在同一介質(zhì)中沉降所需流速不同以分離不同的細(xì)胞。一般適用于分離大小懸殊的細(xì)胞。而密度梯度離心則是借助離心力作用形成一系列連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度不同的細(xì)胞分層，以達(dá)到分離細(xì)胞的目的；如COBE 2991（美國(guó)Gambro BCT公司）或Celution 系統(tǒng)（美國(guó)Cytori 公司）正是通過(guò)此原理實(shí)現(xiàn)對(duì)血液或脂肪組織液中干細(xì)胞的分離，而不需要體外培養(yǎng)[9]。但通過(guò)離心技術(shù)很難實(shí)現(xiàn)干細(xì)胞的精準(zhǔn) 分離。

免疫磁珠分選技術(shù)是一種新興技術(shù)。免疫技術(shù)的發(fā)展也為非體外培養(yǎng)干細(xì)胞治療技術(shù)帶來(lái)了新思路。通過(guò)免疫磁珠標(biāo)記具有特異性表面分子的細(xì)胞，如標(biāo)記CD34或CD133 陽(yáng)性的細(xì)胞，再通過(guò)磁場(chǎng)中磁力的作用，將標(biāo)有免疫磁珠的細(xì)胞（陽(yáng)性細(xì)胞）或未能標(biāo)記的細(xì)胞（陰性細(xì)胞）篩選出來(lái)。CliniMACs 系統(tǒng)（德國(guó)Miltenyi 公司）就是利用該原理設(shè)計(jì)出的細(xì)胞分離裝置。目前已有相關(guān)臨床研究，通過(guò)該方法篩選干細(xì)胞治療心肌梗死[10-11]。CliniMACs 系統(tǒng)在歐洲一些國(guó)家也已用于臨床，但應(yīng)用“陽(yáng)性”選擇在分離外周血中造血干細(xì)胞時(shí)，CD34 細(xì)胞復(fù)原率較低，僅為60%。美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（NIH）輸血醫(yī)學(xué)部細(xì)胞加工實(shí)驗(yàn)室使用抗AC133 的抗體來(lái)篩選造血干細(xì)胞，抗AC133 抗體選擇的造血干細(xì)胞與抗CD34 抗體選擇的細(xì)胞群仍存在部分差異，目前尚有許多問(wèn)題處于研究階段[12]。

SECCS，或稱非擴(kuò)增性干細(xì)胞富集技術(shù)，是利用干細(xì)胞的黏附特性，將骨髓血循環(huán)過(guò)濾于多孔生物材料上，達(dá)到篩選干細(xì)胞并富集-復(fù)合于生物材料，隨后回植體內(nèi)達(dá)到修復(fù)骨缺損的目的。目前，我們利用該方法已完成相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及人體體外實(shí)驗(yàn)[2-3]，隨即在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院和上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院進(jìn)行了相關(guān)人體體內(nèi)臨床研究[4,13-14]，通過(guò)對(duì)過(guò)濾前后細(xì)胞特性的分析發(fā)現(xiàn)，過(guò)濾富集過(guò)程并不會(huì)影響細(xì)胞的凋亡和增殖能力，具有良好的生物安全性。該技術(shù)已獲得10 余項(xiàng)國(guó)家專(zhuān)利，具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)，可在手術(shù)同期完成骨髓干細(xì)胞采集-篩選-富集-復(fù)合生物材料的制備，干細(xì)胞數(shù)量足以滿足質(zhì)量需求，術(shù)中直接回植，無(wú)需體外培養(yǎng)。避免了體外長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)、易污染、使用異種血清及相關(guān)倫理學(xué)問(wèn)題，臨床療效滿意。目前已應(yīng)用治療230 多例骨不連、骨缺損、新鮮骨折骨缺損、股骨頭壞死、脊柱關(guān)節(jié)融合、距骨骨軟骨損傷、良性骨腫瘤切除后的骨修復(fù)等需要骨再生的患者[15-16]，結(jié)果提示該方法制備的生物活性材料，其骨修復(fù)結(jié)果不遜于“金標(biāo)準(zhǔn)”自體骨移植的骨修復(fù)療效，總體有效率達(dá)到95%。

展望干細(xì)胞研究與應(yīng)用的發(fā)展，體外培養(yǎng)干細(xì)胞治療技術(shù)仍是干細(xì)胞治療的主要方式。非擴(kuò)增干細(xì)胞治療技術(shù)所形成的理念是一種新興技術(shù)思路，目前采用這類(lèi)技術(shù)進(jìn)行臨床研究或臨床治療的報(bào)道數(shù)量還不多。而隨著對(duì)干細(xì)胞研究的深入，非體外培養(yǎng)干細(xì)胞治療技術(shù)憑借其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)必將在干細(xì)胞治療中獲得一席之地，成為干細(xì)胞治療的有效方式之一。非擴(kuò)增干細(xì)胞治療技術(shù)直接或間接地通過(guò)增加干細(xì)胞分離過(guò)程中得到的干細(xì)胞數(shù)量，省去干細(xì)胞體外培養(yǎng)擴(kuò)增的步驟，從而極大程度地降低干細(xì)胞治療技術(shù)的難度，提高了干細(xì)胞治療的安全性，規(guī)避了相關(guān)倫理學(xué)的問(wèn)題，其應(yīng)用范圍顯然不僅僅限于骨科。隨著細(xì)胞分離技術(shù)的發(fā)展，新興干細(xì)胞分離技術(shù)，如微流控技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)、吸附技術(shù)、過(guò)濾富集技術(shù)等，也將成為非體外培養(yǎng)干細(xì)胞治療技術(shù)的一部分，甚至可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的精確分離和定量分離，根據(jù)疾病需要，針對(duì)性進(jìn)行細(xì)胞治療，達(dá)到經(jīng)濟(jì)、有效的治療效果。

參·考·文·獻(xiàn)

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