水產(chǎn)源產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的分離、篩選及鑒定

高 欣 ， 劉 穎 ， 劉凡湘 ， 王 洋 ，2*， 王競(jìng)?cè)?， 羅云龍 ， 白東清 ，2

（1.天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，天津 300384；2.天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384）

我國(guó)水產(chǎn)動(dòng)物的養(yǎng)殖以高密度或超高密度為主，這種養(yǎng)殖模式下水產(chǎn)動(dòng)物易患細(xì)菌性疾?。⊿undberg 等，2016；Pulkkinen 等，2009）。 抗生素類(lèi)藥物是治療細(xì)菌性疾病的有效方式，但易引起耐藥性、藥物殘留、抑制免疫系統(tǒng)等問(wèn)題（Liu，2017；Cabello，2006）。 我國(guó)自 2020 年 1 月1日起，退出除中藥外的所有促生長(zhǎng)類(lèi)藥物飼料添加劑品種（申桂英，2019）。微生態(tài)制劑具有拮抗病原微生物的能力，有作為抗生素替代品的潛力（Seyed 等，2018；張家國(guó)等，2014）。 微生態(tài)制劑中的乳酸菌可黏附（Li等，2018）或定植于水產(chǎn)動(dòng)物腸道（Iehata 等，2009；王玉堂，2009），調(diào)節(jié)宿主免疫功能（Nayak，2010），促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用，還能產(chǎn)生細(xì)菌素、有機(jī)酸、過(guò)氧化氫等物質(zhì)，可以有效抑制病原菌的生長(zhǎng)，從而綜合地起到促生長(zhǎng)和防病的作用（Zorriehzahra等，2016； 李桂英等，2013）。 乳酸菌細(xì)菌素（Bacteriocions）是乳酸菌分泌的一類(lèi)具有抑菌作用的蛋白質(zhì)或多肽，對(duì)多種病原菌有顯著作用，且不易被胃蛋白酶降解，安全性高，因此細(xì)菌素及其產(chǎn)生菌在食品工業(yè)和食用動(dòng)物生產(chǎn)領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景 （O’connor等，2020；Nuria等，2019 ；Moraě canin等，2012）。近年來(lái)，細(xì)菌素產(chǎn)生菌在水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖中備受青睞。有報(bào)道已證實(shí)產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌對(duì)于水產(chǎn)病原菌具有更好地控制力（Sahoo 等，2014；張之文等，2006）。 有學(xué)者分析了水產(chǎn)環(huán)境乳酸菌的產(chǎn)細(xì)菌素潛力，認(rèn)為在水產(chǎn)環(huán)境中，自然存在大量產(chǎn)細(xì)菌素菌株資源（Rather等，2017）。我國(guó)發(fā)布的新版水產(chǎn)動(dòng)物飼用乳酸菌篩選標(biāo)準(zhǔn)（T/CSWSL 016-2019）團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，菌株來(lái)自水產(chǎn)動(dòng)物腸道或養(yǎng)殖水體環(huán)境中，或已被批準(zhǔn)使用。因此從水產(chǎn)環(huán)境中分離產(chǎn)細(xì)菌素的菌株，將更有潛力開(kāi)發(fā)為能夠在水產(chǎn)養(yǎng)殖中替代抗生素的生物制劑，此類(lèi)研究也必將成為抗生素替代的一大研究熱點(diǎn)。

本研究擬從天津地區(qū)的水產(chǎn)動(dòng)物糞便及其養(yǎng)殖環(huán)境中分離適合應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌菌株，對(duì)其進(jìn)行鑒定，為水產(chǎn)養(yǎng)殖中抗生素替代性乳酸菌的開(kāi)發(fā)利用提供新思路。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株和試劑 細(xì)菌素敏感型指示菌—清酒乳桿菌（Lactobacillus sakei），植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）保存于天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院。該菌株耐酸且對(duì)I類(lèi)細(xì)菌素乳酸鏈球菌素nisin和IIa類(lèi)細(xì)菌素片球菌素PA-1敏感。MRS肉湯和MRS固體培養(yǎng)基，購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。過(guò)氧化氫酶和胃蛋白酶，購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。1 mol/L的氫氧化鈉溶液和1 mol/L的鹽酸溶液。

1.1.2 試驗(yàn)儀器設(shè)備 HS-1300-U超凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；MLS-3020高壓蒸汽滅菌鍋 （日本sanyan有限公司）；FA2104電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；YZB-GER 1841-2014高速冷凍離心機(jī)（賽默飛世爾科技有限公司）；BINDER-52生化培養(yǎng)箱（安靈）；BA210生物顯微鏡 （麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）；Thermofisher4MK2多功能酶標(biāo)儀。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌的分離純化 收集天津市西青區(qū)多個(gè)池塘水、底泥和魚(yú)、蝦糞便，取樣后低溫保存立即運(yùn)送回實(shí)驗(yàn)室。取適量樣品加入無(wú)菌生理鹽水中，充分振蕩使樣本中細(xì)菌懸出，進(jìn)行適當(dāng)稀釋后，取稀釋液以?xún)A注法制備含有0.05%碳酸鈣的MRS固體平板，30℃倒置培養(yǎng)24 h，無(wú)菌挑取有溶鈣圈的菌落加入液體MRS中培養(yǎng)12～24 h，待MRS液體懸濁后進(jìn)一步劃線(xiàn)純化挑取單菌落后備用。

1.2.2 產(chǎn)細(xì)菌素菌株初篩 將分離并純化的菌落于MRS液體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)24 h。離心（4℃，4025 g，15 min），收集上清液，上清液進(jìn)一步以0.22 μm濾器過(guò)濾得到無(wú)菌發(fā)酵液。取10 μL無(wú)菌發(fā)酵液，與90 μL含107cfu/mL指示菌（清酒乳桿菌和植物乳桿菌）的MRS混合，于96孔板中，培養(yǎng)12 h后測(cè)定OD600數(shù)值。以蒸餾水代替發(fā)酵液作為空白對(duì)照。初步篩選對(duì)指示菌有生長(zhǎng)抑制的乳酸菌。

1.2.3 有機(jī)酸排除試驗(yàn) 取抑菌試驗(yàn)中有抑菌效果的菌株，以氫氧化鈉將其發(fā)酵上清的pH中和至6.0后，按1.2.2步驟做抑菌試驗(yàn)，僅以清酒乳桿菌為指示菌，以未調(diào)pH的發(fā)酵上清為空白對(duì)照組，測(cè)定各樣品OD600數(shù)值。

1.2.4 過(guò)氧化氫排除試驗(yàn) 取經(jīng)過(guò)有機(jī)酸排除試驗(yàn)后依然有抑菌作用的菌株，以氫氧化鈉將其發(fā)酵上清的pH中和至6.0后，在各菌株上清液中加入過(guò)氧化氫酶（終濃度2 mg/mL），在 37℃水浴中溫育2 h，按1.2.2步驟做抑菌試驗(yàn)，僅以清酒乳桿菌為指示菌，以未加過(guò)氧化氫酶（但加入與過(guò)氧化氫酶等體積的生理鹽水）的排酸后發(fā)酵上清（pH=6）為空白對(duì)照組，測(cè)定各樣品OD600數(shù)值。

1.2.5 發(fā)酵上清對(duì)胃蛋白酶的敏感性 取經(jīng)有機(jī)酸、過(guò)氧化氫排除試驗(yàn)后仍有抑菌活性的菌株，以胃蛋白酶（終濃度2 mg/mL）作用1 h，作用時(shí)pH為2.0，作用后以氫氧化鈉溶液將pH調(diào)回至6.0。按1.2.2步驟做抑菌試驗(yàn)，僅以清酒乳桿菌為指示菌，以未加胃蛋白酶（但加入與胃蛋白酶等體積的生理鹽水）并經(jīng)過(guò)pH調(diào)節(jié)至2.0保溫1 h后調(diào)回至6.0的樣品作為空白對(duì)照組，測(cè)定各樣品OD600數(shù)值。

1.2.6 16S rDNA菌種鑒定 選取產(chǎn)細(xì)菌素且抑菌效果最好的菌株，提取DNA、擴(kuò)增并測(cè)定其16 S rDNA序列（DNA提取、目的片段擴(kuò)增純化和測(cè)序過(guò)程由生工生物工程（上海）有限公司完成）。菌株序列于NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行 BLAST序列比對(duì)，并通過(guò)MEGA 7.0軟件Neighnor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.7 抑菌物質(zhì)對(duì)溫度的耐受性 離心并過(guò)濾，以獲得鑒定菌株的無(wú)菌發(fā)酵上清液，以氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié) pH為6.0，分別在 60、80、100℃水浴、121℃（滅菌鍋濕熱）恒溫處理 30 min，以室溫水浴快速冷卻至常溫后，以清酒乳桿菌為指示菌，如1.2.2所述，測(cè)定各組樣品的OD600值。以未經(jīng)高溫處理菌株上清液為空白對(duì)照組，抑菌活性/%=不同溫度處理后菌株OD600值×100/對(duì)照組OD600值（未經(jīng)高溫處理菌株）。

表1 菌株來(lái)源

1.2.8 抑菌物質(zhì)對(duì)酸堿的耐受性 離心并過(guò)濾，以獲得鑒定菌株的無(wú)菌發(fā)酵上清液，分別以鹽酸和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié) pH 為 2.0、4.0、6.0、8.0、10.0，于25℃靜置處理1.5 h后，分別以鹽酸和氫氧化鈉溶液將pH調(diào)至6.0。如1.2.2所述，以清酒乳桿菌為指示菌，測(cè)定各組樣品的OD600值。以未經(jīng)酸堿處理菌株上清液為空白對(duì)照組，抑菌活性/%=酸堿處理后菌株OD600值×100/對(duì)照組OD600值（未經(jīng)酸堿處理菌株）。

1.3 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)利用Excel軟件計(jì)算得出各組數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差；利用ORIGIN 8.0軟件繪制柱狀圖及折線(xiàn)圖；利用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析（SNK，α=0.05或 0.01）。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，每次重復(fù)包含至少3個(gè)平行數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的分離與初步篩選 從天津市西青區(qū)多個(gè)池塘水、底泥和魚(yú)、蝦糞便中分離到產(chǎn)乳酸菌株261株。通過(guò)光密度法初步篩選出發(fā)酵上清液對(duì)清酒乳桿菌和植物乳桿菌有抑菌效果的菌株，其中31株菌對(duì)兩株指示菌均有抑制作用，菌株來(lái)源見(jiàn)表1。

2.2 產(chǎn)細(xì)菌素菌株的復(fù)篩 在31株菌中，有5株菌 Y2-2、D4-1、D3-2、G7-1、Y7-2 經(jīng)過(guò)中和 pH 至6.0后，發(fā)酵上清液對(duì)指示菌依然有抑制活性。由圖1可知，與自然pH的發(fā)酵上清對(duì)清酒乳桿菌的抑菌效果相比，菌株Y2-2、D3-2和Y7-2上清液對(duì)清酒乳桿菌的抑菌活性分別降低了6.85%、6.45%和8.91%，差異顯著 （P＜0.01），說(shuō)明這些菌株上清液抑菌活性與有機(jī)酸有關(guān)。菌株D4-1和G7-1的pH=6.0的發(fā)酵上清與原始發(fā)酵上清抑菌效果降低了0.71%和1.59%，無(wú)顯著差異（P＞0.05），表明上清液中有非酸性的抑菌物質(zhì)。

2.3 抑菌物質(zhì)對(duì)過(guò)氧化氫酶的敏感性 五株乳酸菌的發(fā)酵上清液（pH=6.0）經(jīng)過(guò)氧化氫酶處理前后抑菌率如圖2所示。與對(duì)照（pH 6.0）相比，經(jīng)過(guò)氧化氫酶處理后，各菌株發(fā)酵上清的抑菌效果分別降低了3.28%、3.65%、5.08%、5.07%和 3.42%，均有顯著降低（P＜0.05），但仍然有一定的活性。菌株G7-1在排除過(guò)氧化氫的作用后抑菌活性依然較高，仍能達(dá)到（19±0.99）%的抑菌率。

2.4 抑菌物質(zhì)對(duì)蛋白酶的敏感性 5株菌發(fā)酵上清液的抑菌活性對(duì)胃蛋白酶的敏感性如圖3所示。與未經(jīng)胃蛋白酶處理但經(jīng)過(guò)過(guò)氧化氫酶處理（pH 6.0）的發(fā)酵上清相比，菌株Y2-2的抑菌率下降 1.59%，差異不顯著（P ＞ 0.05），株菌 D4-1、D3-2、G7-1、Y7-2對(duì)清酒乳桿菌的抑菌率分別下降了5.09%、10.00%、21.54%和3.67%，均顯著降低（P＜0.05）。其中菌株G7-1在經(jīng)過(guò)胃蛋白酶處理后抑菌率為 （2.7±1.07）%，抑菌活性幾乎完全喪失，說(shuō)明菌株G7-1的上清液中有抑菌的肽或者蛋白質(zhì)，即細(xì)菌素或其類(lèi)似物。

2.5 抗菌肽對(duì)高溫的耐受性 從圖4可以看出，將菌株G7-1的發(fā)酵上清液（經(jīng)過(guò)氧化氫酶處理，pH 6.0）經(jīng)高溫處理后，抑菌活性降低。與對(duì)照組相比，經(jīng)60℃和80℃水浴加熱處理30 min后，G7-1的發(fā)酵上清液抑菌能力顯著降低 （P＜0.05），但仍有（82.68±1.99）%和（67.51±2.10）%的抑菌活性。但經(jīng)過(guò)100℃和120℃加熱30 min后，G7-1的發(fā)酵上清液的抑菌能力降低到（49.62±4.06）%和（25.93±3.04）%，表明 G7-1 所產(chǎn)抑菌物質(zhì)對(duì)熱敏感。

2.6 抗菌肽對(duì)酸堿的耐受性 菌株G7-1的發(fā)酵上清液（經(jīng)過(guò)氧化氫酶處理，自然pH）對(duì)不同pH的酸堿處理后的敏感性如圖5所示。酸堿處理對(duì)抗菌肽的抑菌活性有一定的影響，pH 6.0的酸處理對(duì)抑菌率影響最小，pH 4.0的酸處理使得抑菌活性小幅下降到（87.43±3.71）%，pH 2.0 的處理使得抑菌活性降低到（69.98±4.17）%，表明菌株G7-1所產(chǎn)抗菌肽對(duì)酸處理有較好的穩(wěn)定性和耐受性。相比之下，該抑菌物質(zhì)對(duì)堿處理較為敏感，pH 8.0的堿處理使得抑菌率降低到 （80.13±4.07）%，而pH 10的堿處理使得抑菌率降低到（58.38±2.61）%。不過(guò)總體而言，該抗菌肽具有較好的酸堿耐受性。

2.7 菌株G7-1的16S rDNA序列鑒定 根據(jù)菌株G7-1的16S rDNA序列信息，綜合鑒定產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌所屬種屬為屎腸球菌，命名屎腸球菌G7-1，其系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖6所示。

3 討論

本研究從水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境以及水產(chǎn)動(dòng)物糞便中分離得到了疑似產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌，鑒定其為屎腸球菌。乳酸菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境和水產(chǎn)動(dòng)物中分布十分廣泛。Verschuere等（1999）根據(jù)水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)的微生物群類(lèi)分布情況，提出乳酸菌能夠增強(qiáng)宿主對(duì)疾病抵抗力并且可以提高周?chē)w質(zhì)量，是活的微生物添加劑。本研究從水產(chǎn)動(dòng)物生境及糞便中均能分離出乳酸菌，說(shuō)明乳酸菌在天津地區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘廣泛存在，可能對(duì)維持水產(chǎn)動(dòng)物的微生態(tài)平衡有重要作用。

在水產(chǎn)動(dòng)物生境或體內(nèi)的乳酸菌種，屎腸球菌是一類(lèi)常見(jiàn)的乳酸菌，同時(shí)具有良好的耐酸和耐低溫能力，在極端低溫條件下也可以生長(zhǎng)（夏鍇等，2016；駱?biāo)囄模?009）。屎腸球菌組成的微生物菌群不僅有良好的生物學(xué)特性，還可以改善機(jī)體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，提高動(dòng)物體免疫能力（Peng等，2010）。屎腸球菌應(yīng)用在養(yǎng)殖的水產(chǎn)動(dòng)物也具有很好的效果。例如可顯著增加奧尼羅非魚(yú)機(jī)體的增長(zhǎng)速度和髓過(guò)氧化物酶活力 （Wang等，2008）。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)屎腸球菌可以產(chǎn)生腸球菌素P（Class IIa 片球菌素類(lèi)）、腸球菌素 L50、Q（Class IIb無(wú)前導(dǎo)肽類(lèi)）和腸球菌素B（Class IIc其他線(xiàn)性非片球菌素）等（王濤，2013）。本研究發(fā)現(xiàn)的屎腸球菌G7-1菌株產(chǎn)生的類(lèi)細(xì)菌素在胃蛋白酶作用后，抑菌活性顯著降低，說(shuō)明該抑菌物質(zhì)是蛋白類(lèi)物質(zhì)，很可能是Class II類(lèi)細(xì)菌素。細(xì)菌素產(chǎn)生能力有助于提高乳酸菌在應(yīng)用過(guò)程中對(duì)病原菌的控制力。 Sun等（2012）使用屎腸球菌 MM4（VRE）作為飼料添加劑，飼喂石斑魚(yú)發(fā)現(xiàn)，其能顯著提高腸道中潛在益生菌的生長(zhǎng)，能夠?qū)菇瘘S色葡萄球菌、哈維弧菌等細(xì)菌性疾病。因此進(jìn)一步分析和考察本研究所分離得到的菌株屎腸球菌G7-1對(duì)各類(lèi)水產(chǎn)品的攻毒保護(hù)作用效果，有助于評(píng)估屎腸球菌G7-1在水產(chǎn)養(yǎng)殖中替代抗生素的潛力。

4 小結(jié)

本試驗(yàn)從水產(chǎn)動(dòng)物的腸道內(nèi)容物、糞便以及水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖環(huán)境（包括水、池塘底泥、過(guò)濾系統(tǒng)等）分離出菌株261株，在排除有機(jī)酸、過(guò)氧化氫酶的作用后，經(jīng)胃蛋白酶作用，確定菌株G7-1能產(chǎn)生蛋白質(zhì)類(lèi)抑菌物質(zhì)。該物質(zhì)對(duì)酸處理有較好耐受性，對(duì)堿處理及熱處理不穩(wěn)定。經(jīng)過(guò)16S rDNA序列特征分析，鑒定該菌株為屎腸球菌。