艾司西酞普蘭對MPTP誘導(dǎo)的急性帕金森病模型小鼠運動和認(rèn)知功能的作用

苑曉陽 劉俊騫 顧平 劉惠苗 王文婷 仇福成 李冬 李娜

帕金森病(Parkinson disease，PD)是一種中老年人常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，以中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性減少為主要病理改變。臨床主要表現(xiàn)為運動遲緩、靜止性震顫、強直等多種運動癥狀，亦可伴發(fā)認(rèn)知功能障礙、情緒障礙、睡眠障礙等多種非運動癥狀[1-2]。認(rèn)知功能障礙是PD重要的非運動癥狀之一。認(rèn)知功能損害在早期PD患者中發(fā)病率約為18.9%～38.2%，其中有70%～80%的PD患者最終進(jìn)展為PD性癡呆，且以每年10%的速度進(jìn)展[3]。運動和認(rèn)知功能與PD患者的病情、生活質(zhì)量及預(yù)后息息相關(guān)。因此，改善患者的運動及認(rèn)知功能對減輕家庭和社會的照料以及經(jīng)濟負(fù)擔(dān)有重要作用。草酸艾司西酞普蘭(escitalopram，ESC)是西酞普蘭的異構(gòu)體，主要用于治療廣泛性焦慮、重度抑郁癥及驚恐障礙等[4]。迄今為止，已有多項研究報道ESC在改善認(rèn)知功能方面發(fā)揮重要作用[4-5]，但目前關(guān)于ESC對PD運動及認(rèn)知功能影響的研究較少。因此，本研究對ESC對1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(1-methyl-4 -phenyl-1，2，3，6-tetrahydropridine，MPTP)誘導(dǎo)的急性PD模型小鼠運動和認(rèn)知功能的影響進(jìn)行探討。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：11周齡雄性清潔級健康C57BL/6J小鼠45只，體質(zhì)量23～30 g，由北京華阜康公司提供。根據(jù)《河北醫(yī)科大學(xué)動物管理條例》進(jìn)行適宜室溫、自由飲食水、標(biāo)準(zhǔn)晝夜節(jié)律喂養(yǎng)。

1.1.2主要試劑和儀器：MPTP(M0896)購自Sigma公司，ESC原研藥由丹麥靈北藥業(yè)提供；酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)抗體(ab137721)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)抗體(ab72439)和抗膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(choline acetyltransferase，ChAT)抗體(ab70219)均購自abcam公司；β-actin(20536-1-AP)購自Proteintech公司；山羊抗兔熒光二抗(A23920-1)購自Abbkine公司；SABC免疫組化染色試劑盒(SA1022)購自博士德生物公司。Morris水迷宮來自上海欣軟信息科技有限公司；自制爬桿；Olympus光學(xué)顯微鏡來自日本Olympus光學(xué)工業(yè)株式會社；Eppendorf5417R型號離心機來自德國艾本德公司；22br53450型號干轉(zhuǎn)機及10025025Rev A型號電泳槽(含玻璃板套件)來自BIO-RAD公司；石蠟切片機來自德國Leia公司。

1.2 方法

1.2.1實驗動物分組及模型構(gòu)建：將45只C57BL/6J小鼠按隨機數(shù)字法隨機分為3組：(1)急性PD模型組(PD組，n=15)：健康小鼠采用腹腔注射MPTP制作急性PD模型小鼠；MPTP溶于生理鹽水(4 mg/mL)，按體質(zhì)量20 mg/kg腹腔注射，每隔2 h注射1次共4次[6]；小鼠出現(xiàn)一過性的震顫、后腿拉直、躬背、豎毛、運動減少，并檢測小鼠黑質(zhì)及紋狀體區(qū)域TH+細(xì)胞數(shù)減少最終確定模型構(gòu)建成功。(2)正常對照組(對照組，n=15只)，采用上述相同方式給予健康小鼠同等劑量的生理鹽水；(3)ESC預(yù)處理組(ESC組，n=15)：即在制備急性PD模型(同PD組)前3 d，每日上午9時按體質(zhì)量15 mg/kg給予小鼠ESC腹腔注射1次，共注射12 d。

1.2.2認(rèn)知行為學(xué)及運動功能檢測：三組小鼠認(rèn)知功能均通過Morris水迷宮實驗定位航行試驗和探索訓(xùn)練檢測，運動功能檢測均通過爬桿實驗及Morris水迷宮實驗游泳速度檢測進(jìn)行。

(1)認(rèn)知功能：Morris水迷宮實驗的所有實驗均于黑暗環(huán)境下進(jìn)行，關(guān)閉房間內(nèi)所有燈，并將不透光窗簾全部拉上。實驗開始前3 d行適應(yīng)性訓(xùn)練以防小鼠產(chǎn)生焦慮或恐慌。

三組小鼠均于MPTP注射后第2天開始行水迷宮實驗共5 d。①定位航行試驗：通過對小鼠尋臺潛伏期進(jìn)行重復(fù)測量比較檢測小鼠學(xué)習(xí)能力的變化。②探索訓(xùn)練：于水迷宮實驗第6天撤掉平臺，開始60 s的探索訓(xùn)練。記錄小鼠在目標(biāo)象限穿越平臺的次數(shù)、穿越平臺所在象限路程占總路程的比例(路程百分比)，以檢測小鼠空間記憶的功能。

(2)運動功能檢測：①游泳速度檢測：Morris水迷宮運用計算機影像捕捉小鼠單位時間內(nèi)的動軌跡，并記錄小鼠游泳速度。②爬桿實驗：參照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行改良的爬桿試驗。各組小鼠均于造模前3 d進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練，3次/d，每次間隔30 min。于造模后第8天檢測各組小鼠運動能力，記錄3次由頂爬行至底的時間并計算均值。

1.2.3LSAB免疫組化染色法：檢測黑質(zhì)TH+陽性神經(jīng)元和紋狀體平均光密度(mean optical density，MOD)，確定PD模型構(gòu)建成功，對海馬CA1區(qū)進(jìn)行ChAT免疫染色確定ESC對PD模型認(rèn)知功能的改善功能。制作急性PD模型第9天取每組5只小鼠用2%(0.02 g/mL)水合氯醛1.5 mL腹腔注射麻醉后，斷頭取腦。將全腦組織采取固定、脫水、浸蠟、包埋等步驟制備組織蠟塊。用旋轉(zhuǎn)切片機行黑質(zhì)、紋狀體和海馬冠狀位連續(xù)切片，厚度4 μm。選取各組小鼠黑質(zhì)及紋狀體部分，分別取頭、中、尾端各取5張切片，以各組小鼠海馬CA1區(qū)相同位置的切片取5張共45張腦片，經(jīng)脫蠟，脫水，熱修復(fù)，雙氧水室溫孵育，封閉液封閉30 min。黑質(zhì)和紋狀體切片加TH抗體(1∶2000)，海馬切片加入兔血清ChAT抗體(1∶2000)，4℃孵育過夜。山羊抗兔IgG室溫孵育30 min，封閉20 min，DAB法顯色，水洗后切片經(jīng)蘇木素著色，再水洗，1%鹽酸酒精脫色，水洗，氨水復(fù)染，水洗，梯度酒精(70%～100%，從低至高)脫水，二甲苯固定10 min×2，中性樹膠封片。使用BX60顯微鏡，SPOT-2數(shù)碼成像軟件，在400倍視野下對含完整細(xì)胞核的黑質(zhì)TH+和海馬CA1區(qū)ChAT+的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，計算黑質(zhì)TH+和海馬CA1區(qū)ChAT+細(xì)胞的平均數(shù)。使用Imae-Pro-Plus軟件計算紋狀體區(qū)TH染色的MOD值(MOD=積分光密度值/總面積)。免疫組化染色后，黑質(zhì)TH+和海馬CA1區(qū)ChAT+細(xì)胞均呈棕色。

1.2.4Western-Blot檢測海馬區(qū)BDNF水平：第9天各組小鼠(每組n=10)用水合氯醛麻醉后，快速取出小鼠大腦組織，冰上解剖出海馬組織，按150 mg小鼠腦組織加入500 μL的 RIPA裂解液比例置于RIPA裂解液緩沖液中，混合1%的PMSF冰上研磨，以12 000 r/min、離心半徑為20 cm于4℃離心30 min，取上清，BCA法測蛋白質(zhì)濃度。剩余樣本加蛋白上樣緩沖液，100℃變性5 min，將蛋白樣品加入對應(yīng)位置12%分離膠進(jìn)行電泳。采用濕法將蛋白轉(zhuǎn)移置甲醇活化的PVDF膜上后，5%脫脂奶粉PBST溶液室溫封閉1 h，加入兔多克隆BDNF抗體(1∶1000)孵育，4℃過夜。次日清洗PVDF膜，進(jìn)行羊抗兔IgG(1∶2000)室溫下避光反應(yīng)1 h，以β-actin(1∶2000)為內(nèi)參進(jìn)行二抗孵育。記錄BDNF與β-actin灰度值比值，比較各組小鼠海馬BDNF水平，并進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)均由SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，三組間比較的統(tǒng)計分析采用重復(fù)因素方差分析檢驗，組間兩兩比較，方差齊則采用LSD法，方差不齊采用SNK-q檢驗法。P<0.05時表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠的表現(xiàn)PD組小鼠大多在第2次注射MPTP后出現(xiàn)震顫、豎尾、僵直、運動弛緩等行為，多在30 min內(nèi)緩解，24 h內(nèi)基本恢復(fù)，符合急性PD模型的表現(xiàn)。ESC組小鼠在ESC預(yù)處理3 d內(nèi)未出現(xiàn)異常行為；在第3次注射MPTP后出現(xiàn)震顫、豎尾、僵直、運動弛緩等行為，多于20 min內(nèi)緩解，符合急性PD模型的表現(xiàn)。對照組未出現(xiàn)任何異常行為。

2.2 各組小鼠認(rèn)知功能和運動功能比較

2.2.1各組小鼠的學(xué)習(xí)能力比較：與PD組相比，ESC組和對照組小鼠尋臺潛伏期均明顯縮短(P<0.05)，ESC組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具體見表1。

表1 各組小鼠尋臺潛伏期比較(n=15，±s)

2.2.2各組小鼠記憶能力比較：與對照組小鼠相比，PD組穿過平臺次數(shù)減少，穿越路程百分比縮短(P<0.05)；與PD組比較，ESC組穿過平臺次數(shù)增多，穿越路程百分比升高(P<0.05)；ESC組與對照組比較，穿過平臺次數(shù)和小鼠穿越路程百分比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具體見表2。上述結(jié)果表明急性PD模型小鼠記憶能力受損，而ESC預(yù)處理對PD小鼠記憶能力受損可能有改善作用。

2.2.3各組小鼠的運動功能比較：與對照組比較，PD組速度減慢，爬桿時間延長(P<0.05)；與PD組比較，ESC組游泳速度增快，爬桿時間縮短(P<0.05)；ESC組與對照組比較游泳速度、爬桿時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具體見表2。上述結(jié)果表明ESC預(yù)處理可能改善PD模型小鼠的運動能力。

表2 各組小鼠水迷宮實驗記憶能力和運動功能的比較(n=15，±s)

2.2.4各組小鼠TH+神經(jīng)元和海馬ChAT+細(xì)胞比較：對照組與ESC組小鼠黑質(zhì)TH+細(xì)胞形態(tài)正常，神經(jīng)元排列致密、整齊，胞核飽滿，核仁清晰，無明顯梭形改變，突起無明顯減少；PD組黑質(zhì)殘留TH+細(xì)胞皺縮，胞核不飽滿，核仁欠清晰，有梭形改變，突起減少。對照組海馬CA1區(qū)的ChAT+細(xì)胞形態(tài)正常，PD組與ESC組ChAT+細(xì)胞形態(tài)與對照組無明顯差異(圖1)。與對照組比較，PD組及ESC組黑質(zhì)TH+細(xì)胞數(shù)及紋狀體TH+細(xì)胞的MOD值均顯著降低(P<0.05)，但ESC組TH+細(xì)胞數(shù)及紋狀體TH+細(xì)胞的MOD值明顯高于PD組(P<0.05)。對照組與ESC組比PD組海馬CA1區(qū)的ChAT+細(xì)胞數(shù)明顯增多(P<0.05)，對照組與ESC組CA1區(qū)的ChAT+細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表3)。上述結(jié)果表明，ESC預(yù)處理可減輕MPTP誘導(dǎo)急性PD模型小鼠黑質(zhì)-紋狀體多巴胺神經(jīng)元的損害。

表3 各組小鼠的黑質(zhì)TH+神經(jīng)元、紋狀體TH+神經(jīng)纖維的MOD值及海馬ChAT+神經(jīng)元的比較(n=5，±s)

圖1 各組小鼠黑質(zhì)TH+細(xì)胞(×200)及海馬CA1區(qū)ChAT+細(xì)胞數(shù)(×20)比較(LSAB免疫組化)

2.2.5各組小鼠海馬區(qū)BDNF表達(dá)：通過 Western blot檢測各組小鼠海馬區(qū)BDNF含量，結(jié)果顯示，PD組(0.09±0.01)BDNF含量明顯低于對照組(0.64±0.27)，ESC組BDNF含量(0.57±0.05)明顯高于PD組(均P<0.05)；而ESC組與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具體見圖2。

注：BDNF：腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 圖2 Western blot檢測各組小鼠海馬區(qū)BDNF的表達(dá)

3 討論

目前認(rèn)為PD是一種累及多系統(tǒng)的神經(jīng)退行性疾病，伴有認(rèn)知功能障礙、焦慮抑郁情緒等多種非運動癥狀，對患者生活質(zhì)量的影響較大，甚至超過運動癥狀[8]。近年來研究顯示，ESC作為高選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑 (selective serotonin reuptake inhibitors，SSRIs)，對焦慮抑郁患者及一些動物模型的認(rèn)知功能有改善作用[5]。ESC也可改善PD患者伴發(fā)的抑郁情緒和步態(tài)不穩(wěn)[9]。目前尚不明確ESC對PD患者認(rèn)知功能的影響。

既往研究發(fā)現(xiàn)急性缺血性腦卒中后抑郁患者應(yīng)用SSRI類藥物，能夠顯著改善運動功能、降低致殘率、改善生活質(zhì)量，并且在沒有抑郁的卒中患者中仍然有效[10]。卒中前應(yīng)用包含ESC在內(nèi)的SSRI類藥的腦卒中患者，運動功能評分顯著高于卒中后抑郁再應(yīng)用SSRI類藥物的患者[11]。ESC改善運動功能的機制可能為促進(jìn)腦卒中區(qū)域的神經(jīng)恢復(fù)，改善腦血流分布，并發(fā)揮一定抗炎作用，且對腎上腺素能神經(jīng)系統(tǒng)有所調(diào)節(jié)[12]。ESC也能夠改善焦慮抑郁患者的運動表現(xiàn)[5]。本研究表明ESC可以改善由MPTP導(dǎo)致的PD小鼠運動能力的損害，對PD小鼠的多巴胺能神經(jīng)元有一定的保護作用。但目前ESC對PD患者運動能力的影響及機制仍需深入研究。

有研究報道MPTP誘導(dǎo)的慢性PD小鼠模型可出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶能力下降[13-14]。本實驗發(fā)現(xiàn)MPTP誘導(dǎo)的急性PD小鼠亦存在空間學(xué)習(xí)和記憶能力下降。腹側(cè)被蓋區(qū)及黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元與記憶有關(guān)，且認(rèn)知功能的下降與腹側(cè)被蓋區(qū)等區(qū)域的多巴胺含量的減少相關(guān)，表明多巴胺能夠維持或提高認(rèn)知功能[1]。ESC預(yù)處理也能增加Aβ1-42作用的海馬細(xì)胞BDNF的釋放，減緩神經(jīng)細(xì)胞退行性變[1]。本實驗發(fā)現(xiàn)急性PD模型海馬CA1區(qū)的ChAT+細(xì)胞數(shù)減少并伴隨BDNF水平下降可能與其認(rèn)知功能下降也有一定的關(guān)系，而經(jīng)ESC預(yù)處理的PD模型小鼠認(rèn)知能力及海馬區(qū)BDNF水平有明顯提高，表明ESC可以改善PD小鼠的認(rèn)知功能，且可能與海馬區(qū)BDNF水平的提高相關(guān)。

提高神經(jīng)可塑性是治療認(rèn)知功能障礙的基礎(chǔ)之一。BDNF也是一種主要分布于神經(jīng)系統(tǒng)、具有促進(jìn)神經(jīng)生長活性的蛋白質(zhì)，在神經(jīng)可塑性中扮演重要角色。研究表明，因BDNF含量的變化不但可以反映神經(jīng)損傷的程度，而且BDNF也是起神經(jīng)保護作用的重要因子之一[15]。在海馬CA1-CA4區(qū)的錐體細(xì)胞層及齒狀回的顆粒細(xì)胞層中BDNF含量豐富。BDNF缺乏而減弱的長時程增強，通過向海馬區(qū)注入外源性BDNF而完全恢復(fù)，而注入抑制BDNF表達(dá)的反義寡核苷酸片段后，正常大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力明顯減弱[16]。ESC能夠提高焦慮抑郁嚙齒動物模型海馬的BDNF水平[17]和腦缺血沙鼠模型海馬CA1區(qū)的BDNF水平[15]。本研究中PD小鼠的BDNF水平伴隨著認(rèn)知功能的受損明顯下降，而ESC組的PD小鼠海馬區(qū)BDNF水平有明顯提高。由此可以推測，ESC可能能夠通過增加海馬區(qū)BDNF水平，從而達(dá)到提高神經(jīng)可塑性的目的。

綜上所述，ESC可以改善PD小鼠的認(rèn)知及運動功能，其機制可能與保護海馬和黑質(zhì)神經(jīng)元，促進(jìn)BDNF的分泌，提高神經(jīng)可塑性有關(guān)。但關(guān)于ESC調(diào)控BDNF蛋白的表達(dá)和抵抗神經(jīng)元損傷的確切機制還有待進(jìn)一步的完善體外實驗和在體研究。另外，ESC組海馬和黑質(zhì)細(xì)胞數(shù)量比PD組增多是由于新生細(xì)胞的增多還是通過對原有細(xì)胞的保護，亦有待進(jìn)一步研究。