金葡菌殺白細(xì)胞素S組分LukS-PV抑制急性髓系白血病細(xì)胞增殖的機(jī)制研究*

施嵐 許良飛 聶正超 常文嬌 馬筱玲

白血病是臨床常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤。近年來，表觀遺傳相關(guān)的調(diào)控失常已被證實(shí)在白血病的發(fā)生發(fā)展中占有重要地位。由于與傳統(tǒng)基因序列改變不同，表觀遺傳修飾的可逆性為白血病藥物靶向治療提供了可能[1，2]。目前針對(duì)表觀遺傳修飾的靶向治療藥物研發(fā)已取得了很多突破性進(jìn)展，如白血病常用化療藥物阿扎胞苷和地西他濱作為DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑已經(jīng)被批準(zhǔn)應(yīng)用于治療臨床骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndromes，MDS）和急性髓細(xì)胞白血?。╝cute myelocytic leukemia，AML）[3，4]。另外甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2和LSD1在白血病發(fā)病中的作用也有較多研究報(bào)道，其靶向治療藥物正在臨床預(yù)實(shí)驗(yàn)階段[5，6]。以上研究成果提示表觀遺傳修飾在白血病的靶向治療領(lǐng)域具有良好的研發(fā)前景。

細(xì)菌毒素因?yàn)榫哂薪Y(jié)合靶細(xì)胞的特異性和細(xì)胞毒性，目前已成為抗腫瘤藥物研發(fā)的新熱點(diǎn)，一些毒素已被證明具有抗腫瘤活性，并顯示出良好的應(yīng)用前景[7，8]。PVL（Panton-Valetine leukocidin）是金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的細(xì)胞外毒素，由LukS-PV和LukFPV兩個(gè)亞單位組成[9]。補(bǔ)體C5a受體（component 5a receptor ，C5aR）是LukS-PV的結(jié)合位點(diǎn)，基于C5aR在髓系細(xì)胞膜上有較高表達(dá)，而在淋巴細(xì)胞膜上沒有表達(dá)的特性，LukS-PV對(duì)中性粒及單核在內(nèi)的急性髓系白血病細(xì)胞有作用，而對(duì)急性淋巴細(xì)胞白血病則沒有作用[10]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)單組份LukS-PV細(xì)胞毒性較小，可通過結(jié)合C5aR或上調(diào)miR-125a調(diào)控細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)通路誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡和分化，從而發(fā)揮抗白血病效應(yīng)[11-14]。但LukS-PV是否可以通過表觀遺傳調(diào)控機(jī)制發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)目前還不清楚。

SET8（PR-Set7/9，SETD8，KMT5A）是甲基轉(zhuǎn)移酶SET家族成員之一，其酶活性是特異性修飾組蛋白H4K20me1[15]。SET8 通過H4K20me1修飾參與了包括轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細(xì)胞周期進(jìn)展、基因復(fù)制和基因組穩(wěn)定性等多種重要的細(xì)胞生物學(xué)過程[16-19]。SET8在多種實(shí)體腫瘤中表達(dá)顯著增高，且與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[20-22]。然而，SET8在急性白血病中的作用和相關(guān)機(jī)制仍不清楚。

該實(shí)驗(yàn)選用AML細(xì)胞系THP-1和HL-60，首先檢測(cè)LukS-PV對(duì)SET8的調(diào)控作用，進(jìn)一步探究敲低SET8對(duì)白血病細(xì)胞增殖的影響，最后證實(shí)LukS-PV通過下調(diào)SET8影響白血病細(xì)胞的增殖。該研究提示SET8可以作為急性髓系白血病潛在的治療靶點(diǎn)，并為L(zhǎng)ukS-PV的抗白血病效應(yīng)提供了新的分子機(jī)制。

材料與方法

1 細(xì)胞系和主要試劑 人急性髓系白血病細(xì)胞系THP-1細(xì)胞和HL-60細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；細(xì)胞培養(yǎng)所用的RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、青霉素和鏈霉素購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；脂質(zhì)體Lipo2000和RNA提取試劑TRIzol購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)KAPA公司；人SET8沉默的慢病毒載體購(gòu)自上海吉瑪技術(shù)有限公司；實(shí)驗(yàn)中所用引物由華大基因公司合成，以GAPDH作為內(nèi)參；DMSO溶液購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司；BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒和蛋白裂解液RIPA購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；抗人SET8多克隆抗體、H4K20me1、GAPDH內(nèi)參抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；DyLightTM800標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗購(gòu)自美國(guó)Rockland公司。

2 方法

2.1 LukS-PV的表達(dá)純化：取-80 ℃凍存的含重組表達(dá)載體pET28a-LukS-PV的大腸桿菌BL21（DE3）菌液，接種于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，37 ℃，200 r/min，振蕩培養(yǎng)6～8 h。離心收集細(xì)菌。用10 mL Binding Buffer重懸細(xì)菌，超聲破碎后離心，收集上清，用6×His親和層析柱（His·Band Purification Kit）純化。BCA法測(cè)定純化后的LukS-PV蛋白濃度。

2.2 RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)：離心收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌1次，Trizol法抽提細(xì)胞總RNA，分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度。通過試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照試劑盒說明書操作，以GAPDH作為內(nèi)參，ABI7500 PCR儀進(jìn)行檢測(cè)。 目的基因擴(kuò)增所用引物序列為：SET8: Forward，5'-ACTTACGGATTTCTACCCTGTC-3'，Reverse，5'-CGATGAGGTCAATCTTCATTCC-3'；GAPDH：Forward，5'-TGGGTGTGAACCATGAGAAGT-3'，Reverse，5'-TGAGTCCTTCCACGATACCAA -3'。

2.3 慢病毒轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染效率驗(yàn)證：將沉默SET8的慢病毒載體轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞和HL-60細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后，用嘌呤霉素篩選細(xì)胞培養(yǎng)。篩選7天后收取各組細(xì)胞，分別提取陰性對(duì)照組和沉默SET8組的細(xì)胞RNA及蛋白，qRT-PCR和WB檢測(cè)各組細(xì)胞中SET8的表達(dá)水平。

2.4 Western blot檢測(cè)：離心收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌1次，提取細(xì)胞總蛋白。制備12%SDS聚丙烯酰胺凝膠，進(jìn)行SDS-PAGE電泳；電泳結(jié)束后，以200 mA電流轉(zhuǎn)膜2 h，將NC膜置于10 mL封閉液（5%脫脂奶粉-PBS-0.05%Tween-20）中，室溫封閉2 h；抗人SET8多克隆抗體、H4K20me1、GAPDH內(nèi)參抗體，4 ℃振搖孵育過夜；加入二抗（用封閉液1∶20 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG），室溫孵育2 h；加ECL發(fā)光試劑，檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。

2.5 EdU檢測(cè)細(xì)胞增殖：用EdU試劑盒（keyGEN）檢測(cè)慢病毒敲低或過表達(dá)SET8以及LukS-PV處理后AML細(xì)胞THP-1和HL-60的增殖能力。EdU標(biāo)記kFluor488，顯示綠色熒光。以每孔5 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，LukS-PV孵育24 h，加入50 nM EdU工作液孵育2.5 h，使用Hoechst 33342在黑暗中反染30 min。最后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)EdU陽(yáng)性細(xì)胞的比例。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：所有資料數(shù)據(jù)均采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有計(jì)量數(shù)據(jù)均采用均數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)差（+s） 表示。組間比較采用Student't-test，多組間的比較采用方差分析。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 LukS-PV下調(diào)AML細(xì)胞THP-1和HL-60的SET8表達(dá)用不同濃度（0，0.25，0.5，0.75和 1.0μM）LukSPV刺激AML細(xì)胞THP-1和HL-60后，通過qRT-PCR和WB檢測(cè)SET8的mRNA和蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，SET8 mRNA和蛋白水平明顯下調(diào)（P＜0.05）（圖1）。以上結(jié)果表明LukS-PV可以下調(diào)SET8表達(dá)并具有濃度依賴性。

2 LukS-PV在AML細(xì)胞THP-1和HL-60下調(diào)SET8介導(dǎo)的H4K20me1表達(dá) 已知SET8可以靶向修飾H4K20me1，那么LukS-PV是否可以通過SET8調(diào)控H4K20me1呢？WB檢測(cè)結(jié)果顯示不同濃度LukS-PV刺激白血病細(xì)胞THP-1和HL-60后，H4K20me1的水平與對(duì)照組相比，明顯下調(diào)（P＜0.05）（圖2）。以上結(jié)果表明LukS-PV可以下調(diào)SET8介導(dǎo)的H4K20me1表達(dá)并具有濃度依賴性。

3 SET8慢病毒載體敲低效率驗(yàn)證 首先我們構(gòu)建了穩(wěn)定敲低SET8的慢病毒載體，分別轉(zhuǎn)入白血病細(xì)胞系THP-1和HL-60進(jìn)行篩選，并通過qRT-PCR和WB驗(yàn)證敲低效率，且通過WB檢測(cè)進(jìn)一步驗(yàn)證敲低SET8可以下調(diào)H4K20me1的表達(dá)（P＜0.01）（圖3）。

4 敲低SET8抑制白血病細(xì)胞THP-1和HL-60的增殖通過EdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，下調(diào)SET8可以抑制白血病細(xì)胞THP-1和HL-60的增殖，EdU陽(yáng)性細(xì)胞的百分比分別為（56.4±2.6% VS 33.1±1.5%）和（38.0±1.8% VS 20.0±1.2%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖4）。

5 LuKS-PV通過下調(diào)SET8抑制白血病細(xì)胞THP-1和HL-60的增殖 上述結(jié)果顯示LukS-PV可以下調(diào)SET8，而敲低SET8可以抑制白血病細(xì)胞THP-1和HL-60的增殖，那么LukS-PV是否可以通過下調(diào)SET8抑制白血病細(xì)胞THP-1和HL-60的增殖呢？為了驗(yàn)證這一假設(shè)，我們首先在白血病細(xì)胞系THP-1和HL-60中敲低SET8，在此基礎(chǔ)上加入LukS-PV刺激，然后通過EdU檢測(cè)白血病細(xì)胞系THP-1和HL-60的增殖情況，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，敲低SET8可以抑制細(xì)胞增殖，而再加入LukS-PV導(dǎo)致細(xì)胞增殖抑制更加明顯。以上結(jié)果表明LukS-PV通過下調(diào)SET8抑制白血病細(xì)胞THP-1和HL-60的增殖（圖5）。

討 論

細(xì)菌毒素由于對(duì)包括腫瘤細(xì)胞在內(nèi)的靶細(xì)胞具有特異性的細(xì)胞毒性作用，在抗癌藥物的研發(fā)中受到越來越多的關(guān)注[7，8]。LukS-PV是金黃色葡萄球菌分泌的細(xì)胞外毒素PVL的S組分[9]。課題組之前已報(bào)道LukS-PV在體內(nèi)外均可誘導(dǎo)C5aR介導(dǎo)的AML細(xì)胞凋亡，并抑制其增殖[11-14]。然而，LukS-PV通過調(diào)控組蛋白修飾在AML細(xì)胞中發(fā)揮抗白血病作用的機(jī)制目前仍不清楚。

白血病是臨床常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤。其傳統(tǒng)的治療方式主要以化學(xué)藥物為主，該方式會(huì)導(dǎo)致非特異性細(xì)胞毒性和不可避免的耐藥性，因此，探索白血病新的靶向治療藥物是近年來研究的熱點(diǎn)。研究表明針對(duì)表觀遺傳修飾的靶向藥物在白血病的治療領(lǐng)域具有良好的研發(fā)前景。DNA甲基化和組蛋白修飾是目前表觀遺傳修飾研究領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)。組蛋白修飾的種類較為復(fù)雜，白血病治療領(lǐng)域的研究則主要集中在組蛋白的甲基化和乙?；痆23，24]。很多甲基化修飾酶逐漸被發(fā)現(xiàn)在白血病發(fā)病中起重要作用。如研究較早也較廣泛的MLL1（又名KMT2A）是甲基轉(zhuǎn)移酶SET家族成員，多數(shù)AML患者中存在MLL1易位突變而影響干細(xì)胞的分化[25]。

SET8是含有SET結(jié)構(gòu)域甲基轉(zhuǎn)移酶家族的成員之一，可以靶向修飾H4K20me1。SET8通過靶向調(diào)控H4K20me1介導(dǎo)的信號(hào)通路發(fā)揮生物學(xué)作用。其作用機(jī)制在不同類型腫瘤中有所不同，大致可總結(jié)為以下幾條路徑：活化WNT信號(hào)通路、刺激ERα靶基因的轉(zhuǎn)錄、抑制P53活性、與TWIST共同調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[16-19]。如上所述，SET8的研究主要集中在調(diào)控下游靶基因和信號(hào)通路，而較少關(guān)注SET8上游被調(diào)控的方式。目前報(bào)道只有miR-7和miR-502可以靶向結(jié)合SET8 mRNA的3'UTR從而抑制其轉(zhuǎn)錄[22，26]。而我們的研究顯示LukS-PV靶向下調(diào)SET8，且下調(diào)SET8可以抑制白血病細(xì)胞的增殖，揭示了SET8調(diào)控的潛在機(jī)制，進(jìn)而強(qiáng)調(diào)了調(diào)控SET8在急性髓系白血病治療中的重要性。

綜上所述，我們的研究表明LukS-PV在AML細(xì)胞THP-1和HL-60中通過下調(diào)SET8抑制細(xì)胞增殖。提示SET8是LukS-PV介導(dǎo)的AML治療的潛在靶點(diǎn)。但是這一現(xiàn)象是在急性髓系白血病細(xì)胞系THP-1和HL-60中發(fā)現(xiàn)的，接下來需要收集相關(guān)的臨床樣本，并采取體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證這一假設(shè)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突