核黃素光化學(xué)法處理對(duì)全血中淋巴細(xì)胞功能的影響

張嘉英 樊斌 朱立國 汪德清 李捷

核黃素光化學(xué)法作為一種新型的血液病原體滅活方法，可以滅活血漿、血小板以及全血中的病毒、細(xì)菌以及瘧原蟲，其效果在臨床試驗(yàn)中也得到了驗(yàn)證[1-3]。除了滅活血液成分中的病原體外，利用核黃素光化學(xué)法還可以滅活淋巴細(xì)胞，使其全部失活從而達(dá)到預(yù)防輸血相關(guān)移植物抗宿主?。═A-GVHD）的目的[4,5]。但是，以上研究大多數(shù)是以提純的淋巴細(xì)胞為研究介質(zhì)，而并非全血。另外，除了預(yù)防TAGVHD外，是否可以利用核黃素光化學(xué)法直接處理全血，部分滅活全血中淋巴細(xì)胞，調(diào)節(jié)其中的免疫狀態(tài)，從而探索出一種核黃素光化學(xué)法的全新應(yīng)用模式，目前鮮見報(bào)道。

我們的前期研究表明：利用核黃素光化學(xué)法處理全血，處理劑量越大對(duì)全血中紅細(xì)胞的破壞越大，最終優(yōu)化出了核黃素光化學(xué)法處理全血的最佳技術(shù)參數(shù)（18 J/cm2），該技術(shù)參數(shù)處理全血后全血中紅細(xì)胞溶血率小于0.8%，且對(duì)紅細(xì)胞的質(zhì)量和功能沒有較大影響。本文將延續(xù)以上研究，研究該技術(shù)參數(shù)處理全血后，對(duì)全血中淋巴細(xì)胞的增殖功能和細(xì)胞因子分泌功能的影響，進(jìn)一步明確該技術(shù)參數(shù)的有效性，為未來利用核黃素光化學(xué)法建立血液體外循環(huán)處理回輸技術(shù)治療免疫亢進(jìn)相關(guān)疾病的可行性提供科學(xué)依據(jù)。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)材料 核黃素（江西制藥），淋巴細(xì)胞分離液（天津?yàn)笊镏破饭荆?640培養(yǎng)基（Hyclone公司），胎牛血清（Gibco公司），磷酸鹽緩沖液（PBS，Hyclone公司），植物血凝素（PHA，aladdin公司），CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（DOJINDO公司），人高敏T細(xì)胞細(xì)胞因子磁珠試劑盒（Millipore），液態(tài)懸浮芯片系統(tǒng)（Luminex），光照血袋（自制），核黃素光化學(xué)法血液滅活儀（自制），96孔板和48孔板細(xì)胞培養(yǎng)板（Corning公司）。

2 樣本來源 全血來自中國人民解放軍總醫(yī)院獻(xiàn)血員，3～6人份。倫理批號(hào)：S2016-008-01。

3 樣本處理 選取當(dāng)天采集3小時(shí)內(nèi)的全血。在全血中加入核黃素溶液，終濃度為160 μmol/mL，用5 mL注射器針管配50 mL注射器的針頭將全血注入光照血袋（4×6 cm），注入約3 mL并均勻平鋪，全血厚度約1.3 mm，置于滅活儀中紫外照射劑量18 J/cm2，編入實(shí)驗(yàn)組；使用相同來源的全血，不加核黃素溶液，不進(jìn)行紫外照射處理，編入對(duì)照組。

4 淋巴細(xì)胞的分離 將各組全血與 PBS 1∶1稀釋混勻，取一只離心管，先加入淋巴細(xì)胞分離液，吸取稀釋后的血液樣本加于分離液之液面上，2 000 r/min離心20 min，離心結(jié)束后取第二層環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層至一干凈的離心管中，取適量PBS洗滌，600 g離心5 min，離心結(jié)束后棄去上清，適量PBS充分洗滌3次，棄上清后加入1640完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）重懸計(jì)數(shù)。

5 淋巴細(xì)胞增殖檢測(cè) 根據(jù)淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，分別取實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組淋巴細(xì)胞懸液100 μL加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，接種細(xì)胞數(shù)量為1×105，空白組加入培養(yǎng)基100 μL，各組均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后，向每孔加入10 μLCCK-8溶液，在培養(yǎng)箱中孵育6小時(shí)，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度。根據(jù)測(cè)定結(jié)果計(jì)算出實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞抑制率=[（對(duì)照組-實(shí)驗(yàn)組）/（對(duì)照組-空白組）]×100%。

6 淋巴細(xì)胞因子分泌檢測(cè) 根據(jù)淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，分別取實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組淋巴細(xì)胞懸液1 mL加入48孔板細(xì)胞培養(yǎng)板，接種細(xì)胞數(shù)量為1×105，加PHA刺激組在避光條件下，加入終濃度為1 μg/mL的PHA；不加PHA刺激組加入同體積的PBS；空白組加入培養(yǎng)基1 mL，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(shí)后，收集各組培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞，3 000 rpm離心5 min，取上清，用人高敏T細(xì)胞細(xì)胞因子磁珠試劑盒檢測(cè)細(xì)胞因子IFN-γ、IL-8、IL-12、IL-10、IL-13、IL-4的含量。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（ ±s）表示，作威爾科克森符號(hào)秩檢驗(yàn)比較各組間差異，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 核黃素光化學(xué)法對(duì)全血中淋巴細(xì)胞增殖功能的影響 選取的6人份的全血，經(jīng)核黃素光化學(xué)法滅活后其中淋巴細(xì)胞增殖的情況，結(jié)果如表1所示，實(shí)驗(yàn)組OD值較對(duì)照組OD值降低，全血經(jīng)滅活后其中淋巴細(xì)胞的最低增殖抑制率約為53%、最高增殖抑制率約為90%、平均增殖抑制率為（74.18±14）%，意味著經(jīng)淋巴細(xì)胞并未完全喪失增殖功能，還有約30%的淋巴細(xì)胞具有增殖功能。

2 核黃素光化學(xué)法對(duì)全血中淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子功能的影響 經(jīng)核黃素光化學(xué)法滅活處理后會(huì)明顯抑制淋巴細(xì)胞對(duì)細(xì)胞因子的分泌能力，但是對(duì)每種細(xì)胞因子的分泌影響不同。結(jié)果如圖1所示，與未處理對(duì)照組相比，滅活后全血中的淋巴細(xì)胞，對(duì)IFN-γ、IL-8、IL-12、IL-10、IL-13分泌量分別降低了63%、35%、61%、42%、77%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），IL-4分泌量降低了8%，較對(duì)照組P＞0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。即：經(jīng)滅活處理后全血中淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子能力的保持率分別為IFN-γ（37%）、IL-8（65%）、IL-12（39%）、IL-10（58%）、IL-13（23%）、IL-4（92%）。加PHA刺激后，對(duì)IFN-γ、IL-8、IL-12、IL-10、IL-13、分泌量分別降低了72%、43%、40%、78%、82%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），IL-4分泌量降低了2%，較對(duì)照組P＞0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。即：經(jīng)滅活處理后全血中淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子能力的保持率分別為IFN-γ（28%）、IL-8（57%）、IL-12（60%）、IL-10（22%）、IL-13（18%）、IL-4（98%）。

表1 核黃素光化學(xué)法對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的影響

討 論

核黃素光化學(xué)法滅活淋巴細(xì)胞的已有研究表明，全血分離淋巴細(xì)胞后懸浮于自體血漿中，加入終濃度100 μmol/L的核黃素，420 nm可見光照射劑量40 J/cm2處理，可抑制淋巴細(xì)胞增殖，在PHA刺激條件下細(xì)胞因子IFN-γ、IL-10、IL-12的分泌量降低，IL-4無明顯差異[6]。全血分離淋巴細(xì)胞后懸浮于核黃素終濃度為50 μmol/L的1640緩沖液中，400～500 nm可見光照射劑量8.8 J/mL，可有效抑制淋巴細(xì)胞增殖活性，PHA刺激后，IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8及TNF-α、IFN-γ均降低[7]。核黃素光化學(xué)處理后的淋巴細(xì)胞不能被活化，失去生成細(xì)胞因子IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、IFN-γ的能力[8]。核黃素光化學(xué)法可通過促進(jìn)GADD45α表達(dá),激活p38和JNK信號(hào)通路抑制淋巴細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡[9,10]。

本研究中利用我們前期優(yōu)化的核黃素光化學(xué)法（最佳技術(shù)參數(shù)18 J/cm2）滅活全血對(duì)全血中淋巴細(xì)胞功能影響進(jìn)行研究，本實(shí)驗(yàn)采用此參數(shù)滅活全血，提取滅活后全血中淋巴細(xì)胞與滅活前相比較，結(jié)果顯示，經(jīng)此參數(shù)處理后淋巴細(xì)胞活性降低，加PHA刺激組與未加PHA刺激組細(xì)胞因子IFN-γ、IL-8、IL-12、IL-10、IL-13的分泌量均降低，IL-4分泌量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，細(xì)胞活性功能并沒有完全喪失，還具有一定的分泌功能，滅活后各細(xì)胞因子分泌量降低有所不同，未加PHA刺激組中細(xì)胞因子IL-8保持效果最佳，加PHA刺激組中細(xì)胞因子IL-12保持效果最佳。

IFN-γ主要由活化的T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生，具有活化巨噬細(xì)胞、抗病毒、促進(jìn)MHC分子表達(dá)和抗原提呈、誘導(dǎo)Th1細(xì)胞分化，抑制Th2細(xì)胞分化等功能。IFN-γ通常被認(rèn)為是免疫的主要效應(yīng)因子，這種效應(yīng)因子盡管具有不良作用，但仍被用于治療多種疾病[11]。IL-8是由多種組織和血細(xì)胞產(chǎn)生的趨化性細(xì)胞因子，對(duì)嗜中性粒細(xì)胞具有獨(dú)特的靶標(biāo)特異性，對(duì)其他血細(xì)胞的作用微弱。中性粒細(xì)胞對(duì)IL-8的反應(yīng)的特征在于細(xì)胞遷移，顆粒酶的釋放以及其他細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外變化。有研究表明，抗IL-8治療可預(yù)防中性粒細(xì)胞依賴性組織損傷以及中性粒細(xì)胞浸潤[12]。IL-12是由巨噬細(xì)胞，B細(xì)胞，DC產(chǎn)生的，并在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，輔助性T（Th）細(xì)胞分化中起關(guān)鍵作用。IL-12誘導(dǎo)NK和T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，并分化為Th1細(xì)胞[13]。IL-10來源于Th2細(xì)胞，可以下調(diào)MHCⅡ的表達(dá)，減弱抗原提呈。對(duì)于維持組織上皮層的完整性和體內(nèi)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，可以促進(jìn)組織上皮的先天免疫反應(yīng)，以限制由病毒和細(xì)菌感染引起的損害[14]。IL-4為肥大細(xì)胞產(chǎn)生的第一個(gè)細(xì)胞因子，并負(fù)責(zé)促進(jìn)肥大細(xì)胞IL-13的產(chǎn)生。IL-4，IL-5和IL-13是2型免疫應(yīng)答過程中產(chǎn)生的標(biāo)志性細(xì)胞因子，對(duì)于抵抗細(xì)胞外寄生蟲感染的保護(hù)性免疫至關(guān)重要，并導(dǎo)致哮喘和許多其他過敏性炎癥。許多免疫細(xì)胞類型（包括嗜堿性粒細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞）都能產(chǎn)生至少一種這些細(xì)胞因子[15]。血液中細(xì)胞因子的水平至關(guān)重要，過高或紊亂將會(huì)帶來一定的影響。研究表明，IL-10在紅斑狼瘡（SLE）患者外周血單核細(xì)胞（PBMC）表達(dá)水平明顯升高，活動(dòng)期明顯高于穩(wěn)定期，且與病情和SLE活動(dòng)指數(shù)有相關(guān)性，IL-10在SLE發(fā)病中發(fā)揮一定的作用，具有致病相關(guān)性，也與病情活動(dòng)性有關(guān)，可以作為判斷SLE疾病活動(dòng)性的指標(biāo)[16]。強(qiáng)直性脊柱炎（AS）患者外周血中存在高表達(dá)的IL-12，IL-4，外周血中高水平的細(xì)胞因子可能參與AS的發(fā)病和病變進(jìn)展[17]。風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）患者存在IFN-γ，IL-8升高，其在RA的病理改變中發(fā)揮重要作用[18]。在本研究中，促炎因子IFN-γ、IL-8、IL-12和抗炎因子IL-10、IL-13兩類細(xì)胞因子同樣受到影響，分泌能力的保持率約維持在20%～90%，因此滅活處理全血并不會(huì)破壞細(xì)胞因子平衡導(dǎo)致紊亂。

綜上所述，核黃素光化學(xué)法在一定劑量條件下處理全血后，能夠維持全血中淋巴細(xì)胞一定的增殖活性和分泌細(xì)胞因子功能。因此，在后續(xù)的研究中，可以利用以上技術(shù)參數(shù)研發(fā)一種核黃素光化學(xué)法血液體外循環(huán)處理回輸設(shè)備，并進(jìn)一步利用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)估該技術(shù)參數(shù)的有效性。在未來的應(yīng)用中，可以一次或多次循環(huán)采集患者血液并經(jīng)過體外處理后回輸體內(nèi)，滅活其中部分免疫細(xì)胞從而調(diào)節(jié)患者機(jī)體的免疫狀態(tài)，最終達(dá)到控制或治療免疫亢進(jìn)相關(guān)疾病的目的。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突