10 173例檢測乙型肝炎標(biāo)本的血清學(xué)與核酸結(jié)果分析*

劉海艇 鄧智華 蔡丹 孟芹 桂嶸 王勇軍 凌鋒 王海燕 陳軍浩 王順 謝華斌 黃麗芳 王占科 李志波 程金鳳 焦巍 唐曙明 謝小兵 江小工 陳亞軍 周紅霞 駱群 黃遠(yuǎn)帥 周明 呂小英

乙型肝炎是由HBV經(jīng)血液、母嬰和性接觸等傳播途徑感染人體所致的急、慢性肝臟炎性病變。2020年7月27日，WHO公布的數(shù)據(jù)顯示乙型肝炎流行率最高的是世衛(wèi)組織西太平洋區(qū)域和世衛(wèi)組織非洲區(qū)域，成年人感染率分別為6.2%和6.1%[1]。中國作為全球乙型肝炎高發(fā)的國家，在慢性乙型肝炎，乙型肝炎后肝硬化和原發(fā)性肝癌的治療上花費巨大的成本[2]。所以乙型肝炎篩查在乙型肝炎防治工作中具有重大的意義。

乙型肝炎檢測主要包括HBV血清學(xué)標(biāo)志物檢測及HBV DNA檢測[3]，傳統(tǒng)的慢性HBV感染檢測是針對血清中HBsAg。越來越多資料和研究表明，無論是急性自限性肝炎，還是成功進(jìn)行抗HBV治療后慢性乙型肝炎患者，HBsAg清除后部分患者肝組織中仍可檢出HBV DNA，而HBsAg及HBeAg無反應(yīng)性，而血清中可檢測到低水平HBV DNA或肝組織檢測出乙肝病毒環(huán)狀部分雙鏈DNA（HBV rcDNA）和（或）共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）稱隱匿性HBV感染（Occult hepatitis B infection，OBI），OBI患者的肝臟損害并沒有停止，仍可進(jìn)展為肝硬化或肝癌[4，5]。既往有HBV感染史、免疫抑制或化療狀態(tài)的OBI感染者可能會發(fā)生OBI的重新激活，即重新啟動病毒復(fù)制[4-6]。曾有研究報道，獻(xiàn)血人群中存在OBI供血者，導(dǎo)致輸血后的HBV傳播[7]。核酸檢測是直接檢測病毒基因組，被報道對OBI有較好的檢出效果。為了保障血源安全，我國在2010年開展了HBV核酸檢測血液篩查試點工作，并于2015年將其正式納入血液篩查范疇[8]。

目前，國內(nèi)HBV DNA檢測用于臨床HBV篩查的研究較少，醫(yī)療機構(gòu)仍然以HBsAg檢測為主，為了探討HBV DNA檢測的臨床意義。我們進(jìn)行了一項多中心臨床試驗研究，收集了23家單位HBV血清學(xué)及核酸檢測結(jié)果，經(jīng)嚴(yán)格的納入與排除標(biāo)準(zhǔn)，分析了HBsAg無反應(yīng)性標(biāo)本中的 HBV DNA定性檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)HBV核酸檢測能從HBsAg無反應(yīng)性標(biāo)本檢出一定比率的乙型肝炎患者，特別對OBI患者具有較好的檢出效果。

材料與方法

1 研究對象 收集2019年10月～2020年6月期間，全國23家醫(yī)院標(biāo)本的HBV血清學(xué)和核酸檢測結(jié)果信息。首次納入標(biāo)準(zhǔn)：血清學(xué)檢測HBsAg無反應(yīng)性。二次納入標(biāo)準(zhǔn)（同時滿足以下條件）：①血清HBV DNA定性檢測陽性；②進(jìn)行了HBsAb、HBeAg、HBeAb和HBcAb血清學(xué)標(biāo)志物檢測。

2 倫理審查聲明 本研究已在ClinicalTrials.gov注冊（注冊號為NCT04471688）。并通過了中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查批準(zhǔn)（批件號為2019-S483）。

3 試劑與方法

3.1 HBV DNA定性檢測：按照乙型肝炎病毒核酸檢測試劑盒（PCR-熒光法）（圣湘生物科技股份有限公司）說明書對標(biāo)本進(jìn)行核酸提取與HBV DNA定性檢測，最低檢出限（Limit Of Detection, LOD）為3 IU/mL，經(jīng)過了國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心批準(zhǔn)的康徹斯坦血清盤驗證，在0.5倍LOD、1倍LOD與3倍LOD時均能100%檢出。每份標(biāo)本取樣量0.96 mL，在全自動核酸提取儀Hamilton STAR進(jìn)行核酸提取。提取結(jié)束后，核酸與磁珠一起加入到50 μL PCR反應(yīng)體系中，封好膜，放入PCR儀樣品槽進(jìn)行檢測。

3.2 HBV血清學(xué)標(biāo)志物檢測試劑及方法：23家醫(yī)院采購的HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb和HBcAb血清學(xué)標(biāo)志物檢測試劑來自雅培、安圖、羅氏、希森美康、科美、北京萬泰、廈門新創(chuàng)、愛康、英科新創(chuàng)、珠海麗珠、邁瑞、廣州豐華、貝克曼、科華、蘇州新波、長光、邁克和VITROS，血清學(xué)標(biāo)志物檢測方法學(xué)分為化學(xué)發(fā)光免疫分析法和ELISA法。

4 統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)使用描述性統(tǒng)計進(jìn)行總結(jié)。表示為例數(shù)和比值[n（%）]。

結(jié) 果

1 HBV血清學(xué)及核酸檢測標(biāo)本研究數(shù)據(jù)收集 收集2019年9月～2020年6月期間全國23家單位10 173例標(biāo)本的HBV血清學(xué)和核酸檢測結(jié)果信息。經(jīng)首次納入及排除標(biāo)準(zhǔn)，納入HBsAg無反應(yīng)性檢測標(biāo)本共9 186例，進(jìn)行血清HBV DNA定性檢測結(jié)果分析。再對HBV DNA檢測為陽性標(biāo)本數(shù)據(jù)，經(jīng)二次納入及排除標(biāo)準(zhǔn)，最終納入HBV DNA陽性，HBsAg無反應(yīng)性，且進(jìn)行了HBsAb、HBeAg、HBeAb和HBcAb檢測的標(biāo)本168例（圖1）。

2 HBsAg 無反應(yīng)性標(biāo)本中的 HBV DNA定性檢測結(jié)果分析 如表1所示，10 173例HBV標(biāo)本的血清學(xué)與核酸檢測結(jié)果顯示：987例標(biāo)本呈HBsAg反應(yīng)性，其中HBsAg（+）HBV DNA（+）為888例（8.73%），HBsAg（+）HBV DNA（-）為99例（0.97%）；9 186例（90.30%）HBsAg無反應(yīng)性標(biāo)本中，HBsAg（-）HBV DNA（-）標(biāo)本為8 932例（87.8%），HBsAg（-）HBV DNA(+)為254例（2.77%）

表1 10 173例HBV標(biāo)本血清學(xué)與核酸檢測結(jié)果分析

3 168例HBsAg無反應(yīng)性標(biāo)本的HBV核酸定性分析 患者乙肝病毒DNA載量低時，HBsAg檢測易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。為了研究HBsAg假陰性結(jié)果與標(biāo)本HBV DNA核酸濃度的關(guān)系，我們對二次納入的168例HBsAg無反應(yīng)性標(biāo)本進(jìn)行了HBV DNA載量的分析。通過濃度已知的HBV標(biāo)準(zhǔn)品及其PCR檢測Ct值，我們構(gòu)建了HBV DNA濃度與Ct值的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2A）。對168例HBsAg無反應(yīng)性標(biāo)本進(jìn)行HBV DNA檢測的Ct值分析，發(fā)現(xiàn)166例（98.81%）標(biāo)本的HBV核酸檢測Ct值＞31（圖2B）。結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線分析，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)標(biāo)本HBV核酸濃度為低于200 IU/mL時，HBsAg檢測易出現(xiàn)假陰性，而HBV DNA檢測仍具有極好的準(zhǔn)確率。

4 168例HBsAg無反應(yīng)性標(biāo)本的血清學(xué)標(biāo)志物結(jié)果分析 二次納入的168例標(biāo)本的血清學(xué)標(biāo)志物結(jié)果分析，表明共有8種HBV血清學(xué)標(biāo)志物組合模式（見表2），其中模式1[僅HBsAb，HBcAb為反應(yīng)性]為27例（16.07%），模式2[僅HBsAb、HBeAb、HBcAb為反應(yīng)性]為23例（13.69%），模式3[僅HBeAb、HBcAb為反應(yīng)性]為26例（15.48%），模式4[僅HBcAb為反應(yīng)性]為18例（10.71%），模式5[HBV血清學(xué)標(biāo)志物全無反應(yīng)性]為15例（8.93%），模式6[僅HBsAb、HBeAb為反應(yīng)性]為7例（4.17%）,模式7（僅HBsAb為反應(yīng)性）為48例（28.57%），模式8（僅HBeAb為反應(yīng)性）為4例（2.38%）。

另外，168例標(biāo)本中無任何血清學(xué)標(biāo)志物反應(yīng)的15例（8.93%）；抗-HBc反應(yīng)性有94例（55.95%），抗-HBc無反應(yīng)性為74例（44.05%）；同時，全部的168例標(biāo)本中HBeAg均為無反應(yīng)性，說明HBV核酸檢測能防止HBeAg（-）慢性乙型肝炎漏檢。

討 論

精確的乙型肝炎病毒篩查技術(shù)，在乙型肝炎嚴(yán)重流行的我國極為重要[9，10]。雖然，目前我國大部分醫(yī)院采用的乙型肝炎血清學(xué)標(biāo)志物檢測方法（化學(xué)發(fā)光免疫分析法及ELISA法）敏感度及特異度均較高[11]，但對乙型肝炎免疫窗口期患者、OBI患者和HBeAg（-）慢性乙型肝炎患者的檢出率仍不理想。而且乙型肝炎患者經(jīng)過治療后，其乙型肝炎核心抗體和乙型肝炎表面抗原抗體可能長時間存在，加上乙型肝炎病毒基因突變等問題，單純的HBV血清學(xué)標(biāo)志物檢測方法，可能無法滿足臨床上對乙型肝炎篩查需要。核酸篩查是直接基因組檢測，被認(rèn)為是病原體檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，有報道稱HBV核酸檢測對于OBI和窗口期感染等HBV潛在患者檢出非常重要[12]。

表2 HBsAg無反應(yīng)性,血清HBV DNA定性檢測陽性患者血清學(xué)標(biāo)志物模式

本研究中，我們共收集了全國23家單位的10 173例標(biāo)本的HBV血清學(xué)及核酸檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)9 820例（96.53%）HBsAg與HBV DNA檢測結(jié)果一致，與前人研究的兩種檢測方法結(jié)果一致性比率相似[13]。檢測結(jié)果不一致標(biāo)本中，99例（0.97%）標(biāo)本檢測為HBsAg（+）HBV DNA（-），可能與HBsAg假陽性或者治療后患者病毒載量太低無法檢出核酸有關(guān)[14]。同時，我們對二次納入的168例HBsAg（-）HBV DNA（+）樣品，進(jìn)行了HBV核酸濃度定量和Ct值分布分析，發(fā)現(xiàn)166例樣品的HBV DNA濃度低于200 IU/mL。OBI患者的HBsAg為無反應(yīng)性，且HBV核酸濃度通常低于200 IU/mL[15]，因此，我們推測這166例（98.81%）為OBI患者標(biāo)本，且HBV DNA檢測對OBI患者具有很好的檢出效果。其次，168例樣品中抗-HBc反應(yīng)性O(shè)BI患者有94例（55.95%），而無HBeAg反應(yīng)性標(biāo)本，暗示可能存在一定比率的HBeAg（-）慢性乙型肝炎患者。HBeAg（-）慢性乙型肝炎是指乙型肝炎病毒出現(xiàn)C區(qū)變異或核心區(qū)啟動子變異，表現(xiàn)為乙型肝炎e抗原不能表達(dá)故不能在血清學(xué)中被檢出，但同時由于核心抗原和e抗原有交叉反應(yīng)，在血清中卻可以查到乙型肝炎e抗體[16]，因此，HBV核酸檢測是防止HBeAg（-）慢性乙型肝炎漏檢主要手段之一。另外，我們發(fā)現(xiàn)了15例無任何血清學(xué)反應(yīng)的HBV DNA陽性標(biāo)本，說明可能存在新型的乙型肝炎患者，產(chǎn)生了突變的抗原或抗體而不被現(xiàn)有的血清學(xué)免疫試劑所識別，但也不能排除可能由于檢測過程導(dǎo)致的誤差，或者新的免疫學(xué)產(chǎn)生或病毒突變等因素。

綜上所述，HBV DNA檢測能從HBsAg無反應(yīng)性標(biāo)本中有效發(fā)現(xiàn)低病毒載量的乙型肝炎患者，特別是能有效檢出OBI和HBeAg（-）慢性乙型肝炎患者，防止血清學(xué)漏檢。OBI患者和HBeAg（-）慢性乙型肝炎患者，均可發(fā)生乙型肝炎病毒激活，導(dǎo)致肝硬化、肝癌和肝衰竭等終末期肝病的風(fēng)險[15，17]。因此，臨床上我們建議普及HBV DNA篩查。本研究存在一定的局限性，比如各研究單位檢測血清學(xué)指標(biāo)的方法學(xué)及試劑的不統(tǒng)一，實驗室條件不同可能造成實驗結(jié)果存在誤差等。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突