多中心HBV、HCV、HIV血清學(xué)檢測弱反應(yīng)性標(biāo)本的核酸檢測結(jié)果分析*

董航 黃雪原 賀理 黃麗芳 鄧中平 王海燕 王勇軍 王順 凌鋒

2019年國家衛(wèi)生計(jì)生委疾病預(yù)防控制局的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，全國乙型病毒性肝炎發(fā)病100.2萬例，丙型病毒性肝炎發(fā)病22.4萬例和艾滋病發(fā)病7.1萬例[1]。這些傳染性疾病為患者和國家?guī)沓林氐慕?jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。臨床上，對傳染性病原體進(jìn)行早期篩查有利于相關(guān)疾病的早期診斷與治療，以防止病原體對機(jī)體的進(jìn)一步侵害。目前，國內(nèi)外主要通過血清學(xué)檢測和病毒核酸檢測來輔助診斷病原體感染。

血清學(xué)檢測方法主要包括ELISA、膠體金和化學(xué)發(fā)光法。其中化學(xué)發(fā)光與前兩種方法相比具有靈敏度高、能定量分析等優(yōu)點(diǎn)。它能更好地檢出位于窗口期和隱性感染的人群，對臨床輸血、流行病學(xué)研究、動態(tài)觀察病情和治療具有非常重要的意義[2]。但是隨著化學(xué)發(fā)光法靈敏度的增高，特異性降低，因而可能會導(dǎo)致很多假陽性結(jié)果。檢測下限的降低，使一些弱反應(yīng)性標(biāo)本在定性的判讀上難以把握，從而給臨床的分析和解釋工作帶來了不便。

血清學(xué)檢測結(jié)果的判讀是根據(jù)被測物的吸光度（S）同臨界值（CO）的比值（S/CO）來決定，一般S/CO＞1判定為反應(yīng)陽性；S/CO＜1則判定為陰性。而弱反應(yīng)性是指處于陽性S/CO判定值附近，臨床意義為可疑標(biāo)本[3]。臨床檢驗(yàn)人員在實(shí)際工作中發(fā)現(xiàn)，檢測結(jié)果呈弱反應(yīng)性的標(biāo)本檢測重復(fù)性差，對這些結(jié)果的報(bào)告和處理一直困擾著臨床檢驗(yàn)人員。同時(shí)，由于各生產(chǎn)廠家檢測試劑存在材料、技術(shù)的差異，導(dǎo)致檢測結(jié)果也存在差異。目前國內(nèi)各醫(yī)療及檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)對弱反應(yīng)性范圍設(shè)定未達(dá)成一致，各實(shí)驗(yàn)室根據(jù)自身檢測結(jié)果設(shè)置合理“灰區(qū)”，對弱反應(yīng)性結(jié)果應(yīng)進(jìn)行復(fù)檢或采用其他檢測方法以確定最終檢驗(yàn)結(jié)果，以減少假陽性標(biāo)本的誤診率和假陰性標(biāo)本的漏診率。

本研究旨在對HBV、HCV、HIV血清學(xué)檢測結(jié)果呈弱反應(yīng)性的標(biāo)本進(jìn)行核酸檢測復(fù)核，分析核酸檢測對血清學(xué)弱反應(yīng)性標(biāo)本結(jié)果判斷的指導(dǎo)性意義。

對象與方法

1 研究對象 在參加多中心研究的單位中，有5家醫(yī)療機(jī)構(gòu)提供HBV、HCV、HIV血清學(xué)檢測的“灰區(qū)范圍”。連續(xù)收集2019年10月1日～2020年6月30日期間5家醫(yī)療機(jī)構(gòu)進(jìn)行輸血前感染性疾病篩查/術(shù)前感染性疾病篩查患者的血清或血漿標(biāo)本共5 782例。本研究已在ClinicalTrials.gov注冊（注冊號為NCT04471688）。并獲得了中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（批件號為2019-S483）。

2 試劑與儀器 全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及其配套抗體試劑盒 （A試劑、B試劑、C試劑）， 全自動核酸提取儀，核酸檢測擴(kuò)增儀，乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒（1+2）三聯(lián)核酸檢測試劑盒（圣湘生物科技股份有限公司）。

3 方法 所有檢測和結(jié)果判斷均嚴(yán)格按儀器及試劑操作說明進(jìn)行。收集的血清或血漿標(biāo)本均進(jìn)行化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測，各實(shí)驗(yàn)室通過大量樣本篩查確認(rèn)實(shí)驗(yàn)及數(shù)據(jù)分析確認(rèn)“灰區(qū)”范圍，對弱反應(yīng)性結(jié)果標(biāo)本進(jìn)行核酸檢測。在本研究的核酸檢測中，HBV核酸檢測循環(huán)閾值（Cycle threshold，Ct值）≤45為陽性，最低檢測限為3 IU/mL；HCV核酸檢測Ct≤45為陽性，最低檢測限為10 IU/mL；本研究HIV核酸檢測Ct≤45為陽性，最低檢測限為45 IU/mL。

結(jié) 果

1 不同醫(yī)療機(jī)構(gòu)化學(xué)發(fā)光法檢測感染性疾病的陽性檢出值及“灰區(qū)”范圍 本研究在5家醫(yī)療機(jī)構(gòu)共收集并檢測5 782例標(biāo)本，其中53例乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、艾滋病毒（HIV）血清學(xué)檢測結(jié)果呈弱反應(yīng)性。表1所示，各醫(yī)院使用化學(xué)發(fā)光試劑種類及各自的陽性檢出值及“灰區(qū)”范圍存在一定差異。

表1 五家醫(yī)療機(jī)構(gòu)化學(xué)發(fā)光法檢測感染性疾病的陽性判定標(biāo)準(zhǔn)及“灰區(qū)”范圍

2 HBV血清學(xué)弱反應(yīng)性標(biāo)本的核酸檢測結(jié)果 本研究共有HBV血清學(xué)弱反應(yīng)性標(biāo)本24例，均大于陽性檢出值0.05 IU/mL，其中15例結(jié)果為HBV核酸反應(yīng)陽性，另外9例結(jié)果為HBV核酸反應(yīng)陰性（表2）。

3 HCV血清學(xué)弱反應(yīng)性標(biāo)本的核酸檢測結(jié)果 在本研究中，HCV血清學(xué)弱反應(yīng)性標(biāo)本25例，22例大于陽性檢出值1 S/CO，25例均為HCV核酸檢測反應(yīng)陰性（表3）。

4 HIV血清學(xué)弱反應(yīng)性標(biāo)本的核酸檢測結(jié)果 本研究中HIV血清學(xué)弱反應(yīng)性標(biāo)本共4例，對這4例進(jìn)行核酸檢測，結(jié)果均呈陰性（表4）。

討 論

近年來,化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)廣泛應(yīng)用,是臨床上進(jìn)行感染性疾病篩查的重要檢測手段。但化學(xué)發(fā)光檢測病毒抗原或抗體的假陽性問題一直比較突出。標(biāo)本出現(xiàn)弱反應(yīng)性結(jié)果的原因有許多因素[4，5]：①HBV、HCV、HIV病毒處于感染早期即窗口期，或處于恢復(fù)末期，體內(nèi)雖有病毒復(fù)制，但病毒載量較低；②病毒基因變異；③鉤狀效應(yīng)；④試劑因素；⑤人為因素；⑥標(biāo)本不合格，都有可能對檢測結(jié)果造成影響。在本研究中，我們對血清學(xué)檢測結(jié)果出現(xiàn)弱反應(yīng)性的標(biāo)本進(jìn)行病毒核酸檢測。

HBV可引起急性和慢性乙肝、肝硬化和肝細(xì)胞癌[6]。目前，經(jīng)血液傳播的HBV風(fēng)險(xiǎn)明顯高于HCV和HIV，一般證明HBV感染是檢測患者體內(nèi)HBsAg和HBc抗體，或通過核酸檢測HBV DNA。一般在HBV病毒感染后30～60天可以檢測到HBsAg，但若是急性感染，在檢測HBsAg前幾周內(nèi)，患者病情發(fā)展為病毒血癥，病毒載量達(dá)到109～1010個(gè)/mL[7]。再通過抗病毒治療，患者血液中HBsAg消失或滴度降低，使用血清學(xué)試劑無法檢測。基于提高靈敏度和縮短窗口期的目的，HBV核酸檢測被用于感染性疾病篩查。統(tǒng)計(jì)學(xué)理論認(rèn)為弱反應(yīng)性標(biāo)本發(fā)生誤判、漏檢的概率約為50%[3]，各實(shí)驗(yàn)室根據(jù)自身?xiàng)l件設(shè)置“灰區(qū)”，正是為了減少或避免上述這種弱反應(yīng)性標(biāo)本結(jié)果誤診和漏檢現(xiàn)象的發(fā)生。在本研究中，血清學(xué)弱反應(yīng)性標(biāo)本的核酸反應(yīng)陽性率為62.5%，這在一定程度上證明化學(xué)發(fā)光法的靈敏度較高，同時(shí)也證明核酸的二次檢測能減少標(biāo)本結(jié)果報(bào)告假陽性的發(fā)生率。核酸檢測方法是目前血液HBV篩查已經(jīng)較成熟的檢測方法, 可檢測出血液中較低水平的HBV病毒載量, 且能檢測出HBV病毒的隱匿性感染、病毒亞型和病毒變異。

表2 HBV血清學(xué)弱反應(yīng)性標(biāo)本的核酸檢測情況

表3 HCV血清學(xué)弱反應(yīng)性標(biāo)本的核酸檢測情況

表4 HIV血清學(xué)弱反應(yīng)性標(biāo)本的核酸檢測情況

關(guān)于HCV檢測，在本研究中，弱反應(yīng)性標(biāo)本的核酸陽性率為0。一方面原因是三個(gè)醫(yī)療機(jī)構(gòu)均使用A公司的抗原抗體試劑盒，該試劑盒靈敏度較高，假陽性率也隨之升高，已有文獻(xiàn)結(jié)果表明使用A公司弱反應(yīng)性標(biāo)本假陽性率達(dá)到92%[8]，這與本研究結(jié)果相近。由于HCV在全球范圍內(nèi)廣泛流行，全球流行率約為3.0%[9]。在我國，在14 218 000名獻(xiàn)血者中，有40 000人篩查HCV抗體反應(yīng)性，其流行率約為0.28%[10]。同時(shí)有研究報(bào)道，在篩查HCV抗體反應(yīng)性的獻(xiàn)血者中，真正HCV確證陽性率約為10.9%[11]，這證明高靈敏度的血清學(xué)篩查在降低傳播HCV風(fēng)險(xiǎn)的同時(shí)，也增加了較多的假陽性結(jié)果。同時(shí)假陽性結(jié)果也會引起患者不必要的焦慮，進(jìn)而引發(fā)一些社會問題。如果對血清學(xué)篩查弱反應(yīng)性患者進(jìn)行核酸檢測，或許是解決該問題很好的途徑。另一方面則可能是標(biāo)本質(zhì)量及每個(gè)患者自身血清特異性。目前，國內(nèi)外學(xué)者對造成抗HCV抗體篩查假陽性的具體原因并未完全清楚，高濃度的非特異性IgG、類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、自身抗體、標(biāo)本溶血、標(biāo)本被細(xì)菌污染等因素均可能引起假陽性的檢測結(jié)果[12-14]，這些導(dǎo)致假陽性的因素還需進(jìn)一步深入研究。

在本研究中4例HIV血清學(xué)弱反應(yīng)性標(biāo)本的核酸陽性率為0。分析原因如下：目前我國HIV人群感染率為萬分之九[1]，處于低流行水平；血液篩查重點(diǎn)在于靈敏度，目的在于盡可能降低血液傳播感染性疾病的風(fēng)險(xiǎn)，眾所周知，在實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)水平相同的條件下，試劑的靈敏度越高，特異性越差，靈敏度較高的化學(xué)發(fā)光檢測可能會導(dǎo)致很多的假陽性問題。特別是當(dāng)COI＜10或S/CO＜1時(shí)，其假陽性率更高[15]。因此國內(nèi)血站普遍采用兩種血清學(xué)檢查加核酸檢測方式對HIV感染進(jìn)行確認(rèn)[16]。

綜上所述，核酸檢測相比血清學(xué)檢測，特異性更高，能直接檢測患者體內(nèi)的病原體。因此我們推薦檢測人員在面對血清學(xué)弱反應(yīng)性標(biāo)本時(shí)，宜進(jìn)行雙孔復(fù)檢，若均為陰性結(jié)果則報(bào)告陰性結(jié)果。若仍有反應(yīng)性（一孔或兩孔），宜進(jìn)行HBV、HCV、HIV（1+2）核酸檢測，臨床醫(yī)師宜結(jié)合接觸史、核酸檢測結(jié)果和其他檢驗(yàn)結(jié)果（如肝功能）來診斷和監(jiān)測治療效果，必要時(shí)4周后重新采樣檢測，觀察血清學(xué)和核酸指標(biāo)的變化情況。此外，本研究還存在以下不足之處：首先研究人群主要集中于南方地區(qū)，未包括北方地區(qū)的術(shù)前/輸血前患者；其次本研究五家醫(yī)療中心根據(jù)各中心檢測結(jié)果設(shè)置“灰區(qū)”，其界定的“低值陽性”標(biāo)準(zhǔn)不一，可能存在一定偏倚。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突