術(shù)前/輸血前患者乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒核酸檢測(cè)多中心研究*

程金鳳 焦巍 周紅霞 周俊 孟芹 凌鋒 蔡丹 黃遠(yuǎn)帥 鄧智華 王順 陳亞軍 唐曙明 謝小兵 李志波 黃麗芳 王占科 呂小英 江小工 謝華斌 周明 駱群 王勇軍 桂嶸 陳軍浩 王海燕

《中華人民共和國(guó)傳染病防治法》及《醫(yī)療機(jī)構(gòu)傳染病預(yù)檢分診管理辦法》均對(duì)醫(yī)院內(nèi)感染性病原體檢測(cè)提出明確要求，而對(duì)手術(shù)及輸血患者進(jìn)行感染性病原體檢測(cè)，不僅是感染性疾病預(yù)檢、分診制度的要求，還可以有效避免患者的交叉感染、降低醫(yī)生職業(yè)感染風(fēng)險(xiǎn)、避免醫(yī)療糾紛以及盡早發(fā)現(xiàn)并治療感染者以控制感染傳播。《臨床輸血技術(shù)規(guī)范》要求輸血患者在輸血前進(jìn)行HBsAg、Anti-HCV、Anti-HIV 1/2、及梅毒螺旋體抗體檢測(cè)，但血清學(xué)檢測(cè)方法存在窗口期長(zhǎng)、漏檢風(fēng)險(xiǎn)及假陽(yáng)性結(jié)果等問(wèn)題。采供血機(jī)構(gòu)近幾年的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，HBV、HCV、HIV兩遍酶免檢測(cè)無(wú)反應(yīng)性的標(biāo)本中仍有一定比例核酸檢測(cè)陽(yáng)性[1]。因此，2019版的《血站技術(shù)操作規(guī)程》規(guī)定HBV、HCV和HIV感染標(biāo)志物應(yīng)至少采用核酸和血清學(xué)試劑各檢測(cè)一次。

目前對(duì)于手術(shù)/輸血的患者，國(guó)內(nèi)仍缺乏大樣本數(shù)據(jù)比較血清學(xué)與核酸檢測(cè)在HBV、HCV、HIV檢測(cè)中的優(yōu)劣。當(dāng)前對(duì)手術(shù)/輸血患者的HBV、HCV、HIV檢測(cè)仍以血清學(xué)檢測(cè)為主，為了探索核酸檢查在手術(shù)/輸血患者中HBV、HCV、HIV檢測(cè)的意義，本研究收集了來(lái)自全國(guó)23家臨床醫(yī)療機(jī)構(gòu)的10 000余份術(shù)前/輸血前患者血液樣本，對(duì)其進(jìn)行HBV、HCV、HIV血清學(xué)與核酸檢測(cè)的對(duì)比分析，旨在探討在術(shù)前/輸血前患者中開(kāi)展HBV、HCV、HIV核酸檢測(cè)的意義。

材料與方法

1 一般資料 收集2019年10月～2020年6月間23家臨床醫(yī)療機(jī)構(gòu)術(shù)前/輸血前HBV、HCV、HIV篩查血液樣本，并同時(shí)收集患者的臨床信息（科室、性別、年齡、病種等）、血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果（至少包括HBsAg、Anti-HCV、HIV Ag/Ab）、血清學(xué)檢測(cè)方法和標(biāo)本類型等基本信息。本研究已在ClinicalTrials.gov注冊(cè)（注冊(cè)號(hào)為NCT04471688）。本研究的設(shè)計(jì)和方法符合相關(guān)法規(guī)和倫理原則要求，并獲得了中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批件號(hào)為2019-S483）。

2 核酸檢測(cè) 使用熒光PCR法對(duì)所有樣本進(jìn)行HBV DNA、HCV RNA和HIV-1/2 RNA檢測(cè)。核酸提取在全自動(dòng)核酸提取儀Hamilton STAR上進(jìn)行，核酸擴(kuò)增儀的型號(hào)為ABI7500。核酸檢測(cè)按照HBV、HCV、HIV-1/2核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光法）（圣湘生物科技股份有限公司）說(shuō)明書(shū)對(duì)樣本進(jìn)行操作。HBV DNA、HCV RNA、HIV（1+2）RNA的最低檢出限（Limit Of Detection, LOD）分別為3 IU/mL、10 IU/mL、45 IU/mL；用國(guó)家臨檢中心通用質(zhì)控品對(duì)比檢測(cè)，均有較高的檢出率，見(jiàn)表1。血清學(xué)和核酸檢測(cè)方法分析流程見(jiàn)圖1。

表1 不同廠家試劑檢測(cè)臨床樣本的情況

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用表示，計(jì)數(shù)資料用率或例數(shù)表示，率的比較采用卡方檢驗(yàn)（理論頻數(shù)小于1時(shí)采用Fisher確切概率檢驗(yàn)，理論頻數(shù)大于1且小于5時(shí)采用連續(xù)性校正卡方檢驗(yàn)，理論頻數(shù)大于5時(shí)采用Pearson卡方檢驗(yàn)），一致性分析采用kappa檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 納入樣本的基本情況 從全國(guó)23家臨床醫(yī)療機(jī)構(gòu)，共收集術(shù)前/輸血前HBV、HCV、HIV篩查血液樣本11 346例，有效檢測(cè)10 173例。其中具有完整臨床信息的樣本9 509例，根據(jù)這部分信息分析，此次研究納入樣本的年齡范圍為0～98歲，平均年齡為48.78歲，男性3 829例（40.27%），女性5 680（59.73%）。不同地域收集樣本比例為：華東11.81%、華南8.12%、華中77.03%、西南3.05%。不同標(biāo)本類型所占比例：血清標(biāo)本56.93%、血漿標(biāo)本39.97%、血漿或血清標(biāo)本3.11%。不同血清學(xué)檢測(cè)方法所占比例：酶免法10.77%、化學(xué)發(fā)光法83.56%、酶免法或化學(xué)發(fā)光法5.66%。不同等級(jí)醫(yī)療機(jī)構(gòu)所占比例：二甲?？?.86%、二甲綜合2.63%、三甲專科4.81%、三甲綜合89.70%。詳見(jiàn)表2。

2 血清學(xué)及核酸檢測(cè)方法的結(jié)果比較 HBV血清學(xué)有反應(yīng)率及核酸檢測(cè)陽(yáng)性率分別為9.70%、11.23%，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。HCV血清學(xué)有反應(yīng)率及核酸檢測(cè)陽(yáng)性率分別為0.76%、0.33%，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。HIV血清學(xué)有反應(yīng)率及核酸檢測(cè)陽(yáng)性率分別為0.14%、0.09%，兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.180）。HBV、HIV、HCV血清學(xué)及核酸檢測(cè)一致性分別為很好、較高、一般，kappa值分別為0.815、0.608、0.484。不同血清學(xué)方法對(duì)HBV、HIV、HCV的檢測(cè)與核酸方法的一致性，化學(xué)發(fā)光法優(yōu)于酶免法。詳見(jiàn)表3。

3 血清學(xué)及核酸檢測(cè)方法不一致結(jié)果分析 所有樣本中，一致性結(jié)果共9 754例，占比95.88%；不一致的結(jié)果共有419例，占比4.12%。不一致標(biāo)本中，血清學(xué)無(wú)反應(yīng)性、核酸陽(yáng)性結(jié)果263例，其中HBsAg無(wú)反應(yīng)性、HBV DNA陽(yáng)性254例；Anti-HCV無(wú)反應(yīng)性、HCV RNA陽(yáng)性7例；HIV Ag/Ab無(wú)反應(yīng)性、HIV RNA陽(yáng)性2例，結(jié)果見(jiàn)表4。血清學(xué)反應(yīng)性、核酸陰性結(jié)果156例，其中HBsAg反應(yīng)性、HBV DNA陰性99例；Anti-HCV反應(yīng)性、HCV RNA陰性50例；HIV Ag/Ab反應(yīng)性 、HIV RNA陰性7例，結(jié)果見(jiàn)表4。

討 論

我國(guó)是肝病大國(guó)，2019年中國(guó)疾病預(yù)防控制中心統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示[2]，在乙類傳染病中病毒性肝炎的報(bào)告發(fā)病率位列首位，報(bào)告死亡率位列第三，其中乙肝的報(bào)告發(fā)病率為71.77/10萬(wàn)、丙肝為16.02/10萬(wàn)。此外，盡管我國(guó)艾滋病的報(bào)告發(fā)病率不高，但其報(bào)告死亡率卻是所有感染性疾病之首，達(dá)到了 1.50/10萬(wàn)[2]。而對(duì)我國(guó)東北地區(qū)人群的流行病學(xué)調(diào)查[3]顯示HBV或HCV感染者知道自己被感染的人數(shù)不到一半。因此，提高HBV、HCV、HIV的檢出率不僅有利于感染性疾病防控，還可以促進(jìn)患者及早就診，從而減輕疾病負(fù)擔(dān)。

表2 納入研究樣本的基本情況

表3 兩種檢測(cè)方法檢測(cè)出有反應(yīng)性樣本情況

表4 血清學(xué)及核酸檢測(cè)方法不一致結(jié)果

盡管目前血清免疫學(xué)方法在病原體的篩查中仍占有重要地位，但不能否認(rèn)的是其仍無(wú)法解決由于個(gè)體免疫差異、病毒變異及病毒亞種所造成的檢測(cè)窗口期長(zhǎng)、漏檢等問(wèn)題[4-7]。因此為了防止漏檢造成HBV、HCV、HIV的輸血傳播，我國(guó)在2015年實(shí)施對(duì)獻(xiàn)血者進(jìn)行核酸檢測(cè)[8]。近年來(lái)越來(lái)越多的研究表明核酸檢測(cè)能有效提高無(wú)償獻(xiàn)血者樣本中HBV、HCV、HIV的檢出率，降低輸血感染殘余風(fēng)險(xiǎn)[1,9]。但是對(duì)于術(shù)前及輸血前患者的HBV、HCV、HIV檢測(cè)，仍以血清學(xué)檢測(cè)為主，目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)對(duì)比血清學(xué)與核酸檢測(cè)在該人群中應(yīng)用價(jià)值的大規(guī)模數(shù)據(jù)分析。本研究運(yùn)用血清學(xué)及核酸檢測(cè)方法對(duì)10 173例術(shù)前/輸血前患者血液樣本HBV、HCV、HIV進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，9 095例血清學(xué)無(wú)反應(yīng)性樣本中有263例（2.89%）核酸檢測(cè)陽(yáng)性（其中HBsAg無(wú)反應(yīng)性、HBV DNA陽(yáng)生254例；Anti-HCV無(wú)反應(yīng)生、HCV RNA陽(yáng)性7例；HIV Ag/Ab無(wú)反應(yīng)性、HIV RNA陽(yáng)性2例）。對(duì)獻(xiàn)血者也有研究報(bào)道[9]對(duì)75 563例血清學(xué)檢測(cè)合格的獻(xiàn)血者進(jìn)行核酸檢測(cè)，檢出HBV DNA陽(yáng)性90例（0.12%），說(shuō)明術(shù)前/輸血前患者HBV、HCV和HIV檢出率要高于獻(xiàn)血者人群。那么，核酸檢測(cè)對(duì)于提高術(shù)前/輸血前患者HBV、HCV和HIV檢出率有著重要意義。隨著核酸檢測(cè)技術(shù)，尤其是PCR技術(shù)的應(yīng)用以及成本的下降，將PCR技術(shù)用于HBV、HCV、HIV篩查將得到普及。也相信隨著基于CRISPR的核酸檢測(cè)技術(shù)、核酸質(zhì)譜分析技術(shù)和紙基分析技術(shù)等核酸快速檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，未來(lái)廣大患者必將享受到更為精準(zhǔn)的核酸檢測(cè)技術(shù)服務(wù)[10-12]。

用血清學(xué)方法進(jìn)行術(shù)前/輸血前患者HBV、HCV、HIV的檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果的反應(yīng)性并不能真實(shí)反應(yīng)疾病狀態(tài)，HBV、HCV既往一過(guò)性感染可造成反應(yīng)性結(jié)果的持續(xù)存在，如在使用抗病毒藥物治療后，即使HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA已低于檢出限，但血清學(xué)檢測(cè)仍可呈反應(yīng)性。HBsAg、Anti-HCV和anti-HIV作為定性檢測(cè)時(shí)，臨界值附近結(jié)果也常常給臨床造成困擾。如研究者[13]發(fā)現(xiàn)首次HBsAg、Anti-HCV和anti-HIV酶免法檢測(cè)結(jié)果為弱反應(yīng)性值（處于臨界值與臨界值的90%之間）的樣本，酶免法復(fù)測(cè)反應(yīng)性樣本的占比可達(dá)58.8%。而對(duì)于反應(yīng)性低值樣本，其檢測(cè)結(jié)果的可信度往往也較差[14,15]。另外，血液中的藥物、血清蛋白、嗜異性抗體和人抗動(dòng)物抗體等也可造成血清學(xué)檢測(cè)的假陽(yáng)性結(jié)果[16,17]。目前丙肝抗病毒治療已經(jīng)進(jìn)入直接抗病毒藥物（direct-acting antiviral agents，DAA）的泛基因時(shí)代，大部分丙肝已經(jīng)可以治愈，而丙肝病毒抗體檢測(cè)并不能很好區(qū)分現(xiàn)癥感染患者和已治愈患者[18,19]。所以，核酸檢測(cè)用于丙肝的篩查和檢測(cè)更為精準(zhǔn)。對(duì)于HBV和HIV，目前有多種抗病毒藥物能有效的將患者體內(nèi)病毒載量維持在較低水平，因此服用抗病毒藥物的患者可出現(xiàn)核酸陰性而血清學(xué)反應(yīng)性結(jié)果。本研究發(fā)現(xiàn)，有10.03%（99/987）HBsAg反應(yīng)性的患者HBV DNA陰性，其中69例為接受抗病毒治療的患者。7例HIV Ag/Ab反應(yīng)性而HIV RNA陰性患者中，2例為正在進(jìn)行HIV治療的患者，5例經(jīng)確認(rèn)為血清學(xué)假陽(yáng)性患者。應(yīng)用血清學(xué)方法篩查感染性病原體的模式由來(lái)已久，但由于其特異性差、干擾因素多，因此其反應(yīng)性結(jié)果往往還需血清學(xué)確認(rèn)方法加以印證，而多數(shù)血清學(xué)確認(rèn)方法操作繁瑣，且由于針對(duì)的是與篩查方法同樣的檢測(cè)對(duì)象（如血清抗體），因此也無(wú)可避免的受到患者免疫力下降、病原體變異造成的漏檢風(fēng)險(xiǎn)。核酸檢測(cè)直接針對(duì)病原體核酸序列進(jìn)行檢測(cè)，所受干擾因素少且靈敏度高，正逐漸成為未來(lái)病毒檢測(cè)的趨勢(shì)和方向。

本研究選擇靈敏度較高并且經(jīng)國(guó)家臨檢中心提供的通用質(zhì)控品驗(yàn)證，有較好檢出水平的核酸檢測(cè)試劑，保證了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，也保證了本研究的科學(xué)性和客觀性。

綜上所述，運(yùn)用核酸檢測(cè)技術(shù)對(duì)手術(shù)/輸血患者進(jìn)行HBV、HCV、HIV檢測(cè)可以縮短檢測(cè)窗口期、提高病原體的檢出率及檢測(cè)的準(zhǔn)確性。對(duì)于核酸與血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果不一致的患者，應(yīng)充分了解患者病史，特別是抗病毒治療史，進(jìn)行正確的結(jié)果解讀與分析。核酸檢測(cè)不僅可以檢測(cè)病毒載量還可以對(duì)病毒進(jìn)行分型，在抗病毒治療評(píng)估中被廣泛應(yīng)用，但抗病毒藥物有時(shí)也可使病毒載量低于核酸檢測(cè)下限。因此，若患者在進(jìn)行HBV、HCV、HIV檢測(cè)前曾使用過(guò)抗病毒藥物，也可在核酸檢測(cè)的基礎(chǔ)上增加血清學(xué)檢測(cè)。此外，本研究的實(shí)施存在以下局限性：首先，研究人群主要集中于南方地區(qū)，未能囊括北方地區(qū)的術(shù)前/輸血前患者；其次，收集樣本總數(shù)為11 346例，由于某些樣本量的缺乏，影響了核酸的檢測(cè)，從而造成了部分樣本核酸檢測(cè)結(jié)果的丟失；最后，部分血清學(xué)和核酸檢測(cè)不一致的病例仍在繼續(xù)進(jìn)行跟蹤隨訪。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突