超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定食品中維生素D

王多嬌　顏春榮　徐春祥

摘要 [目的]建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定食品中維生素D含量的分析方法。[方法]樣品經(jīng)氫氧化鉀-乙醇溶液皂化、正己烷萃取、濃縮后，采用Agilent XDB-C18色譜柱分離、10 mmol/L甲酸銨甲醇-水溶液等度洗脫，經(jīng)電噴霧正離子多反應(yīng)監(jiān)測模式進行檢測，內(nèi)標(biāo)法定量。[結(jié)果]維生素D2和D3在5～500 ng/mL線性關(guān)系良好，二者檢出限為2 μg/kg，定量限為5 μg/kg。在各濃度水平下，二者的回收率為83.1%～105.4%，RSD為4.3%～8.7%。[結(jié)論]該方法準(zhǔn)確性好、靈敏度高，適用于食品中維生素D的分析測定。

關(guān)鍵詞 維生素D;食品;超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）

中圖分類號 TS207.3文獻標(biāo)識碼 A文章編號 0517-6611（2020）22-0190-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.22.051

Determination of Vitamin D in Foodstuffs by UPLC-MS/MS

WANG Duo-jiao，YAN Chun-rong，XU Chun-xiang

（Jiangsu Institute for Food and Drug Control，Nanjing，Jiangsu 210008）

Abstract [Objective] To establish an analytical method for the determination of vitamin D in foodstuffs by ultra-high performance liquid chromatography tandem quadrupole mass spectrometry method.[Method]The sample was saponified by potassium hydroxide-ethanol solution and extracted by n-hexane， after being concentrated， the analytes were separated on Agilent XDB-C18 column， eluted by the mobile phase consisted of ammonium formate methanol solution and water and identified by ESI-MRM， meanwhile， quantitated by internal standard method. [Result]Vitamin D2 and D3 had a linear relationship between 5 and 500 ng/mL. The detection limit（LOD） was 2 μg/kg， and the limit of quantification（LOQ） was 5 μg/kg.The recoveries ranged from 83.1% to 105.4%， RSD was? 4.3% - 8.7%.[Conclusion]The method has good accuracy and high sensitivity， and is suitable for the analysis and determination of vitamin D in foodstuffs.

Key words Vitamin D;Foodstuffs;Ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）

作者簡介 王多嬌（1985—），女，江蘇豐縣人，高級工程師，碩士，從事食品安全研究。*通信作者，研究員級高級工程師，碩士，從事食品安全研究。

收稿日期 2020-04-04

維生素D是可以呈現(xiàn)膽鈣化固醇生物活性的所有固醇類衍生物的統(tǒng)稱，現(xiàn)已知的維生素D共有5種，其中生理功效比較顯著的是維生素D2和D3，GB 14880—2012[1]中規(guī)定允許添加的也是這2種。維生素D脂溶性強，在堿性、中性溶液中耐熱，不易被氧化，但光與酸能促進其異構(gòu)作用，一般應(yīng)儲存于無酸、無光、氮氣或無氧的冷環(huán)境中。

維生素 D 是

維持人體正常生長發(fā)育、骨骼和肌肉功能的重要物質(zhì)，對骨骼及視力發(fā)育、繁殖和免疫功能有重要影響[2-4]，但攝入過量的維生素D會引起中毒。GB 14880—2012中維生素D的允許添加量較低且對光敏感的性質(zhì)，給檢測帶來了挑戰(zhàn)。因此，建立準(zhǔn)確可靠、靈敏度高的食品中維生素D檢測方法尤為重要。有關(guān)維生素D的分析方法比較常用的是高效液相色譜法[5-11]，但該方法靈敏度不高、專屬性不強，對前處理要求較高。二維色譜的應(yīng)用，簡化了前處理步驟，但二維液相對儀器要求較高，目前二維色譜本身也并未推廣開來。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)具有靈敏度高、特異性強的特點，被越來越多地應(yīng)用于維生素D的測定中[12-17]。國標(biāo)對于普通食品中維生素D的測定也是采用液質(zhì)聯(lián)用法，但是對于配方食品的測定仍采用高效液相色譜法[18]。該研究優(yōu)化了樣品前處理方法，建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定普通食品及配方食品中維生素D的方法，采用同位素內(nèi)標(biāo)定量，有效降低了基質(zhì)干擾，提高了測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試材。

伊利金裝嬰兒配方奶粉、黃金搭檔中老年型多種維生素片、維維高鈣多維豆奶粉、伊利純牛奶，超市采購;不含維生素D的奶粉基質(zhì)，企業(yè)提供。

1.1.2 試劑。

α-淀粉酶，酶活力≥1.5 U/mg，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;氫氧化鉀、無水硫酸鈉、無水乙醇、石油醚30～60 ℃、乙醚、正己烷、氯化鈉、抗壞血酸，分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司;甲醇，色譜純，美國天地有限公司;去離子水;甲酸銨，色譜純，Aldrich。

維生素D2標(biāo)準(zhǔn)品：AccuStandard（純度≥98%）;維生素D3標(biāo)準(zhǔn)品：AccuStandard（純度≥98%）;內(nèi)標(biāo)d3-維生素D3：Aldrich（純度≥97%）。

1.1.3 儀器。

AE163電子分析天平，瑞士METTLER公司;Agilent 1290超高壓液相色譜儀，美國安捷倫公司;AB API 4000三重四極桿質(zhì)譜儀，美國AB Sciex公司;超聲波清洗機SB-5200DT，寧波新芝生物科技股份有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士BuchI公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司;Milli-Q純水儀，美國Millipore公司;振動混合器，上海青浦滬西儀器廠;氮吹儀（N-EVAP112），美國Organomation Association Inc。

1.2 試驗方法

1.2.1 溶液配制。

準(zhǔn)確稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品，分別用無水乙醇溶解并定容至100 mL 棕色容量瓶中。維生素D2和維生素D3標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制后需要通過紫外吸光度進行校正，具體步驟同GB 5009.82—2016附錄B，于-18 ℃ 下避光保存。根據(jù)需要用甲醇逐級稀釋，配成適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2 樣品提取。

稱取約5 g固體樣品或50 g液體樣品于250 mL三角瓶中，加入100 μL 1 μg/mL的d3-維生素D3溶液，加入1 g淀粉酶，固體樣品用約50 mL 50 ℃的溫水使其溶解并混勻，于60 ℃恒溫箱中溫孵30 min，取出后立即冷卻到室溫，向冷卻后的酶解液中加入1.5 g抗壞血酸、100 mL乙醇、25 mL濃度為1.25 g/mL的氫氧化鉀溶液，混勻，充氮排出空氣，蓋上瓶塞，將三角瓶置于80 ℃恒溫水浴內(nèi)皂化45 min，取出后立即冷卻到室溫。

將皂化后的溶液全部轉(zhuǎn)移到500 mL分液漏斗中，并用水清洗多次以轉(zhuǎn)移完全。在分液漏斗中加入約100 mL正己烷進行萃取，取正己烷層;重復(fù)萃取2次，合并正己烷溶液，用水洗4～5次至近中性。將正己烷溶液經(jīng)無水硫酸鈉過濾脫水，用500 mL圓底燒瓶收集所得到的濾液，于40 ℃充氮條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干。殘渣用正己烷轉(zhuǎn)移至試管中，40 ℃條件下氮氣吹干，加入5.0 mL 甲醇，超聲溶解殘渣，過0.22 μm有機膜待測定。

1.2.3 儀器條件。

1.2.3.1 色譜條件。色譜柱：Agilent XDB-C18（1.8 μm，2.1 mm×50 mm）;流動相：10 mmol/L甲酸銨甲醇溶液，等度洗脫;流速：0.2 mL/min;柱溫：30 ℃;進樣量：10 μL。

1.2.3.2 質(zhì)譜條件。離子源：電噴霧離子源（ESI）;掃描方式：正離子掃描;檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）;噴霧電壓：5 500 V;噴霧氣（GS1）氣壓為55 Pa，輔助氣（GS2）氣壓為45 Pa，氣簾氣（CUR）氣壓為20 Pa，碰撞氣（CAD）氣壓為12 Pa，離子源溫度為550 ℃，碰撞室入口電壓（EP）為10 V，碰撞室出口電壓（CXP）為15 V。維生素D2和D3的質(zhì)譜分析參數(shù)如表1所示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用美國AB Sciex公司的Analyst和MultiQuant軟件采集數(shù)據(jù)并進行定性定量分析，使用Microsoft Excel 2003進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理條件的優(yōu)化

2.1.1 淀粉酶對維生素D回收率的影響。

在其他試驗條件相同的情況下，同時測定加入和不加淀粉酶的樣品，結(jié)果顯示，添加淀粉酶的樣品回收率相對較高。淀粉酶可以使食品中的淀粉酶解，減少基質(zhì)干擾，提高回收率。另外，市售維生素D原料多數(shù)會經(jīng)過淀粉包埋以提高其穩(wěn)定性，淀粉酶有破包埋的作用，可以使淀粉包埋的維生素D游離出來。

2.1.2 皂化條件的選擇。

樣品能否被皂化完全直接影響測定的準(zhǔn)確性，考察不同的皂化溫度（53、65、75、80和85 ℃）和皂化時間（30、45和60 min）下維生素D的提取效率。結(jié)果顯示，在溫度達(dá)到80 ℃之前，維生素D的回收率隨著溫度的升高而增大，但當(dāng)溫度超過80 ℃后，回收率變小，這可能是因為當(dāng)溫度較低時，食品中脂類物質(zhì)含量較高，會出現(xiàn)皂化不完全的情況，而當(dāng)溫度達(dá)到85 ℃時，溶液中的乙醇達(dá)到其沸點，沸騰現(xiàn)象嚴(yán)重，反應(yīng)過于劇烈。綜合考慮，維生素D的皂化溫度設(shè)定為80 ℃。皂化時間方面，皂化30 min時，回收率最高，這可能是因為隨著皂化時間的延長，維生素D發(fā)生了降解，綜合考慮，30 min為最適合的皂化時間。

2.1.3 提取溶劑的選擇。

在其他條件相同的情況下，分別考察石油醚、乙醚、正己烷作為提取溶劑的提取回收率。乙醚和皂化液互溶，乳化嚴(yán)重，難以分層，回收率較低;正己烷也存在乳化現(xiàn)象，但加入適量無水乙醇，因為乙醇可以促進蛋白沉淀，會加速分層，且正己烷較石油醚的回收率高，因而選擇正己烷作為提取溶劑。

2.2 色譜條件的選擇

試驗比較了APCI[19]和ESI[20-21]正離子模式下維生素D2和D3的響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)ESI正離子模式下待測物質(zhì)響應(yīng)較好，分子離子峰豐度較高，因而選擇ESI+模式。

正離子模式下，乙腈會存在一定的離子抑制作用，而甲醇靈敏度較高，因而選擇甲醇作為流動相。比較了甲醇-水、甲酸銨甲醇-水、甲酸甲醇-水、乙酸銨甲醇-水的流動相體系，發(fā)現(xiàn)流動相為甲酸銨甲醇-水時，待測物質(zhì)響應(yīng)較好。圖1為上述色譜質(zhì)譜條件下獲得的維生素D2和D3標(biāo)準(zhǔn)溶液MRM色譜圖。

2.3 線性范圍和檢出限

分別配制維生素D2和D3濃度為5、10、20、100、200 和500 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，以待測物質(zhì)與內(nèi)標(biāo)色譜峰峰面積比值為縱坐標(biāo)、待測物質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)繪制維生素D2、維生素D3標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明，在 5～500 ng/mL 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。在空白奶粉樣品中添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別以3倍和10倍信噪比來確定方法的檢出限和定量限，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表2），維生素D2和D3的檢出限為2 μg/kg，定量限為5 μg/kg。

2.4 回收率與精密度試驗

分別在不含維生素D的奶粉基質(zhì)中添加5、10、20、100 μg/kg維生素D2和維生素D3的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照樣品前處理方法進行測定，每個濃度水平重復(fù)6次。由表3可見，維生素D2和維生素D3的平均回收率為83.1%～105.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為4.3%～8.7%。

2.5 實際樣品測定

根據(jù)此方法對市售的牛奶、保健品、豆奶粉及奶粉中的維生素D含量進行測定，每批平行測定3次，計算各樣品中維生素D濃度，可見測得量和標(biāo)簽標(biāo)示量較為一致，但是牛奶的維生素D在營養(yǎng)標(biāo)簽上未明顯標(biāo)注;GB 5009.82—2016中規(guī)定維生素D的含量是以維生素D2與D3的含量之和計，但是上述4種產(chǎn)品中均只含有維生素D3，日常檢測工作中，多數(shù)產(chǎn)品也僅可測到維生素D3。結(jié)果見表4。

3 結(jié)論

該研究建立了超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定食品中維生素D的方法，結(jié)果表明，維生素D2和D3在5～500 ng/mL線性關(guān)系良好，二者檢出限為2 μg/kg，定量限為5 μg/kg;在各濃度水平下，二者回收率為83.1%～105.4%，RSD為4.3%～8.7%。該方法同時滿足了定性定量分析的要求，樣品無需經(jīng)制備液相再次凈化富集，簡化了樣品前處理過程。方法簡單、準(zhǔn)確度好、靈敏度高，可滿足實際檢測工作的需要。

參考文獻

[1] 中華人民共和國衛(wèi)生部.食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品營養(yǎng)強化劑使用標(biāo)準(zhǔn)：GB 14880—2012[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2013.

[2] HOLICK M F.Vitamin D deficiency[J].N Engl J Med，2007，357：266-281.

[3] WANG S H.Epidemiology of vitamin D in health and disease[J].Nutr Res Rev，2009，22（2）：188-203.

[4] ADAMS J S，HEWISON M.Update in vitamin D[J].J Clin Endocrinol Metab，2010，95（2）：471-478.

[5] 譚青松，付潔，何瑞國.高效液相色譜法測定魚樣中的維生素A，維生素D3和維生素E [J].動物營養(yǎng)學(xué)報，2007，19（5）：636-640.

[6] QIAN H，SHENG M.Simultaneous determination of fat-soluble vitamins A，D and E and pro-vitamin D2 in animal feeds by one-step extraction and high-performance liquid chromatography analysis[J].Journal of chromatography A，1998，825（2）：127-133.

[7] 趙榕，薛穎，吳國華，等.固相萃取-高效液相色譜法測定鈣強化食品中的維生素D[J].色譜，2008，26（1）：113-115.

[8] 張艷海，其布勒哈斯，金燕，等.在線二維液相色譜法同時測定嬰幼兒和成人配方營養(yǎng)品中的維生素A、D3和E[J].色譜，2015，33（3）：291-297.

[9] 黃旭，袁波，劉家陽.固相萃取-高效液相色譜法測定嬰幼兒乳粉中維生素D3的含量[J].山東化工，2017，46（8）：82-84.

[10] 劉劍，易路遙，晏亮，等.一維反相高效液相色譜法測定保健食品中維生素D2和維生素D3[J].食品界，2019（2）：82-83.

[11] 葉佳明，王京，葉磊海，等.在線固相萃取-二維色譜快速測定配方奶粉、米粉中維生素D 的含量[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2020，46（7）：239-243.

[12] 羅佳，王春民，李建.同位素稀釋-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)檢測嬰幼兒配方奶粉中維生素D[J].江蘇預(yù)防醫(yī)學(xué)，2019（2）：123-125.

[13] 許強，劉金生，王軼鵬，等.反相高效液相色譜法測定維生素D2和維生素D3[J].理化檢驗（化學(xué)分冊），2011，47（10）：1168-1169.

[14] 曹慧，陳小珍，王瑾，等.同位素稀釋-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)分析嬰兒配方奶粉中的維生素D[J].質(zhì)譜學(xué)報，2012，33（4）：232-236.

[15] BILODEAU L，DUFRESNE G，DEEKS J，et al.Determination of vitamin D3 and 25-hydroxyvitamin D3 in foodstuffs by HPLC UV-DAD and LC-MS/MS [J].Journal of food composition and analysis，2011，24（3）：441-448.

[16] 袁小芬，馬金飛，楊青青，等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)在維生素檢測中的應(yīng)用[J].中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2019，42（6）：479-483.

[17]劉海培，姜小梅，韓文念，等.人體血清中3種脂溶性維生素的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法研究[J].分析測試學(xué)報，2019，38（6）：728-733.

[18] 國家衛(wèi)生和計劃生育委員會，國家食品藥品監(jiān)督管理總局.食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中維生素A、D、E的測定：GB 5009.82—2016[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2017.

[19] 嚴(yán)麗娟，李文斌，洪煜琛，等.液相色譜-大氣壓化學(xué)電離串聯(lián)質(zhì)譜法測定嬰幼兒配方奶粉中的維生素D[J].色譜，2017，35（4）：427-431.

[20] 程雅婷，董衡，梁曉翠，等.人血清中25羥基維生素D測定的兩種質(zhì)譜方法比較[J].中華臨床醫(yī)師雜志：電子版，2013，7（14）：6535-6537.

[21] HIGASHI T，SHIBAYAMA Y，F(xiàn)UJI M，et al.Liquid chromatography-tandem mass spectrometric method for the determination of salivary 25-hydroxyvitamin D3：A noninvasive tool for the assessment of vitamin D status[J].Analytical and bioanalytical chemistry，2008，391（1）：229-238.