谷氨酸（鈉）對人體腸道菌群影響的體外發(fā)酵研究

劉淑君 陳苗 王鳳忠 包郁明 辛鳳姣 溫博婷

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193）

腸道微生物是人體生態(tài)系統(tǒng)的一個(gè)重要組成部分，占人類共生微生物的90%以上［1］。腸道微生物通過多種代謝途徑利用腸道中的營養(yǎng)物質(zhì)，在人體生長發(fā)育、能量代謝、免疫和神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控中發(fā)揮重要作用［2］。腸道微生物可以通過免疫、代謝等系統(tǒng)在內(nèi)的多種途徑調(diào)節(jié)大腦信號，進(jìn)而觸發(fā)微生物-腸道-腦軸的雙向應(yīng)答機(jī)制［3］。

谷氨酸在谷氨酸脫羧酶（GAD，EC 4.1.15）的催化作用下可生成γ-氨基丁酸（GABA）［4］。谷氨酸和GABA是哺乳動(dòng)物體內(nèi)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要神經(jīng)遞質(zhì)，分別對神經(jīng)系統(tǒng)具有興奮和抑制的作用［5-6］。GABA在人體中具有降血壓、抗氧化、抗抑郁以及調(diào)節(jié)肝腎機(jī)能等重要的生理功能，受到了人們的廣泛關(guān)注［7］。Barrett等［8］發(fā)現(xiàn)人體腸道來源的乳酸菌和雙歧桿菌在體外能夠產(chǎn)生GAD將谷氨酸鈉完全轉(zhuǎn)化生成GABA。但目前還沒有關(guān)于人體腸道微生物轉(zhuǎn)化谷氨酸的研究。

谷氨酸是組成蛋白質(zhì)或肽的結(jié)構(gòu)氨基酸之一，約占膳食蛋白的10%，是維持腸道完整性和功能的主要能量來源［9］。Janeczko等［10］發(fā)現(xiàn)在攝入谷氨酸后，血清中谷氨酸的含量有所增加。Liu等［11］通過研究肥胖人群血清中谷氨酸含量及腸道微生物的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)腸道微生物的組成與血清中谷氨酸的含量存在密切聯(lián)系，且腸道微生物中谷氨酸脫羧酶基因gad的豐度與血清中谷氨酸含量呈負(fù)相關(guān)。然而，飲食攝入的谷氨酸對人體腸道微生物組成及功能的影響及其在腸道中的轉(zhuǎn)化機(jī)制尚不明確。

谷氨酸在天然食品中通常以谷氨酸鈉的形式存在，本研究以人腸道微生物為菌源、谷氨酸鈉為底物進(jìn)行體外發(fā)酵，測定發(fā)酵過程中產(chǎn)氣量、pH及SCFA的變化、GAD活力及產(chǎn)物GABA含量，研究腸道微生物體外發(fā)酵對谷氨酸鈉的轉(zhuǎn)化能力，并進(jìn)一步通過16S微生物多樣性分析研究谷氨酸鈉的添加對腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，以期獲得轉(zhuǎn)化谷氨酸的特定菌群，為闡明腸道微生物轉(zhuǎn)化谷氨酸的機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試劑：L-谷氨酸鈉，購自西格瑪奧德里齊公司；乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸、巴豆酸標(biāo)準(zhǔn)品，購自阿拉丁生化科技股份有限公司；偏磷酸、磷酸氫二鉀、蛋白胨等試劑，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

糞便菌源：糞便樣本取自10名健康成人糞便（Human fecal，HF）（5名女性和5名男性，年齡22-36歲，身體健康且在試驗(yàn)前3個(gè)月內(nèi)無抗生素治療），將糞便樣品重懸于含有1.0% L-抗壞血酸的磷酸鹽緩沖液（pH 6.5，0.2 mol/L NaH2PO4和0.1 mol/L Na2HPO4）中，制備成質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為10%的糞便懸浮液。

培養(yǎng)基：YCFA基礎(chǔ)培養(yǎng)基參照Schwab等［12］，實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基加入0.8% L-谷氨酸鈉為底物，空白培養(yǎng)基中不加底物。在厭氧條件下，以5 mL為單位分別加入到10 mL發(fā)酵瓶中，121℃高壓蒸汽滅菌20 min，配制成實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基及空白培養(yǎng)基備用。

1.2 方法

1.2.1 體外發(fā)酵 分別接種0.5 mL 10%的糞便懸浮液于添加谷氨酸鈉培養(yǎng)基（Fermentation with monosodium glutamate，F(xiàn)S）及空白培養(yǎng)基（Control，CK），37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.2.2 產(chǎn)氣及pH的測定 發(fā)酵24 h后，使用BMPTest System壓 力 表（WAL Messund Regelsysteme GmbH，奧爾登堡，德國）測量每瓶發(fā)酵液的氣壓值（kPa）；使用緊湊型pH計(jì)（型號B-212，Horiba，日本）測定發(fā)酵0 h及發(fā)酵24 h發(fā)酵液的pH值。

1.2.3 SCFAs的測定 分別取空白培養(yǎng)基和添加谷氨酸鈉培養(yǎng)基發(fā)酵24 h后的發(fā)酵液0.5 mL加入0.1 mL巴豆酸-偏磷酸溶液于1.5 mL離心管中，渦旋振蕩2 min，充分混合均勻后，放置-20℃冰箱24 h，解凍后在14 000 r/min的條件下離心5 min，離心后取上清，經(jīng)0.22 μm水相濾膜過濾，用于SCFAs的測定。

采用GC-9720氣相色譜儀測定SCFAs含量。氣相色譜條件：色譜柱為毛細(xì)管柱HP-FFAP（30.0 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣為高純氮?dú)?，流?.0 mL/min；輔助氣為氫氣和空氣；檢測器為FID氫火焰離子化檢測器，檢測溫度250℃；程序溫度：初始溫度75℃，以20℃/min升溫至180℃，平衡1 min，再以40℃/min升溫至220℃，平衡1 min；進(jìn)樣量1.0 μL；采用外標(biāo)法，測定乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸和異戊酸的含量。

1.2.4 GABA的測定 參考許建軍［13］的方法，利用比色法快速測定發(fā)酵液中GABA的含量。分別取空白培養(yǎng)基和添加谷氨酸鈉培養(yǎng)基發(fā)酵24 h后的發(fā)酵液100 μL，加入100 μL 6%苯酚和100 μL 5.2%次氯酸鈉，混合均勻后沸水浴加熱10 min，迅速冷卻20 min，加入200 μL 60%乙醇，室溫靜置40 min，在640 nm測定吸光值，反應(yīng)產(chǎn)物GABA的定量以標(biāo)準(zhǔn)曲線確定。

1.2.5 GAD活力的測定 利用比色法快速測定谷氨酸脫羧酶的活力。100 μL經(jīng)超聲破菌后的發(fā)酵液，1 mL 0.2 mol/L醋酸鈉緩沖液（pH 4.4），1 mL 50 mmol/L L-谷氨酸鈉溶液，20 μL 10 mmol/L PLP（5’-磷酸吡哆醛），37℃ 反應(yīng)1 h。加入0.5 mL 1 mol/L碳酸鈉溶液和2.5 mL 0.2 mol/L 硼酸緩沖液（pH 9.0）終止反應(yīng)。反應(yīng)樣本中GABA含量測定同1.2.4。一個(gè)酶活力單位（IU）：每分鐘產(chǎn)生1 μmol GABA所需要的酶量。

1.2.6 16 S高通量測序分析 取3 mL谷氨酸鈉添加組體外發(fā)酵24 h的發(fā)酵液在12 000 r/min的條件下離心5 min，將獲得的沉淀和原始糞便樣本送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行總細(xì)菌DNA的提取和高通量測序分析。

細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在美吉云平臺（www.majorbio.com）進(jìn)行分析。引物選用細(xì)菌16S V3-V4 區(qū)引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTW TCTAAT-3'）進(jìn) 行 擴(kuò) 增。通過聚類分析，將一致性為97%的序列進(jìn)行可操作分類單元（OTU）劃分；通過繪制Shannon多樣性指數(shù)，分析微生物Alpha多樣性，反映微生物群落的豐富度和多樣性；通過主坐標(biāo)分析（PCoA），使用Bray-Curtis算法對樣本分組進(jìn)行分析；基于樣本中群落豐度數(shù)據(jù)，運(yùn)用student’st-檢驗(yàn)法檢測不同組（樣本）微生物群落中表現(xiàn)出的豐度差異的物種，對分組樣品的物種組成和群落結(jié)果進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)方法 采用Graphpad 7.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。以組別為變量，利用t-檢驗(yàn)的方法進(jìn)行差異顯著性分析。以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 谷氨酸鈉體外發(fā)酵過程中產(chǎn)氣量的變化

由圖1可知，谷氨酸鈉添加組（FS）的發(fā)酵氣壓為27.22 MPa，是空白對照組（CK）發(fā)酵氣壓8.45 MPa的3.22倍。說明以谷氨酸鈉為底物體外發(fā)酵24 h后產(chǎn)生的氣體顯著增加，腸道微生物對谷氨酸鈉具有較高的代謝能力。

圖1 谷氨酸鈉體外發(fā)酵24 h發(fā)酵液產(chǎn)氣氣壓值

2.2 谷氨酸鈉體外發(fā)酵過程中SCFAs產(chǎn)量的變化

腸道微生物在利用底物產(chǎn)生氣體的同時(shí)還會產(chǎn)生SCFAs，SCFAs主要由乙酸、丙酸、丁酸等組成。由表1可知，在CK組和FS組體外發(fā)酵24 h發(fā)酵液中，乙酸產(chǎn)量最大。與CK組相比，F(xiàn)S組中的乙酸、丙酸和丁酸的產(chǎn)量顯著增加（P＜0.01），異丁酸、戊酸和異戊酸的產(chǎn)量無顯著差異。其中，F(xiàn)S組乙酸的產(chǎn)量是CK組的4.5倍，丁酸的產(chǎn)量是CK組的26倍，丙酸的產(chǎn)量是CK組的3.42倍。且在FS組中，除乙酸外產(chǎn)量最大的為丁酸，占總酸的10.08%。

表1 谷氨酸鈉體外發(fā)酵24 h SCFAs產(chǎn)量（N=10）

2.3 谷氨酸鈉體外發(fā)酵過程中pH的變化

由圖2可知，本實(shí)驗(yàn)發(fā)酵前后pH介于6-7之間，基本處于中性的環(huán)境中。且在0 h和24 h時(shí)，F(xiàn)S組發(fā)酵液的pH均高于CK組。說明添加谷氨酸鈉后，會影響發(fā)酵液的pH。但與CK組相比，F(xiàn)S組發(fā)酵液pH 的變化差異不顯著。

圖2 谷氨酸鈉體外發(fā)酵24 h發(fā)酵液的pH值

2.4 谷氨酸鈉體外發(fā)酵過程中GABA產(chǎn)量的變化

為了研究谷氨酸鈉體外發(fā)酵過程中谷氨酸鈉的轉(zhuǎn)化效率，測定了谷氨酸鈉體外發(fā)酵液的GABA的含量。由圖3可知，與CK組相比，在添加了谷氨酸鈉的體外發(fā)酵過程中，GABA的含量顯著增加，谷氨酸鈉的轉(zhuǎn)化率達(dá)72.36%。

圖3 谷氨酸鈉體外發(fā)酵24 h發(fā)酵液的GABA含量

2.5 谷氨酸鈉體外發(fā)酵過程中GAD酶活力的變化

為了研究體外發(fā)酵過程中腸道微生物轉(zhuǎn)化谷氨酸生成GABA的機(jī)制，測定了FS組體外發(fā)酵液中的GAD活力。由圖4可知，10組添加了谷氨酸鈉的發(fā)酵液中均能檢測到具有GAD活力，且不同發(fā)酵液中的GAD活力不同。其中不同個(gè)體之間酶活力的差異較大，3號樣本發(fā)酵液中檢測到的酶活力最高，為0.57 IU/mL，10號樣本發(fā)酵液中酶活力最低，為0.18 IU/mL。

圖4 谷氨酸鈉體外發(fā)酵24 h發(fā)酵液中GAD的活力

2.6 谷氨酸鈉體外發(fā)酵對人體腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

通過對原始糞便組（HF）及谷氨酸鈉添加組（FS）體外發(fā)酵24 h發(fā)酵液樣本的16S微生物多樣性分析，20個(gè)樣本共獲得原始測序序列7 193 466個(gè)，經(jīng)質(zhì)控后，共獲得優(yōu)化序列948 227個(gè)。對優(yōu)化序列進(jìn)行OTU聚類分析，總計(jì)獲得具有97%相似性的OTU 343個(gè)。其中，HF組特有的OTU有47個(gè)，占總OTU數(shù)量的13.70%；FS組特有的OTU有14個(gè)，占總OTU數(shù)量的4.08%。

2.6.1 谷氨酸鈉體外發(fā)酵對人體腸道菌群多樣性的影響 由圖5-A可知，F(xiàn)S組的Shannon指數(shù)顯著低于HF組（P＜0.01），即添加谷氨酸鈉降低了腸道菌群的Alpha多樣性?；贐ray-Curtis距離算法，使用主坐標(biāo)分析（PCoA）分析OTU水平下兩組樣本的Beta多樣性，比較兩組樣本的組間差異性。由圖5-B可知，兩組發(fā)酵液中的微生物群落空間分離和聚類顯著（Anosim，R=0.735 1，P＜0.01），說明添加谷氨酸鈉顯著影響樣本間的群落分布。

2.6.2 谷氨酸鈉體外發(fā)酵對人體腸道菌群豐度的影響 為了探究谷氨酸鈉發(fā)酵對人體腸道菌群豐度的影響，對HF組及FS組體外發(fā)酵液樣本的物種組成成分及差異顯著性進(jìn)行分析。由圖6-A可知，在門水平上，與HF組相比，F(xiàn)S組優(yōu)勢物種的相對豐度明顯不同。在HF組中，厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobateria）為主要菌門（分別為74.3%、11.8%和11.6%）。以谷氨酸鈉為底物發(fā)酵24 h后，發(fā)酵液中的厚壁菌門（Firmicutes）和放線菌門（Actinobacteria）的相對豐度顯著降低（分別為36.6%和3.6%，P＜0.01），變形菌門（Proteobateria）的相對豐度升高（34.8%，P＜0.05），同時(shí)擬桿菌門（Bacteroidete）的相對豐度也顯著升高（12.7%，P＜0.001）。

圖5 谷氨酸鈉體外發(fā)酵前后群落Alpha多樣性（A）和主坐標(biāo)分析（PCoA）（B）

進(jìn)一步選取相對豐度前30的細(xì)菌，進(jìn)行屬水平相對豐度的比較（圖6-B）。由圖6-B可知，在HF組中，埃希氏菌屬（Escherichia-Shigella）、擬桿菌屬（Bacteroides）和拉克諾氏菌屬（Lachnoclostridium）的相對豐度分別為8.8%、0.8%和0.2%。以谷氨酸鈉為底物發(fā)酵24 h后，這3種菌屬的相對豐度顯著升高（分別為30.3%、9.7%和4.0%，P＜0.05），梭桿菌屬（Fusobacterium）和毛螺菌屬（Lachnospiraceae）的相對豐度也有所升高。同時(shí)，谷氨酸鈉的添加可顯著降低布勞特氏菌屬（Blautia）、糞桿菌屬（Faecalibacterium）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）和罕見小球菌屬（Subdoligranulum）的相對豐度（P＜0.05）。

2.6.3 谷氨酸鈉體外發(fā)酵中代謝通路分析 通過PICRUSt對兩組發(fā)酵液中的微生物群落進(jìn)行COG功能預(yù)測，發(fā)現(xiàn)兩組樣本的COG功能組成較為相似。對兩組菌群KEGG 功能（enzyme）豐度進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)gad的豐度有所升高，該酶對應(yīng)的KEGG通路為丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的代謝通路圖（KO00250）中的谷氨酸代謝通路（圖7）。

3 討論

飲食中的營養(yǎng)物質(zhì)可被腸道菌群發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸（SCFAs），能夠提供能量、調(diào)節(jié)炎癥、擴(kuò)張血管以及促進(jìn)腸道傷口愈合，對腸道健康有深遠(yuǎn)的影響［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，谷氨酸鈉體外發(fā)酵后，發(fā)酵液中的乙酸、丙酸和丁酸的含量顯著增加。其中乙酸產(chǎn)量雖最高，但丁酸的增長倍數(shù)最大，有研究結(jié)果表明谷氨酸發(fā)酵是丁酸的主要來源之一［15］，與本文的結(jié)論相一致。

產(chǎn)氣量和pH值是腸道菌群評價(jià)產(chǎn)品發(fā)酵能力的指標(biāo)［16］。發(fā)酵產(chǎn)生的SCFAs可以降低腸道環(huán)境pH值，提供酸性環(huán)境從而減少有害菌的生長［17-18］。然而，本研究中谷氨酸鈉體外發(fā)酵過程中雖產(chǎn)生了大量的SCFAs，但是發(fā)酵液pH值的變化并不明顯。谷氨酸代謝的途徑之一是在GAD的作用下，將谷氨酸脫羧生成GABA，GAD通過脫羧反應(yīng)消耗質(zhì)子來維持細(xì)菌環(huán)境的pH值［19］。同時(shí)，本研究在發(fā)酵液中檢測到GAD的活力以及產(chǎn)物GABA，說明在谷氨酸鈉體外發(fā)酵過程中，谷氨酸鈉在GAD的作用下脫羧產(chǎn)生了GABA。因此推測本研究中pH值不變，主要是由于谷氨酸鈉體外發(fā)酵過程中，發(fā)酵產(chǎn)生的SCFAs和谷氨酸脫羧反應(yīng)共同調(diào)節(jié)了發(fā)酵液的pH值。

16S微生物多樣性測定結(jié)果顯示谷氨酸鈉的添加降低了腸道微生物的多樣性。Wang等［20］研究發(fā)現(xiàn)，在體外發(fā)酵過程中，由于營養(yǎng)物質(zhì)單一、微生物代謝產(chǎn)物不豐富，導(dǎo)致了體外發(fā)酵腸道微生物的多樣性降低。然而，盡管體外發(fā)酵具有一定的局限性，但是其仍具有一定的研究意義及可信度。且體外發(fā)酵的方法不構(gòu)成倫理約束，并允許動(dòng)態(tài)取樣研究微生物的活性。同時(shí)，Sasaki等［21］發(fā)現(xiàn)體內(nèi)研究的結(jié)果與體外發(fā)酵的結(jié)果基本一致。因此，體外發(fā)酵是研究腸道微生物功能的有效方法之一。

圖6 谷氨酸鈉體外發(fā)酵過程中腸道微生物群落組成變化門水平（A）和屬水平（B）

通過PCoA及群落組成成分及差異分析發(fā)現(xiàn)，谷氨酸鈉體外發(fā)酵對腸道菌群組成及豐度影響顯著。其中，添加谷氨酸鈉的發(fā)酵組的菌門結(jié)構(gòu)及豐度發(fā)生了顯著的改變，厚壁菌門和放線菌門的相對豐度降低，擬桿菌門和變形菌門的相對豐度升高。厚壁菌門主要分解纖維類物質(zhì)，擬桿菌門主要分解非纖維類碳水化合物和蛋白質(zhì)［22］，這與本研究結(jié)果一致。谷氨酸鈉體外發(fā)酵后，屬水平微生物組成也發(fā)生了顯著變化，布勞特氏菌屬（Blautia）和雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）的相對豐度顯著降低，雙歧桿菌被認(rèn)為是人體有益菌，能夠促進(jìn)人體對多糖的降解及利用［23］。埃希氏菌屬、擬桿菌屬和拉克諾氏菌屬的相對豐度顯著升高。其中，GABA產(chǎn)生通路活躍表達(dá)在擬桿菌屬和埃希氏菌屬中，且擬桿菌屬能產(chǎn)生大量的GABA［24］。梭桿菌屬和毛螺菌屬的相對豐度升高，梭桿菌屬可以產(chǎn)生丁酸，而毛螺菌屬缺乏產(chǎn)生丁酸途徑，只有在產(chǎn)生丁酸的共生體時(shí)才會釋放一部分丙酮酸來產(chǎn)生丁酸［25］。丁酸是腸道菌群發(fā)酵碳水化合物后產(chǎn)生的重要短鏈脂肪酸之一，具有抗炎癥、保護(hù)腸道黏膜屏障等有益功能，并可能緩解肥胖，在細(xì)胞能量代謝和腸道穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用［26］。因此，谷氨酸鈉的體外發(fā)酵可影響腸道微生物的組成及相對豐度，并促使產(chǎn)生丁酸及GABA。

圖7 谷氨酸鈉體外發(fā)酵氨基酸代謝通路圖

Liu等［11］研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生物擬桿菌屬中的多形擬桿菌作為一株谷氨酸發(fā)酵共生菌，其與血清中谷氨酸的濃度呈負(fù)相關(guān)，該菌中的gad基因的豐度與谷氨酸的濃度呈負(fù)相關(guān)。本研究中，擬桿菌屬的相對豐度顯著增加且檢測到GAD活力以及GABA。因此推測谷氨酸鈉的攝入使擬桿菌屬的相對豐度升高，同時(shí)擬桿菌屬通過分泌GAD代謝谷氨酸產(chǎn)生GABA。通過PICRUSt對發(fā)酵液微生物進(jìn)行KEGG 功能（enzyme）豐度分析，gad的豐度升高。后續(xù)可以利用宏基因組檢測，挖掘代謝谷氨酸的潛在基因，進(jìn)一步闡明谷氨酸在腸道中的代謝機(jī)制。

4 結(jié)論

本研究利用體外發(fā)酵系統(tǒng)，初步探究了谷氨酸鈉發(fā)酵對腸道微生物的影響以及腸道微生物轉(zhuǎn)化谷氨酸的機(jī)制。與原始糞便樣本相比，谷氨酸鈉發(fā)酵提高了乙酸、丁酸和丙酸的產(chǎn)量，其中丁酸的產(chǎn)量增加了26倍；體外發(fā)酵后，底物谷氨酸鈉的轉(zhuǎn)化率達(dá)到72.36%。同時(shí)，埃希氏菌屬和擬桿菌屬的相對豐度顯著升高，推測在腸道微生物中埃希氏菌屬和擬桿菌屬對谷氨酸的轉(zhuǎn)化具有潛在作用。

致謝

感謝浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所王欣研究員對本實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)和幫助。