• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    豬流行性腹瀉病毒蛋白拮抗宿主天然免疫應(yīng)答的研究進(jìn)展

    2020-12-21 09:20:04成溫玉白云賈懷杰強(qiáng)桃艷趙鴻遠(yuǎn)張博藝郭曉薈
    生物技術(shù)通報(bào) 2020年12期
    關(guān)鍵詞:干擾素宿主通路

    成溫玉 白云 賈懷杰 強(qiáng)桃艷 趙鴻遠(yuǎn) 張博藝 郭曉薈

    (1. 安康學(xué)院 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物科技學(xué)院,安康 725000;2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,蘭州 730046)

    腹瀉病是困擾當(dāng)前養(yǎng)豬業(yè)的主要疾病之一,不僅影響豬群的生產(chǎn)性能、降低飼料轉(zhuǎn)化率和增加養(yǎng)殖成本,而且還會(huì)引起豬只的死亡,干擾豬肉市場(chǎng)的穩(wěn)定性。冠狀病毒是引起豬腹瀉病主要病毒性病原之一,其中以豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的腹瀉病尤為嚴(yán)重,可導(dǎo)致仔豬100%的發(fā)病率和死亡率,患畜主要表現(xiàn)為厭食、嘔吐、嚴(yán)重腹瀉和脫水等癥狀[1]。自1978年首次在英國(guó)發(fā)現(xiàn)PED以來,全球各大養(yǎng)豬國(guó)家均有報(bào)道且均發(fā)生過爆發(fā)的情況,是當(dāng)前養(yǎng)豬業(yè)重視的豬病之一[2-3]。在我國(guó),早在1984年就確認(rèn)并分離到PEDV,而在隨后的26年里該病毒僅引起部分豬場(chǎng)零星發(fā)病,直到2010年10月PEDV引起的豬急性腹瀉突然爆發(fā)并迅速席卷全國(guó),給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2-3]。

    天然免疫是機(jī)體非特異性抵御病原感染和有害物質(zhì)入侵的第一道防線,并啟動(dòng)和參與獲得性免疫應(yīng)答。天然免疫系統(tǒng)中的多種成分包括模式識(shí)別受體、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及調(diào)節(jié)因子、Ⅰ型-III型干擾素(Interferon,IFN)、干擾素刺激基因(Interferonstimulated genes,ISGs)和趨化因子從多個(gè)層面參與并抑制病原的感染。然而,病原在與宿主長(zhǎng)期的相互作用過程中進(jìn)化出一套能夠逃逸和破壞宿主免疫系統(tǒng)的機(jī)制,通過拮抗宿主天然免疫信號(hào)通路的激活,逃逸免疫應(yīng)答,促進(jìn)自身增殖,維持其在宿主體內(nèi)的生存[4]。PEDV具有典型的免疫抑制能力,依賴于自身編碼的免疫拮抗蛋白和隱藏自身病原體相關(guān)分子模式(dsRNA)逃逸宿主的免疫反應(yīng)[5]。研究證實(shí),PEDV至少編碼10種蛋白參與拮抗宿主天然免疫反應(yīng),但目前人們對(duì)其逃逸機(jī)制認(rèn)識(shí)不深[6]。為了進(jìn)一步認(rèn)識(shí)PEDV拮抗宿主天然免疫應(yīng)答機(jī)制,深入探究病原的致病機(jī)理,本文就PEDV蛋白如何拮抗宿主天然免疫應(yīng)答進(jìn)行總結(jié),以期為疫苗的創(chuàng)制奠定基礎(chǔ)。

    1 PEDV基因組結(jié)構(gòu)

    與其他冠狀病毒科的成員類似,PEDV屬于囊膜病毒,包含單股正鏈RNA基因組,由至少7個(gè)開放閱讀框(Open reading frame,ORF)以5'UTRORF1a-ORF1b-S-ORF3-E-M-N-3'UTR為順序組成近乎28 nt大小的基因組,共編碼2個(gè)多聚蛋白前體(pp1a和pp1ab)、4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(S、E、M和N)和1個(gè)輔助蛋白(ORF3)。其中基因組5'端的ORF1a和ORF1b基因占據(jù)整個(gè)基因組2/3,編碼的兩個(gè)病毒復(fù)制酶多聚蛋白(pp1a和pp1ab)經(jīng)剪切加工后形成16個(gè)成熟的非結(jié)構(gòu)蛋白(nsp1-nsp16),參與病毒RNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄;其余靠近3'端的1/3基因組編碼4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和輔助蛋白ORF3[7]。值得注意的是,編碼輔助蛋白ORF3的基因位于S基因和E基因之間,屬PEDV特異性基因,與病毒毒力密切相關(guān)[8]。

    2 PEDV蛋白抑制宿主天然免疫應(yīng)答

    2.1 非結(jié)構(gòu)蛋白

    冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白屬于早期蛋白,主要參與病毒RNA的合成。然而越來越多的研究發(fā)現(xiàn),其中nsp1、nsp3、nsp5、nsp7、nsp14、nsp15和nsp16還參與對(duì)宿主免疫調(diào)節(jié)的功能[5-6,8]。在病原感染早期,上述非結(jié)構(gòu)蛋白通過多種方式抑制宿主天然免疫應(yīng)答,為病毒的侵入和復(fù)制創(chuàng)造機(jī)會(huì)。

    2.1.1 nsp1 nsp1大小為110個(gè)氨基酸,是pp1a蛋白N端剪切后的產(chǎn)物,僅表達(dá)于α和β冠狀病毒屬的各成員中,但其序列在α和β屬各成員中卻表現(xiàn)出較大的變異性,是種屬特異性基因[9]。PEDV nsp1定位在宿主細(xì)胞的線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中,參與病毒基因的表達(dá)[10]。近幾年,多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)nsp1也參與了宿主基因調(diào)節(jié)并逃避宿主免疫應(yīng)答(圖1)。在拮抗宿主干擾素通路中,nsp1依賴于蛋白酶體途徑降解宿主胞核中的CBP蛋白,使得后者不能與IRF3組裝,從而阻礙I型干擾素及其ISGs的表達(dá)[11]。同時(shí)nsp1也能夠抑制III型干擾素IFN-λ的抗病毒活性[12]。研究發(fā)現(xiàn),在PECDQ,LLC-PK1和MARC-145細(xì)胞中,nsp1通過阻礙IRF1入核,降低細(xì)胞中病毒活化的過氧化物酶體數(shù)量來干擾IFN-λ的產(chǎn)生。進(jìn)一步利用突變體的研究發(fā)現(xiàn),nsp1干擾IFN-λ產(chǎn)生的能力主要依賴于其序列中保守的氨基酸區(qū)域[12]。同時(shí),對(duì)同屬α冠狀病毒TGEV nsp1的結(jié)構(gòu)研究證實(shí),第91-95位氨基酸序列高度保守,是構(gòu)成nsp1蛋白抑制宿主調(diào)控免疫應(yīng)答的主要基序,決定TGEV的毒力[13]。

    除拮抗宿主干擾素通路外,nsp1還具有阻礙NF-κB核轉(zhuǎn)移,影響IFN-β及多個(gè)細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-15和IL-17)表達(dá)的能力[14]。在PEDV感染LLC-PK1細(xì)胞早期,促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)受到抑制,nsp1通過靶向干擾IκBα的磷酸化和泛素化,阻礙了p65亞基的核移位,從而切斷NF-κB信號(hào)激活通路,抑制一系列抗病毒細(xì)胞因子的表達(dá)(圖1)。

    圖1 PEDV蛋白拮抗宿主天然免疫信號(hào)通路

    2.1.2 nsp3 冠狀病毒nsp3是一個(gè)多結(jié)構(gòu)域的大分子蛋白,包含重要的泛素樣結(jié)構(gòu)域和木瓜樣蛋白酶(Papain-like protease,PLpro)結(jié)構(gòu)域,且這些結(jié)構(gòu)域在不同種屬的冠狀病毒成員中存在較大的結(jié)構(gòu)差異。nsp3因其具有PLpro活性,在病毒復(fù)制過程中,參與了病毒復(fù)制轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的形成,依賴于自身PLpro結(jié)構(gòu)域與nsp5的3CLpro結(jié)構(gòu)域共同完成了對(duì)前體多聚蛋白pp1a和pp1ab的加工[15]。同樣,nsp3拮抗宿主天然免疫應(yīng)答也依賴于其PLpro活性。Xing等[16]研究證實(shí),PEDV nsp3蛋白借助PLpro的去泛素化活性阻礙STING和RIG-I泛素化,從而干擾STING和RIG-I介導(dǎo)的I型干擾素通路的激活,致使宿主I型干擾素以及ISGs的表達(dá)受阻(圖1)。此外,來自于對(duì)SARS-CoV和TGEV nsp3的研究證實(shí),nsp3還可通過抑制IκBα的泛素化以及p56的磷酸化阻止NF-κB介導(dǎo)的細(xì)胞因子應(yīng)答反應(yīng)[17]。因此,nsp3抗宿主免疫應(yīng)答主要依賴于其PLpro活性,而nsp3是否具有其他抑制宿主免疫應(yīng)答的機(jī)制有待進(jìn)一步探究。

    2.1.3 nsp5 nsp5是一種具有蛋白水解功能的3C樣蛋白酶(3C-like protease,3CLpro),富含組氨酸和半胱氨酸,在所有冠狀病毒間具有很高的保守型。該蛋白是冠狀病毒的主蛋白酶,通常以二聚體的形式負(fù)責(zé)對(duì)病毒多聚前體蛋白pp1ab進(jìn)行切割形成nsp4-nsp16[18]。除具有切割病毒自身蛋白的功能外,nsp5也能切割宿主蛋白。Wang等[19]起初發(fā)現(xiàn),nsp5具有降低仙臺(tái)病毒(Sendai virus,SEV)誘導(dǎo)IFN-β表達(dá)能力的現(xiàn)象,進(jìn)一步研究證實(shí)nsp5能夠靶向切割天然免疫RIG-I/MDA5信號(hào)通路上的重要接頭分子NEMO,從而破壞宿主產(chǎn)生I型干擾素。nsp5依賴于其保守的組氨酸和半胱氨酸催化位點(diǎn)切割NEMO位于第231位的谷氨酸殘基,致使NEMO喪失激活下游信號(hào)分子的能力,阻礙I型干擾素生成(圖1)。同樣,PDCoV的nsp5也能通過切割宿主NEMO抑制IFN-β的產(chǎn)生,且切割位點(diǎn)也位于NEMO的第231氨基酸殘基,這與nsp5在冠狀病毒中具有較高保守性密切相關(guān)[20]。此外,PDCoV的nsp5還能抑制IFN-α介導(dǎo)的ISGs轉(zhuǎn)錄,其通過靶向切割I(lǐng)型干擾素下游JAK-STAT通路中的關(guān)鍵分子STAT2抑制ISGs的表達(dá),從而拮抗I型干擾素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[21]。盡管nsp5切割STAT2的能力僅存在于PDCoV中,但有研究發(fā)現(xiàn)PEDV能夠抑制感染細(xì)胞中STAT1的表達(dá)。Guo等[22]發(fā)現(xiàn),PEDV依賴于宿主的泛素蛋白酶系統(tǒng)降解病毒誘導(dǎo)的STAT1,進(jìn)而降低其下游I型干擾素的表達(dá)(圖1)。另外,在PEDV感染的細(xì)胞中出現(xiàn)STAT3被激活的現(xiàn)象,作為負(fù)調(diào)控I型干擾素表達(dá)的JAK2-STAT3通路中關(guān)鍵分子STAT3,其上游的關(guān)鍵性配體——表皮生長(zhǎng)因子(Epidermal growth factor,EGF)在被PEDV激活的EGFR競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合后處于激活狀態(tài),導(dǎo)致I型干擾素表達(dá)受阻[23](圖1)。上述PEDV通過降解STAT1和激活STAT3途徑抑制干擾素表達(dá)的能力已經(jīng)得到充分證實(shí),但參與調(diào)節(jié)此過程的病毒蛋白尚未明確,有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

    2.1.4 nsp7 PEDV非結(jié)構(gòu)蛋白7是一包含83個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì),在不同毒株間高度保守,主要定位于細(xì)胞質(zhì)[24]。病毒在復(fù)制過程,nsp7與nsp8形成多聚體復(fù)合物,參與病毒RNA合成和病毒粒子組裝。同時(shí),多篇文獻(xiàn)證實(shí)nsp7具有調(diào)節(jié)宿主I型干擾素表達(dá)的功能[11,24-25]。利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)和熒光定量PCR證實(shí),nsp7能夠抑制IFN-α介導(dǎo)的ISRE啟動(dòng)子活化和ISGs的表達(dá),進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)PEDV nsp7通過與宿主轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白α1(Karyopherin α1,KPNA1)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合STAT1,阻礙了KPNA1與STAT1的相互識(shí)別,導(dǎo)致干擾素刺激因子3(Interferon-stimulated gene factor 3,ISGF3)核轉(zhuǎn)運(yùn)受阻,從而抑制I型干擾素及其相關(guān)基因的表達(dá)[25]。ISGF3是STAT1、STAT2與IRF9三者形成的復(fù)合體,nsp7除了與STAT1結(jié)合之外,還可以靶向結(jié)合于STAT2的DBD結(jié)構(gòu)域(DNA-binding domain),但并不影響ISGF3的形成[25](圖1)。

    2.1.5 nsp15 nsp15是冠狀病毒的內(nèi)切核糖核酸酶,參與病毒RNA的合成。起初,nsp15被認(rèn)為是病毒復(fù)制復(fù)合體的重要組分,后來的研究發(fā)現(xiàn)其并非在病毒復(fù)制時(shí)所必須,而是在拮抗宿主免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[26]。Zhang等[11-12]通過雙熒光素報(bào)告酶系統(tǒng)篩選抑制干擾素應(yīng)答功能的PEDV蛋白質(zhì)時(shí),鑒定出nsp15分別具有抑制Poly(I:C)誘導(dǎo)的IFN-β和IFN-λ激活的功能。Deng等[27]通過反向遺傳技術(shù)建立的PEDV感染性克隆證實(shí),nsp15必須依賴其內(nèi)切核糖核酸酶活性拮抗宿主I型(IFN-β)和III型干擾素(IFN-λ)應(yīng)答。病毒喪失核糖核酸酶活性后激活細(xì)胞(LLC-PK1)中I型(IFN-β)和III型干擾素大量表達(dá),導(dǎo)致其在豬上皮細(xì)胞中的增殖能力減弱。同時(shí),喪失核糖核酸酶活性的PEDV對(duì)仔豬的致病力也顯著降低[27]。然而,針對(duì)PDCoV nsp15的研究發(fā)現(xiàn),該蛋白也具有抑制SEV誘導(dǎo)的IFN-β激活的能力,但并非依賴于nsp15核糖核酸酶活性,而是通過靶向抑制NF-κB p65亞基的激活和核移位阻斷下游I干擾素通路的活化,從而拮抗宿主的免疫應(yīng)答[28]。上述研究結(jié)果表明,PEDV和PDCoV依賴于nsp15通過不同形式拮抗宿主天然免疫應(yīng)答,然而我們依然不明確PEDV如何利用nsp15的核糖核酸酶活性發(fā)揮抗宿主I型(IFN-β)和III型干擾素(IFN-λ)應(yīng)答。有文獻(xiàn)推測(cè),病毒在復(fù)制時(shí)nsp15與其他非結(jié)構(gòu)蛋白在宿主細(xì)胞中構(gòu)成雙膜結(jié)構(gòu)的小囊泡,包裹病毒RNA以逃避其被宿主核酸識(shí)別受體的識(shí)別[28],但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步證實(shí)。

    2.1.6 nsp16 冠狀病毒編碼的nsp16是一種2'氧位甲基轉(zhuǎn)移酶,主要參與病毒RNA的合成,其氨基酸序列高度保守,存在Lys-Asp-Lys-Glu(KDKE)四個(gè)一組的氨基酸基序是維持甲基轉(zhuǎn)移酶活性的關(guān)鍵[29]。dsRNA作為RNA病毒復(fù)制過程中的中間產(chǎn)物,其能被宿主模式識(shí)別受體(PPRs)識(shí)別并誘導(dǎo)機(jī)體干擾素應(yīng)答。為了逃避宿主免疫系統(tǒng)對(duì)dsRNA的識(shí)別,冠狀病毒在復(fù)制過程中,借助nsp14的甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域和nsp16甲基轉(zhuǎn)移酶活性與nsp10協(xié)同作用對(duì)病毒RNA的5'端進(jìn)行加帽反應(yīng),避免病毒RNA受宿主核酸識(shí)別受體的識(shí)別[29]。針對(duì)PEDV拮抗宿主干擾素的研究發(fā)現(xiàn),nsp16依賴其甲基轉(zhuǎn)移酶活性通過抑制IRF3磷酸化阻斷RIG-I和MDA5引發(fā)的天然免疫信號(hào)通路發(fā)揮抗宿主免疫反應(yīng),其保守的KDKE基序是阻礙IFN-β和ISRE啟動(dòng)子激活的關(guān)鍵[30](圖1)。當(dāng)人為缺失或者突變病毒nsp16的KDKE基序后,病毒誘發(fā)強(qiáng)大的干擾素應(yīng)答反應(yīng)[30]。同時(shí)nsp10具有協(xié)同nsp16抑制宿主I型干擾素應(yīng)答的能力,而nsp10自身卻無此功能,這可能與nsp10參與激活nsp16甲基轉(zhuǎn)移酶活性有關(guān)[31]。同樣,來自MERS-CoV nsp16的研究也證實(shí)其具有拮抗宿主I型干擾素應(yīng)答的能力,并且突變其保守KDKE基序的病毒對(duì)小鼠具有很好的免疫保護(hù)作用[32]。因此,nsp16可作為疫苗設(shè)計(jì)的良好靶點(diǎn)。

    除上述幾種非結(jié)構(gòu)蛋白外,nsp14也被證實(shí)能夠抑制IFN-β啟動(dòng)子活性,nsp8和nsp14具有抑制III型干擾素IFN-λ1啟動(dòng)子活性的能力[11-12],但其具體的作用機(jī)制尚未見報(bào)道。我們對(duì)nsp14的功能預(yù)測(cè)顯示,其具有外切酶核酸活性和N7甲基轉(zhuǎn)移酶活性。利用反向重組技術(shù)構(gòu)建的缺失N7甲基轉(zhuǎn)移酶活性的PEDV感染細(xì)胞后,病毒的增殖不受影響但對(duì)外源性IFN-β敏感性增加,表明nsp14的N7甲基轉(zhuǎn)移酶活性在抗IFN-β的應(yīng)答中起到關(guān)鍵性的作用(待發(fā)表)。然而目前我們尚未發(fā)現(xiàn)nsp14拮抗宿主I型干擾素應(yīng)答具體機(jī)制。

    2.2 結(jié)構(gòu)蛋白

    在位于PEDV基因組的3'端,編碼4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白,即棘突蛋白S(Spike)、包膜蛋白E(Envelope)、膜蛋白M(Membrane)和核衣殼蛋白N(Nucleocapsid),主要參與病毒構(gòu)成。利用異位表達(dá)研究發(fā)現(xiàn),其中E、N和M表現(xiàn)出抑制IFN-β和IRF3活性的能力。此外還參與宿主內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和NF-κB激活反應(yīng)。

    2.2.1 棘突蛋白S 棘突蛋白S屬于I型糖蛋白,包含S1和S2兩個(gè)亞基并以三聚體的形式存在于病毒粒子表面,決定病毒的宿主范圍和組織嗜性[33]。S1亞基又含有N端區(qū)域(N-terminal domain,S1-NTD)和 C端 區(qū) 域(C-terminal domain,S1-CTD),二 者均屬于PEDV的受體結(jié)合域,其中S1-CTD識(shí)別并特異性結(jié)合宿主受體氨肽酶N(Aminopeptidase N,APN),而S1-NTD則可以與病毒的輔助性受體糖結(jié)合[34]。病毒入侵細(xì)胞時(shí)借助于S蛋白與宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合并通過膜融合的形式進(jìn)入胞內(nèi)。盡管利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)未發(fā)現(xiàn)S蛋白具有抑制I型干擾素的能力,然而在PEDV感染的腸細(xì)胞中,S蛋白表現(xiàn)出削弱宿主I型干擾素應(yīng)答的潛能[23]。Yang等[23]發(fā)現(xiàn),S蛋白能與宿主表皮生長(zhǎng)因子受體(Epidermal growth factor receptor,EGFR)結(jié) 合并使EGFR激活,活化后的EGFR進(jìn)一步激活下游JAK2-STAT3通路。作為負(fù)調(diào)控I型干擾素表達(dá)的STAT3被激活后,反過來抑制I型干擾素的產(chǎn)生,從而促進(jìn)病毒感染。此外,S1亞基具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力[35],雖然細(xì)胞凋亡阻礙了病毒復(fù)制并暴露細(xì)胞中的病毒,但同時(shí)也有利于病毒釋放以及逃避宿主胞內(nèi)強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答反應(yīng)。

    2.2.2 囊膜蛋白E和膜蛋白M E蛋白是由76個(gè)氨基酸組成的分子量約為 8.8 kD最小的結(jié)構(gòu)蛋白,在PEDV出芽過程中扮演重要的角色[36]。該蛋白在病毒感染過程中主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng),有研究證實(shí)其能夠通過上調(diào)宿主葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(Glucose-regulated protein 78,GRP78)的表達(dá)誘導(dǎo)感染細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng),同時(shí)激活NF-κB活性并上調(diào)炎癥因子IL-8和抗凋亡分子Bcl-2的表達(dá)[37]。據(jù)此,該研究推測(cè)E蛋白通過激活NF-κB上調(diào)IL-8和Bcl-2的表達(dá)分別促進(jìn)細(xì)胞炎性反應(yīng)和限制細(xì)胞凋亡,維持病毒在細(xì)胞中增殖。

    膜蛋白M分子量大小約為30 kD,在冠狀病毒中高度保守,定位于整個(gè)宿主細(xì)胞中,主要參與病毒粒子的組裝和出芽。早期研究發(fā)現(xiàn),PEDV M蛋白可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生IFN-α和特異性抗體,還能介導(dǎo)細(xì)胞融合,因此被作為病毒抗體疫苗的候選靶點(diǎn)[38]。與E蛋白類似,盡管M蛋白不具有拮抗I型和III型干擾素的能力,然而其能夠抑制細(xì)胞周期素A(cyclin A)阻礙腸道上皮細(xì)胞生長(zhǎng)使其停滯在細(xì)胞周期的S期,暗示病毒可能通過干擾細(xì)胞周期促進(jìn)其增殖[38]。

    2.2.3 核衣殼蛋白N N蛋白是所有PEDV編碼的結(jié)構(gòu)蛋白中表達(dá)最豐富、最保守的蛋白,大小為55-58 kD,主要定位于宿主細(xì)胞胞質(zhì)中,參與病毒基因組轉(zhuǎn)錄和合成、病毒粒子組裝以及宿主應(yīng)激和免疫反應(yīng)[39]。N蛋白作為病毒逃逸宿主免疫應(yīng)答策略的一部分,具有拮抗I型和III型干擾素的能力。利用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示,異位表達(dá)的N蛋白分別具有抑制SEV誘導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生和poly(I:C)誘導(dǎo)的IFN-λ3的啟動(dòng)子活性,同時(shí)還能抑制轉(zhuǎn)錄因子IRF3和NF-κB的激活[11-12](圖1)。作為RIGI/MDA5介導(dǎo)I型干擾素通路中的關(guān)鍵蛋白,TBK1受到N蛋白的靶向作用,從而阻斷了TBK1對(duì)IRF3的激活,造成下游IFN-β和ISGs表達(dá)受阻[40]。在抑制IFN-λ3表達(dá)的通路中,N蛋白被發(fā)現(xiàn)能夠阻止IPEC-J2細(xì)胞中NF-κB和IRF3的激活,因此N蛋白有可能通過抑制NF-κB和IRF3的激活破壞IFN-λ3對(duì)病毒的應(yīng)答[41]。同樣,在Zhang等[12]對(duì)PEDV蛋白抑制III型干擾素表達(dá)的篩選研究中,也發(fā)現(xiàn)N蛋白具有拮抗IFN-λ1活性的能力,但其具體機(jī)制尚未深入研究。

    然而,與上述N蛋白抑制NF-κB激活的現(xiàn)象相反,Cao等[42]發(fā)現(xiàn)在IECs細(xì)胞中過表達(dá)PEDV的N蛋白能顯著激活NF-κB,且NF-κB的激活活性依賴于N蛋白的表達(dá)劑量和蛋白的中間序列,N蛋白對(duì)NF-κB的激活能力主要依靠宿主TLR2信號(hào)通路的參與(圖1)。同時(shí)他們還發(fā)現(xiàn)TLR3和TLR9也參與了PEDV誘導(dǎo)的NF-κB激活,但其具體機(jī)制未見報(bào)道。此外,Xu等[43]也證實(shí)N蛋白能激活I(lǐng)ECs細(xì)胞中NF-κB并誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)、上調(diào)IL-8和Bcl-2的表達(dá),同時(shí)還能通過降解細(xì)胞周期素A阻礙腸道上皮細(xì)胞生長(zhǎng)使其停滯在細(xì)胞周期的S期。這與E蛋白的作用相似,很可能N蛋白也是通過限制細(xì)胞凋亡,利于病毒在細(xì)胞中復(fù)制。另外發(fā)現(xiàn),N蛋白可穿梭于胞質(zhì)和胞核之間,與核仁磷酸蛋白1(Nucleophosmin,NPM1)存在相互作用[44]。NPM1作為凋亡抑制蛋白,受caspase-3的靶向切割后會(huì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在PEDV感染的過程中,NPM1表達(dá)上調(diào)且過表達(dá)能促進(jìn)PEDV的增殖,盡管N蛋白入核過程不依賴于NPM1的作用,但N蛋白的結(jié)合保護(hù)NPM1免受caspase-3的水解,利于細(xì)胞生存,促進(jìn)病原的增殖[44]。

    2.3 輔助蛋白

    ORF3作為PEDV唯一的輔助蛋白,大小約為25 kD,與病毒的毒力強(qiáng)弱和復(fù)制密切相關(guān)。對(duì)比野生、細(xì)胞培養(yǎng)株和弱毒疫苗株的ORF3序列發(fā)現(xiàn),弱毒疫苗株和細(xì)胞培養(yǎng)株出現(xiàn)30-51核苷酸的缺失,因此常被用于強(qiáng)弱毒株診斷的依據(jù)[45]。ORF3主要定位于細(xì)胞質(zhì)中,部分存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等細(xì)胞器,其可與S蛋白共定位于感染細(xì)胞中的核周間隙和囊泡狀結(jié)構(gòu)中,且二者存在相互作用調(diào)節(jié)病毒復(fù)制[46]。盡管通過雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)篩選到ORF3也具有抑制I型(IFN-β)和III型(IFN-λ1)干擾素啟動(dòng)子活性的能力[11-12](圖1),但對(duì)其抑制IFN-β和IFN-λ1的具體機(jī)制及作用效果并未進(jìn)行深入研究。與結(jié)構(gòu)蛋白M和N相似,ORF3也表現(xiàn)出調(diào)控宿主細(xì)胞周期的能力。Ye等[47]利用構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)ORF3蛋白的Vero細(xì)胞證實(shí),ORF3通過延長(zhǎng)細(xì)胞周期的S期和促進(jìn)囊泡形成的方式以利于病毒增殖。同時(shí)相比強(qiáng)毒株的PEDV,穩(wěn)定表達(dá)ORF3的Vero細(xì)胞更利于弱毒株的增殖。此外,ORF3還具有抑制PEDV誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡功能,利用反向遺傳構(gòu)建的PEDV-ΔORF3感染細(xì)胞后,細(xì)胞活性顯著降低且活化的caspase-3升高,表明缺失ORF3的病毒促進(jìn)了細(xì)胞凋亡[48]。因此,ORF3在病毒感染過程中不僅可以通過抑制I型和III型干擾素的表達(dá)拮抗宿主天然免疫應(yīng)答,而且能夠直接調(diào)控細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞凋亡為病毒增殖創(chuàng)造細(xì)胞環(huán)境。

    3 PEDV拮抗宿主免疫的其他方式

    PEDV除了利用上述蛋白拮抗宿主免疫應(yīng)答外,還采用其他方式逃逸宿主的免疫反應(yīng)。絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路是機(jī)體調(diào)控胞內(nèi)外信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵,其通路中的關(guān)鍵元件包括胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(Extracellular signal-regulated kinases,EKR)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinases,JNK)和p38。研究發(fā)現(xiàn),PEDV在感染過程中能激活MAPK通路中的EKR和p38促進(jìn)病毒復(fù)制,而被激活的EKR和p38并不能誘導(dǎo)宿主細(xì)胞周期停滯和凋亡反應(yīng)[49](圖1)。鑒于PEDV和ORF3蛋白均具有抑制細(xì)胞凋亡的作用,因此,盡管PEDV能激活EKR和p38但不誘發(fā)細(xì)胞凋亡反應(yīng),這是病毒調(diào)控宿主反應(yīng)的綜合結(jié)果,而PEDV是如何激活EKR和p38并促進(jìn)自身增殖有待進(jìn)一步探究。

    除了RIG-I和MDA5受體及其信號(hào)通路受到PEDV調(diào)控外,TLRs家族中的TLR3、TLR4和TLR7-TLR9及其下游關(guān)鍵分子TRIF、MyD88和TRAF6在病毒感染仔豬早期時(shí)(4 dpi)表達(dá)受到抑制,進(jìn)而阻礙新生兒Fc受體(Neonatal Fc receptor,F(xiàn)cRn)表達(dá)及IgG的分泌[50]。同樣,在對(duì)比S基因變異毒株(S-INDEL strain)和非變異毒株(non-SINDEL strain)對(duì)仔豬免疫應(yīng)答的影響研究中發(fā)現(xiàn),仔豬腸黏膜中TLR3、TLR4、TLR7-TLR9、TRIF、MyD88和TRAF6的表達(dá)也明顯受到抑制,且這些基因的表達(dá)在非變異毒株感染的仔豬中被下調(diào)的幅度最大,暗示S蛋白在抑制宿主TLRs信號(hào)通路中發(fā)揮作用[51]。HSP27是參與IFN-β及其下游ISGs表達(dá)的重要分子,通過激活NF-κB促進(jìn)細(xì)胞中IFN-β及其下游ISGs轉(zhuǎn)錄,具有抗病毒感染的作用。PEDV在Marc-145細(xì)胞中增殖過程表現(xiàn)出對(duì)HSP27的抑制功能,從而降低IFN-β及其下游ISGs的表達(dá),逃避宿主抗病毒應(yīng)答[52]。

    4 總結(jié)與展望

    病毒與宿主之間的相互作用像是二者之間的一場(chǎng)“軍備競(jìng)賽”,病毒為了生存依賴于自身編碼的蛋白隱藏病原相關(guān)分子模式(PAMPs)逃避并直接阻礙宿主的免疫應(yīng)答。豬細(xì)胞中的TLRs和RLRs能夠識(shí)別PEDV在增殖過程中釋放的基因組RNA以及形成的核酸中間物并激活天然免疫抗病毒途徑,產(chǎn)生I型、III型干擾素和大量的ISGs。然而,PEDV編碼的10余種蛋白能夠通過兩種方式拮抗宿主干擾素應(yīng)答:(1)靶向作用于干擾素通路中的多個(gè)信號(hào)分子阻斷I型和III型干擾素產(chǎn)生,甚至直接抑制干擾素下游ISGs的生成;(2)借助于病毒蛋白的酶活性修飾RNA結(jié)構(gòu),逃避宿主對(duì)其PAMPs的識(shí)別。此外,病毒還通過調(diào)控宿主細(xì)胞以延長(zhǎng)細(xì)胞周期或阻礙感染細(xì)胞的凋亡為自身增殖創(chuàng)造細(xì)胞環(huán)境,而隨著細(xì)胞中病毒粒子增加以及相關(guān)凋亡信號(hào)的累積,細(xì)胞不得不啟動(dòng)凋亡時(shí),又為病毒的釋放和擴(kuò)散創(chuàng)造了條件。因此,PEDV不僅通過阻礙免疫應(yīng)答拮抗宿主的清除,還可調(diào)控宿主細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡反應(yīng)方便自身增殖。

    盡管PEDV基因組結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單,除了已知參與調(diào)控宿主免疫應(yīng)答的蛋白之外,其他非結(jié)構(gòu)蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白以及基因組兩端UTR序列是否具有拮抗和調(diào)控宿主天然免疫應(yīng)答的潛力;nsp8和nsp14拮抗I型和III型干擾素應(yīng)答的具體機(jī)制是什么;它們對(duì)病毒的毒力有何影響;病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與天然免疫應(yīng)答以及凋亡抑制之間有何關(guān)系;PEDV感染引起宿主細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)和自噬的機(jī)制是什么。因此,從宿主免疫學(xué)的角度出發(fā),探究病毒編碼蛋白對(duì)宿主的免疫調(diào)節(jié)作用有助于認(rèn)識(shí)病毒與宿主相互作用關(guān)系,同時(shí)對(duì)疫苗的創(chuàng)制和疾病防控具有重要的指導(dǎo)意義。

    猜你喜歡
    干擾素宿主通路
    病原體與自然宿主和人的生態(tài)關(guān)系
    科學(xué)(2020年3期)2020-11-26 08:18:22
    龜鱉類不可能是新冠病毒的中間宿主
    α-干擾素聯(lián)合利巴韋林治療慢性丙型肝炎
    表現(xiàn)為扁平苔蘚樣的慢性移植物抗宿主病一例
    Kisspeptin/GPR54信號(hào)通路促使性早熟形成的作用觀察
    霧化吸入γ干擾素對(duì)免疫低下肺炎的療效觀察
    干擾素α-1b治療成人麻疹療效初步觀察
    人乳頭瘤病毒感染與宿主免疫機(jī)制
    proBDNF-p75NTR通路抑制C6細(xì)胞增殖
    通路快建林翰:對(duì)重模式應(yīng)有再認(rèn)識(shí)
    女性生殖器流出的白浆| 黄色毛片三级朝国网站| 国产黄色视频一区二区在线观看| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 1024视频免费在线观看| 激情五月婷婷亚洲| 亚洲精品日本国产第一区| 中文字幕亚洲精品专区| 国产探花极品一区二区| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 99久久中文字幕三级久久日本| 亚洲精品av麻豆狂野| 久久99热6这里只有精品| 精品国产一区二区三区四区第35| 成年美女黄网站色视频大全免费| 女人精品久久久久毛片| 一本久久精品| 日本91视频免费播放| 国产精品.久久久| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕 | 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 亚洲美女搞黄在线观看| 久久精品人人爽人人爽视色| 国产国语露脸激情在线看| 在线观看美女被高潮喷水网站| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 乱人伦中国视频| 在线天堂中文资源库| 国产精品成人在线| 亚洲 欧美一区二区三区| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 日本-黄色视频高清免费观看| 日韩制服骚丝袜av| 最近手机中文字幕大全| 国产又爽黄色视频| av网站免费在线观看视频| 精品午夜福利在线看| 2022亚洲国产成人精品| 国产精品女同一区二区软件| 黄色 视频免费看| 免费在线观看完整版高清| 美女大奶头黄色视频| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 精品卡一卡二卡四卡免费| 另类精品久久| 亚洲国产日韩一区二区| 国产 一区精品| 9色porny在线观看| 久久久久久久大尺度免费视频| 深夜精品福利| 国产极品粉嫩免费观看在线| 成人无遮挡网站| 免费黄网站久久成人精品| 99re6热这里在线精品视频| 超色免费av| 久久久精品94久久精品| 丝袜脚勾引网站| 国产精品久久久av美女十八| 成人毛片60女人毛片免费| 国产精品人妻久久久影院| 婷婷色综合www| 国产精品蜜桃在线观看| 不卡视频在线观看欧美| 国产熟女午夜一区二区三区| 一区二区三区四区激情视频| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产探花极品一区二区| 又大又黄又爽视频免费| av电影中文网址| av黄色大香蕉| 男女下面插进去视频免费观看 | 亚洲欧美成人精品一区二区| 国产 一区精品| 看免费av毛片| 99久久人妻综合| 亚洲av电影在线进入| 日本wwww免费看| 男男h啪啪无遮挡| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 亚洲精品日本国产第一区| 国产淫语在线视频| 久久99蜜桃精品久久| 9色porny在线观看| 妹子高潮喷水视频| 亚洲欧美色中文字幕在线| 亚洲图色成人| 日日啪夜夜爽| 日韩一区二区视频免费看| 看十八女毛片水多多多| av.在线天堂| 久久99蜜桃精品久久| 日韩av免费高清视频| 免费观看性生交大片5| av天堂久久9| 看免费av毛片| a级毛片黄视频| 国产精品99久久99久久久不卡 | 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 人人澡人人妻人| 国产精品久久久久久av不卡| 亚洲精品日本国产第一区| 亚洲精品中文字幕在线视频| tube8黄色片| 岛国毛片在线播放| 少妇的丰满在线观看| 大香蕉97超碰在线| 熟女av电影| 亚洲美女黄色视频免费看| 日韩成人av中文字幕在线观看| 国产精品久久久久久久久免| 亚洲欧美精品自产自拍| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 99热这里只有是精品在线观看| 深夜精品福利| 色吧在线观看| 少妇人妻精品综合一区二区| 国产一区二区激情短视频 | 精品国产国语对白av| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 亚洲第一区二区三区不卡| 在线观看三级黄色| 久热久热在线精品观看| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 丰满乱子伦码专区| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 90打野战视频偷拍视频| 黑人高潮一二区| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 久久毛片免费看一区二区三区| 成人手机av| 亚洲,一卡二卡三卡| 高清毛片免费看| 色网站视频免费| xxx大片免费视频| 日韩 亚洲 欧美在线| 久久亚洲国产成人精品v| 成人黄色视频免费在线看| 热re99久久国产66热| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 成人亚洲欧美一区二区av| 久久久久久伊人网av| av女优亚洲男人天堂| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 久久久久久久久久久久大奶| 国产av国产精品国产| 欧美成人午夜免费资源| 亚洲av日韩在线播放| 丰满乱子伦码专区| 高清在线视频一区二区三区| 精品福利永久在线观看| 久久97久久精品| 极品少妇高潮喷水抽搐| 国产福利在线免费观看视频| 日韩成人av中文字幕在线观看| 欧美日韩av久久| 国产高清三级在线| 男女免费视频国产| 久久久久精品久久久久真实原创| 下体分泌物呈黄色| 国产成人精品在线电影| 国产亚洲最大av| 如何舔出高潮| 男女下面插进去视频免费观看 | 99国产综合亚洲精品| 啦啦啦在线观看免费高清www| 亚洲五月色婷婷综合| 色5月婷婷丁香| 国产黄色免费在线视频| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 男人添女人高潮全过程视频| 日韩精品有码人妻一区| 秋霞在线观看毛片| 大陆偷拍与自拍| 男女高潮啪啪啪动态图| 国产亚洲精品第一综合不卡 | 欧美 日韩 精品 国产| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 国产亚洲欧美精品永久| 蜜桃国产av成人99| 母亲3免费完整高清在线观看 | 人妻人人澡人人爽人人| 精品少妇黑人巨大在线播放| 日韩制服骚丝袜av| 丰满饥渴人妻一区二区三| 久久久久久久久久久免费av| 精品久久国产蜜桃| 18禁动态无遮挡网站| 免费观看av网站的网址| xxxhd国产人妻xxx| tube8黄色片| 国产黄频视频在线观看| av不卡在线播放| 国产又色又爽无遮挡免| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 青春草国产在线视频| 国产免费现黄频在线看| 久久午夜综合久久蜜桃| 男女午夜视频在线观看 | 久久久久久久大尺度免费视频| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 亚洲成人一二三区av| 大陆偷拍与自拍| 久久ye,这里只有精品| 熟妇人妻不卡中文字幕| 国产黄色免费在线视频| 国产精品嫩草影院av在线观看| 亚洲欧美成人精品一区二区| 久久久国产一区二区| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 亚洲一码二码三码区别大吗| 黄色怎么调成土黄色| 国产色爽女视频免费观看| 2022亚洲国产成人精品| 国产片特级美女逼逼视频| 九草在线视频观看| 男女高潮啪啪啪动态图| 久久精品国产亚洲av天美| 交换朋友夫妻互换小说| 久久国产亚洲av麻豆专区| 青春草视频在线免费观看| 中文欧美无线码| 亚洲四区av| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 边亲边吃奶的免费视频| 久久ye,这里只有精品| 男女午夜视频在线观看 | 国产精品久久久久久久久免| 人成视频在线观看免费观看| 欧美性感艳星| 亚洲人成网站在线观看播放| 美女国产视频在线观看| 啦啦啦啦在线视频资源| av.在线天堂| 91久久精品国产一区二区三区| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 男人添女人高潮全过程视频| 99热网站在线观看| 久久人人爽人人片av| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 国产av国产精品国产| 秋霞伦理黄片| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 国产一级毛片在线| 高清黄色对白视频在线免费看| 午夜免费鲁丝| 国产xxxxx性猛交| 五月伊人婷婷丁香| 丰满饥渴人妻一区二区三| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 在线观看免费日韩欧美大片| 国产精品久久久久成人av| 国产探花极品一区二区| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 欧美精品高潮呻吟av久久| 国产精品无大码| 老司机影院成人| 少妇高潮的动态图| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产精品一国产av| 亚洲五月色婷婷综合| 免费观看av网站的网址| 咕卡用的链子| 精品少妇黑人巨大在线播放| 亚洲国产精品一区三区| 午夜免费观看性视频| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 国产69精品久久久久777片| 制服丝袜香蕉在线| 亚洲综合精品二区| 成人亚洲精品一区在线观看| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 免费看不卡的av| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 亚洲av国产av综合av卡| 9热在线视频观看99| 免费av不卡在线播放| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 亚洲人成网站在线观看播放| 男女边吃奶边做爰视频| 亚洲少妇的诱惑av| 亚洲欧洲国产日韩| 欧美成人精品欧美一级黄| 视频在线观看一区二区三区| 亚洲国产精品成人久久小说| 久久人妻熟女aⅴ| 毛片一级片免费看久久久久| 少妇高潮的动态图| 中文字幕av电影在线播放| 97超碰精品成人国产| 精品午夜福利在线看| 十八禁高潮呻吟视频| 亚洲经典国产精华液单| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 亚洲在久久综合| 国产亚洲最大av| 亚洲三级黄色毛片| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 精品亚洲成a人片在线观看| 成人黄色视频免费在线看| 97精品久久久久久久久久精品| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 国产成人精品在线电影| 嫩草影院入口| 午夜福利,免费看| 少妇的逼好多水| 乱码一卡2卡4卡精品| 欧美日韩精品成人综合77777| 97精品久久久久久久久久精品| 永久网站在线| www日本在线高清视频| 99国产综合亚洲精品| 美女福利国产在线| 国产在线免费精品| av国产精品久久久久影院| 国产不卡av网站在线观看| 精品午夜福利在线看| 丁香六月天网| 一本色道久久久久久精品综合| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 香蕉国产在线看| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国产成人精品在线电影| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 亚洲成色77777| 最近中文字幕高清免费大全6| 尾随美女入室| 综合色丁香网| 99re6热这里在线精品视频| 国产精品一区二区在线不卡| 国产成人午夜福利电影在线观看| 国产视频首页在线观看| 18禁国产床啪视频网站| 欧美精品av麻豆av| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 日韩中文字幕视频在线看片| 国产高清三级在线| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 午夜福利视频在线观看免费| 日韩中文字幕视频在线看片| 精品国产一区二区三区四区第35| 亚洲内射少妇av| 欧美精品高潮呻吟av久久| 国产成人免费观看mmmm| 精品亚洲成a人片在线观看| 日韩制服骚丝袜av| 精品亚洲成a人片在线观看| 亚洲国产av影院在线观看| 亚洲国产成人一精品久久久| 成人国产麻豆网| 国产爽快片一区二区三区| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕 | 母亲3免费完整高清在线观看 | 欧美 日韩 精品 国产| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕 | 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 女性被躁到高潮视频| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 街头女战士在线观看网站| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 亚洲av免费高清在线观看| 你懂的网址亚洲精品在线观看| av电影中文网址| 国产熟女欧美一区二区| 高清欧美精品videossex| 免费观看av网站的网址| 亚洲国产精品成人久久小说| 视频在线观看一区二区三区| 丰满饥渴人妻一区二区三| 久久99蜜桃精品久久| 久久精品久久久久久久性| 成人手机av| 妹子高潮喷水视频| 免费在线观看黄色视频的| 欧美成人精品欧美一级黄| 最黄视频免费看| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产一区二区在线观看日韩| 男人舔女人的私密视频| 久久精品国产自在天天线| 国产精品蜜桃在线观看| 精品久久久久久电影网| videos熟女内射| 各种免费的搞黄视频| 日本91视频免费播放| 亚洲精品乱久久久久久| 夜夜爽夜夜爽视频| 伦理电影免费视频| 欧美人与善性xxx| 天堂8中文在线网| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 高清不卡的av网站| 人体艺术视频欧美日本| 国产亚洲精品久久久com| 久久99一区二区三区| 下体分泌物呈黄色| 全区人妻精品视频| 曰老女人黄片| 国产黄色免费在线视频| 国产成人欧美| 少妇人妻 视频| 国产在线一区二区三区精| 成人国产麻豆网| 极品少妇高潮喷水抽搐| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 秋霞伦理黄片| 国国产精品蜜臀av免费| 日韩成人伦理影院| 最近中文字幕高清免费大全6| 五月开心婷婷网| 国精品久久久久久国模美| 熟女av电影| 青青草视频在线视频观看| 久久鲁丝午夜福利片| av卡一久久| 亚洲成人av在线免费| 人妻人人澡人人爽人人| 男的添女的下面高潮视频| 一级黄片播放器| 国产精品偷伦视频观看了| 久久久久久人人人人人| 日韩制服骚丝袜av| 美女中出高潮动态图| 丰满乱子伦码专区| 亚洲欧美色中文字幕在线| 一级a做视频免费观看| 宅男免费午夜| 91精品国产国语对白视频| 国产精品一区二区在线观看99| av国产久精品久网站免费入址| 在线天堂最新版资源| 我要看黄色一级片免费的| 满18在线观看网站| 青春草国产在线视频| 婷婷色综合大香蕉| av黄色大香蕉| 夫妻午夜视频| 久久久久精品人妻al黑| 精品卡一卡二卡四卡免费| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 在线 av 中文字幕| 国产精品国产三级专区第一集| 国产精品蜜桃在线观看| 国产精品成人在线| 亚洲精品456在线播放app| 草草在线视频免费看| 国产精品久久久av美女十八| 男女高潮啪啪啪动态图| 国产一区二区三区综合在线观看 | a级毛片在线看网站| 欧美丝袜亚洲另类| 精品久久久久久电影网| 男女无遮挡免费网站观看| 伦理电影免费视频| www.av在线官网国产| videossex国产| 男女下面插进去视频免费观看 | 极品人妻少妇av视频| 国产一区有黄有色的免费视频| 欧美少妇被猛烈插入视频| 国产毛片在线视频| 国产免费一区二区三区四区乱码| 成人毛片a级毛片在线播放| 欧美丝袜亚洲另类| 99热网站在线观看| 考比视频在线观看| 久久青草综合色| 老司机影院毛片| 国内精品宾馆在线| 国产黄频视频在线观看| 国产在线一区二区三区精| 大片电影免费在线观看免费| 18禁国产床啪视频网站| 免费日韩欧美在线观看| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 高清视频免费观看一区二区| 国产免费视频播放在线视频| 天堂中文最新版在线下载| 亚洲五月色婷婷综合| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产色爽女视频免费观看| www.熟女人妻精品国产 | 久久国内精品自在自线图片| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| a级毛色黄片| 亚洲国产av影院在线观看| 国产淫语在线视频| 久久99热这里只频精品6学生| 熟女电影av网| 三级国产精品片| 久久久久精品久久久久真实原创| 久久狼人影院| 天堂8中文在线网| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 熟女人妻精品中文字幕| 久久精品国产自在天天线| 午夜影院在线不卡| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 90打野战视频偷拍视频| 国产黄色视频一区二区在线观看| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 国产av码专区亚洲av| 午夜激情av网站| 波多野结衣一区麻豆| 国产高清三级在线| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 全区人妻精品视频| 在线观看www视频免费| 少妇被粗大猛烈的视频| 亚洲国产看品久久| 亚洲,一卡二卡三卡| 高清黄色对白视频在线免费看| 成人二区视频| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 一级毛片我不卡| 一级,二级,三级黄色视频| 免费黄网站久久成人精品| 国产激情久久老熟女| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 91国产中文字幕| 乱码一卡2卡4卡精品| 国产精品一区二区在线不卡| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 少妇人妻久久综合中文| 亚洲人成网站在线观看播放| videossex国产| 国产精品国产三级专区第一集| 十八禁高潮呻吟视频| 成人影院久久| 久久国产精品大桥未久av| 九色亚洲精品在线播放| 国产极品粉嫩免费观看在线| 精品人妻在线不人妻| 热re99久久国产66热| 亚洲精品自拍成人| 新久久久久国产一级毛片| 成人漫画全彩无遮挡| 久久久久久久久久人人人人人人| 人妻系列 视频| 成人国语在线视频| 十八禁网站网址无遮挡| 亚洲国产精品成人久久小说| 成人国产麻豆网| 另类亚洲欧美激情| av电影中文网址| 两性夫妻黄色片 | 国产一区二区在线观看av| 精品人妻在线不人妻| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 久久99精品国语久久久| 日本91视频免费播放| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 国产福利在线免费观看视频| 18禁观看日本| 97在线视频观看| 99精国产麻豆久久婷婷| 国产69精品久久久久777片| 精品午夜福利在线看| 黄色一级大片看看| 久久精品夜色国产| 少妇人妻久久综合中文| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 热99国产精品久久久久久7| 五月伊人婷婷丁香| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 精品久久久精品久久久| 亚洲精品,欧美精品| 少妇精品久久久久久久| av国产精品久久久久影院| 伊人亚洲综合成人网| 自线自在国产av| 在线观看国产h片| 香蕉丝袜av| 成人二区视频| 亚洲欧洲日产国产| 人体艺术视频欧美日本| 亚洲精品456在线播放app| 国产激情久久老熟女| 亚洲人成77777在线视频| 久久精品久久久久久久性| 大片电影免费在线观看免费| 久久女婷五月综合色啪小说| 在线观看www视频免费| 一级片'在线观看视频| 国产成人精品在线电影| 在线观看www视频免费| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 少妇高潮的动态图| 日韩一区二区三区影片| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 女性生殖器流出的白浆| 99热这里只有是精品在线观看| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 天堂俺去俺来也www色官网| 精品午夜福利在线看| 亚洲成色77777| 成人二区视频| 欧美另类一区| 国产av码专区亚洲av| 国产精品蜜桃在线观看| 国产视频首页在线观看| 亚洲av日韩在线播放| 亚洲精品一区蜜桃| 日本爱情动作片www.在线观看| 日韩av在线免费看完整版不卡|