固有免疫相關(guān)編碼基因在奶牛乳腺炎調(diào)節(jié)中的研究進展

胡啟超 羅仍卓么 魏大為 楊箭 賈立 王興平 馬云

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川 750021）

奶牛乳腺炎是由病原微生物感染乳腺組織而產(chǎn)生的一種復(fù)雜性疾病，其發(fā)病率高，治愈率低，易復(fù)發(fā)，可造成產(chǎn)奶量下降，乳品質(zhì)降低，甚至被迫奶牛過早淘汰，給現(xiàn)代奶業(yè)造成了極大的經(jīng)濟損失［1］。影響奶牛乳腺炎的因素很多，包括奶牛個體狀況、飼養(yǎng)環(huán)境（主要為病原微生物）和飼養(yǎng)管理等。在個體狀況中，機體固有免疫與乳腺炎的易感性、抗病性和發(fā)病程度密切相關(guān)［2］。

乳腺組織是宿主被病原微生物侵入時的重要結(jié)構(gòu)屏障，而乳腺上皮細胞（bMEC）是奶牛乳腺組織的主要細胞類型，在宿主被病原微生物侵入后的固有免疫反應(yīng)中起著重要的作用。近年來，學(xué)者們以奶牛乳腺組織和bMEC炎癥模型為研究材料，進行奶牛乳腺炎的分子機制研究。本文綜述了乳腺固有免疫相關(guān)編碼基因在奶牛乳腺炎調(diào)節(jié)中的研究進展，為系統(tǒng)了解奶牛乳腺炎的分子機制提供參考。

1 固有免疫相關(guān)編碼基因的分類

固有免疫是動物機體在長期進化過程中形成的一種防御機制，可對感染的病原體作出迅速應(yīng)答，產(chǎn)生非特異抗感染作用［2］。根據(jù)編碼基因及其蛋白質(zhì)在固有免疫反應(yīng)中的作用特點，可將固有免疫編碼基因分為：細胞模式識別受體基因（如TLRs和NODs）、信號通路相關(guān)基因（NF-κB信號通路等相關(guān)基因）、炎癥細胞因子基因（TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10和IL-1β等）、炎癥趨化因子基因（CC、CXC和CXCL家族基因等）、宿主防御素（如BNBD家族和DEFB家族基因）和抗菌肽（如LAP）等。上述基因雖然在功能上相對獨立，特點明顯，但是在啟動固有免疫反應(yīng)和抗感染作用中具有協(xié)同作用，如：bMEC在病原體或病原體相關(guān)分子模式（如LPS，E.coli細胞表面成分）的刺激下，可激活Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）和NOD樣受體（NOD-like receptors，NLRs）介導(dǎo)的NF-κB信號通路，使促炎癥細胞因子和炎癥趨化因子的分泌迅速增加［3］，從而誘導(dǎo)T細胞活化、增殖與分化，并促使白細胞向感染部位定向遷移，起到抗感染作用［4］。此外，bMEC表達的宿主防御素和抗菌肽具有加強固有免疫反應(yīng)的作用［5］。

2 固有免疫相關(guān)編碼基因在奶牛乳腺炎中的表達模式

奶牛乳腺炎的分子機制非常復(fù)雜，其發(fā)生和發(fā)展過程受多個基因的共同調(diào)節(jié)［6］。為了闡明奶牛乳腺炎的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，近年來，國內(nèi)外學(xué)者分別采用候選基因qPCR、基因芯片和高通量測序等技術(shù)［7］，檢測了乳腺組織、bMEC和血液中的基因表達譜，并篩選了大量的差異表達基因（Differentially expressed genes set，DEGs），其中有很多基因功能富集在奶牛乳腺固有免疫信號通路上。

2.1 乳腺組織固有免疫相關(guān)編碼基因的表達譜分析

奶牛乳腺組織是病原微生物感染的首要部位，在機體固有免疫中極其重要［3，8］。近些年，國內(nèi)外學(xué)者利用qPCR方法在臨床乳腺炎奶牛的乳腺組織中檢測出了TLR2、TLR4、IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α、CXCL10、CD14和CCL5等DEGs［9-10］，而且這些基因參與了TLRs、NF-κB和MAPK等固有免疫相關(guān)的信號通路。此外，還發(fā)現(xiàn)在病原微生物感染乳腺組織前后，β-防御素家族中的DEFB1、BNBD4、BNBD5、BNBD10和LAP基因在奶牛乳腺組織中的表達量也發(fā)生了顯著變化［11］。

除了臨床乳腺炎的乳腺組織的基因表達譜研究外，學(xué)者們也對常見病原菌誘導(dǎo)炎癥的乳腺組織進行了高通量測序分析。Mitterhuemer等［12］對感染E.coli6 h和24 h后的奶牛乳腺組織中分別篩選出13個和2 154個DEGs，其中包括抗菌基因（S100A8、S100A9、S100A12和CXCL2），急性期基因（LBP、SAA3、C6、C4BPA和IF）和氧化應(yīng)激相關(guān)基因等，涉及固有免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)、抗原處理和呈遞、細胞因子的分泌、蛋白質(zhì)降解和細胞凋亡等過程。而羅仍卓么等［13］在E. coli感染7 d后的奶牛乳腺組織中也篩選出了包括TLR4、S100A8、S100A9和LAP在內(nèi)的2 388個DEGs。此外，學(xué)者們在S. aureus感染的奶牛乳腺組織中也進行了mRNA表達模式研究。Wang等［14］對S. aureus感染的奶牛乳腺組織進行了轉(zhuǎn)錄組測序，結(jié)果表明在感染組中檢測到了602個表達上調(diào)和750個表達下調(diào)的mRNA，其中ITGB6、MYD88、ADA和TNFRSF1B基因與固有免疫有關(guān)。Fang等［15］分別采用高濃度和較低濃度的S.aureus感染奶牛乳房，24 h后在高濃度和低濃度感染組分別檢測到194和21個DEGs。羅仍卓么等［13］和Kosciuczuk等［16］采用S. aureus誘導(dǎo)奶牛乳腺組織，前者在誘導(dǎo)7 d后的奶牛乳腺組織中篩選出了1 693個表達上調(diào)和949個表達下調(diào)的mRNA，后者發(fā)現(xiàn)差異表達基因數(shù)目和表達水平與奶牛的泌乳期有關(guān)。上述研究結(jié)果說明，乳腺組織在感染后使得mRNA表達產(chǎn)生變化，來應(yīng)對抗感染的生物學(xué)過程。但是，感染菌的類型、感染劑量、誘導(dǎo)時間和檢測方法等都會影響篩選出的DEGs的類型、數(shù)目以及表達量變化差異倍數(shù)［13，16］。值得一提的是，上述研究結(jié)果有一個共同點，即：差異表達基因的KEGG和GO功能富集結(jié)果均富集到了TLRs信號通路、趨化因子信號通路和MAPK等固有免疫信號通路上［12-16］?？梢?，固有免疫信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)是乳腺炎發(fā)生和發(fā)展的必要生物學(xué)過程。

2.2 bMEC炎癥反應(yīng)中的mRNA表達譜分析

bMEC是乳腺組織主要的細胞類型，在外源病原微生物感染乳腺早期發(fā)揮重要作用。因此，在研究奶牛乳腺炎的分子機制時，學(xué)者們常常以誘導(dǎo)炎癥的bMEC作為細胞模型展開相關(guān)研究［17］。

眾所周知，脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）和脂磷壁酸（Lipteichoic acid，LTA）分別是E.coli和S.aureus的主要致毒因子［18］。Xu等［19］用LPS和LTA刺激bMEC，通過RNA-Seq技術(shù)研究這兩種不同毒力因子對bMEC轉(zhuǎn)錄組的影響，結(jié)果在LPS處理組檢測到95個表達上調(diào)和5個表達下調(diào)基因；而在LTA處理組檢測到表達上調(diào)和表達下調(diào)基因各12個，說明在固有免疫應(yīng)答中，LPS較LTA有更強的感染刺激作用。結(jié)合Strandberg等［20］學(xué)者的研究結(jié)果，共同解釋了E. coli常常會引起急性乳腺炎，而S.aureus則會引起慢性乳腺炎。此外，學(xué)者們也利用基因芯片技術(shù)檢測了S. uberis感染的bMEC，發(fā)現(xiàn)了固有免疫相關(guān)基因C3、IL-8、IFN-γ、IL-10、IL-1β、IL-6、TLR2、TNF-α、SAA3、LF和LBP的mRNA在處理組中的表達量顯著上調(diào)［21］。Wang等［22］用S56、S178和S36共3株不同毒力因子的S. aureus處理體外培養(yǎng)的bMEC，3 h后進行轉(zhuǎn)錄組測序，結(jié)果顯示S56處理組有1 028個表達上調(diào)和692個表達下調(diào)的mRNA；S178處理組有249個表達上調(diào)和178個表達下調(diào)的mRNA；S36 處理組有172個表達上調(diào)和47個表達下調(diào)的mRNA。上述DEGs功能都富集到了固有免疫相關(guān)的NOD樣受體和趨化因子受體信號通路上，可見在不同病原菌或病原體相關(guān)分子模式（Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）誘導(dǎo)的bMEC炎癥反應(yīng)中，差異表達mRNA參與調(diào)節(jié)了細胞固有免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)。

3 奶牛乳腺固有免疫相關(guān)主要信號通路的研究進展

在病原體感染乳腺組織的早期，機體細胞表面的模式識別受體（Pattern-recognition receptors，PRRs），主要包括TLRs和NLRs，可快速識別PAMPs，激活固有免疫相關(guān)信號通路，使機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)［2，23］。固有免疫信號通路主要包括TLR2/TLR4介導(dǎo)的NF-κB信號通路和NOD1/NOD2介導(dǎo)的NF-κB信號通路。

3.1 TLR2/TLR4介導(dǎo)的NF-κB信號通路

TLRs是一類細胞跨膜蛋白，廣泛表達于包括動物乳腺在內(nèi)的多種組織，是首先被發(fā)現(xiàn)的PRRs［24］。牛TLRs有10個家族成員（TLR1-10）［25］，其中TLR2和TLR4分別是識別革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的主要成員，也是奶牛乳腺感染先天防御的關(guān)鍵傳感器［26］。研究表明，在病原微生物感染機體后，TLR2和TLR4基因的表達量升高［27］，所表達的蛋白質(zhì)胞外LRR結(jié)構(gòu)域可識別多種病原微生物的PAMPs［23］，而胞內(nèi)TIR功能域可集結(jié)MyD88和TRIF等接頭分子。通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活細胞內(nèi)NF-κB和AP1等炎性信號通路［28］，最終使核轉(zhuǎn)錄因子活化，導(dǎo)致相關(guān)炎性介質(zhì)基因表達與分泌，招募免疫細胞到感染部位，激活相關(guān)免疫細胞，以清除病原微生物［29］。

近年來，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)了miRNA可調(diào)節(jié)TLRs介導(dǎo)的NF-κB信號通路，從而調(diào)控奶牛乳腺炎癥［30］。目前已發(fā)現(xiàn)牛miR-146a可靶向抑制TRAF6和TLR4基因的表達，負反饋調(diào)節(jié)TLR4/TRAF6/NF-κB通路，進而緩解bMEC炎癥反應(yīng)［31］。Yang等［32］研究表明，小鼠miR-106a是LPS通過TLR4/NF-κB信號途徑刺激炎癥反應(yīng)的負反饋調(diào)節(jié)因子。上述研究可能為乳腺炎提供一種潛在的分子治療的方法。

除了TLRs介導(dǎo)的固有免疫分子機制的研究外，學(xué)者們也利用這些機制開展了抗炎方面的研究。Gondaira等［33］研究結(jié)果表明，活牛分枝桿菌可抑制bMEC中TLR2和TLR4基因的表達。Sun等［34］發(fā)現(xiàn)外源性H2S通過減輕LPS誘導(dǎo)的bMEC氧化應(yīng)激，阻斷TLR4/NF-κB通路發(fā)揮抗炎作用。而Li等［35］通過超表達泛素樣修飾酶1（UFL1）抑制了TLR4/NF-κB通路的激活，減輕了內(nèi)毒素誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、細胞凋亡、自噬和氧化應(yīng)激，從而減輕了炎癥反應(yīng)和細胞損傷。Wang等［36］實驗表明苯丁酸鈉通過抑制TLR2/NF-κB/NLRP3信號通路而減輕S.aureus誘導(dǎo)的細胞炎癥反應(yīng)。

3.2 NOD1/NOD2介導(dǎo)的NF-κB信號通路

NLRs是發(fā)現(xiàn)不久的一類細胞內(nèi)PRRs，從結(jié)構(gòu)上可分為NLRCs和NLRPs，與多種疾病和自發(fā)炎癥失調(diào)密切相關(guān)［37］。NOD1和NOD2是NLRs家族的主要成員，是識別病原體的胞漿受體，可以被PAMPs激活［38］。在穩(wěn)定狀態(tài)下，NLRs以自動抑制非活化的形式存在，而在病原體感染后，它們通過C端LRR結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)受體相互作用蛋白2（RIP2），激活下游的NF-κB信號途徑［39］。有研究表明，NODs還可以與NLRPs分子（如NLRP1、NLRP3和NLRP12）相互作用，并導(dǎo)致Caspase-1的激活和IL-1β、IL-18的活化，與細胞凋亡和炎癥壞死有關(guān)［37］。除此之外，NODs也可使MAPK信號通路中的Iκ-Bα、P38、ERK和JNK磷酸化，從而使得細胞因子、趨化因子、一氧化氮和活性氧的產(chǎn)生，進而使得細胞產(chǎn)生炎癥［40］。

NOD樣受體家族是一類重要的模式識別受體，可參與調(diào)控乳腺固有免疫進程。Askarian等［37］研究表明，小鼠乳腺中NOD1和NOD2基因表達量與RIP2、NF-κB、IL-6以及TNF-α的表達量成正相關(guān)關(guān)系，表明NOD1/NOD2可能是S. aureus的識別受體，可通過識別S. aureus激活NF-κB信號通路，促進IL-6和TNF-α的表達，參與免疫應(yīng)答［41］。Wu等［42］研究發(fā)現(xiàn)E. coli感染引起宿主細胞內(nèi)NOD1和NOD2表達增加，從而激活NLRP 3炎癥小體，引起Caspase-1和促炎細胞因子基因的轉(zhuǎn)錄上調(diào)，促使細胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。但是，他們又發(fā)現(xiàn)可通過添加鼠李糖乳桿菌GR-1來限制過度和有害的炎癥反應(yīng)。Wei等［43］研究表明，通過抑制NOD1依賴的NF-κB激活可使中性粒細胞NOD1的表達略有下降，而NOD1/NF-κB通路的損傷可能導(dǎo)致圍產(chǎn)期奶牛感染早期中性粒細胞存活減少，從而引起E. coli型乳腺炎的易感性增加。上述研究為進一步分析NLRs在奶牛不同類型乳腺炎中的分子作用有一定指導(dǎo)意義，為乳腺炎治療新策略帶來了新的前景。

3.3 TLRs與NODs協(xié)同調(diào)控病原菌引起的固有免疫應(yīng)答

TLRs可以多途徑激活NF-κB信號通路，而NODs只能依賴于RIP2。倘若細胞內(nèi)RIP2基因被敲除，NODs介導(dǎo)的NF-κB信號通路的活化就會被完全阻斷［44］。近些年來有報道稱，RIP2也可以激活MAPK信號通路，并且可參與到TLRs介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中。若RIP2基因缺失，TLRs信號通路誘導(dǎo)的炎癥細胞因子的產(chǎn)生就會大程度減少［45］。從以上得知TLRs與NLRs在參與機體免疫反應(yīng)的過程中有各自的信號通路，但同時又相互協(xié)同，識別了病原菌的TLRs會促進NODs mRNA表達的上調(diào)（圖1）。

盡管如此，在NODs基因缺失的情況下，機體對病原菌的清除能力顯著下降，相反，在TLR2/TLR4基因缺失的情況下，機體的固有免疫細胞對病原菌的清除能力并不受過多影響［46］。同樣還有研究表明，當(dāng)TLRs缺失或不足時，NOD1會發(fā)揮免疫作用；在機體感染了革蘭氏陽性菌時，NOD2可以繞過TLRs途徑直接發(fā)揮清除病原菌的作用，而NOD1會在NOD2缺失或不足時才會發(fā)揮抗感染作用［43］。另外，NOD2基因缺失的巨噬細胞，不能識別菌體的細胞壁成分，此時NOD1活化，激活NF-κB和MAPK途徑，從而發(fā)揮免疫應(yīng)答作用［47］，這些研究強有力的證實了NOD1/NOD2在機體發(fā)揮固有免疫抵抗病原菌的機制中占有重要地位［48］。從以上研究結(jié)果可以看出，編碼基因調(diào)控病原菌引起的固有免疫應(yīng)答過程是非常復(fù)雜的，確定各個信號通路之間的關(guān)系尤為重要，通過總結(jié)完善PRRs之間協(xié)同調(diào)控的信號通路機制網(wǎng)絡(luò)，可為系統(tǒng)了解奶牛乳腺固有免疫的分子調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。

圖1 TLRs與NODs協(xié)同調(diào)控病原菌引起的固有免疫應(yīng)答［23］

4 固有免疫相關(guān)編碼基因的SNP與乳腺炎的關(guān)聯(lián)

在奶牛乳腺炎固有免疫相關(guān)編碼基因方面，除了研究分子調(diào)控機制外，學(xué)者們也試圖挖掘與奶牛乳腺炎易感性或抗病性密切相關(guān)的SNP位點。近年來，關(guān)于奶牛乳腺炎相關(guān)SNP的研究，主要集中在TLRs/NF-κB和趨化因子信號通路相關(guān)基因上。

4.1 TLRs/NF-κB信號通路相關(guān)基因SNP與乳腺炎的關(guān)聯(lián)

如上所述，TLRs/NF-κB信號通路是奶牛固有免疫的主要信號通路。在奶牛乳房炎SNP挖掘方面，主要集中在TLR4、TLR2和IRAK2基因上。

關(guān)于TLR4基因，王興平等［49］系統(tǒng)檢測了荷斯坦牛TLR4基因的SNPs，共發(fā)現(xiàn)了31個SNPs，其中EXON2-24和TIR2AA位點上的AA基因型為乳腺炎抗性基因型；陳仁金等［50］發(fā)現(xiàn)TLR4基因1760C＞T突變位點的等位基因C為優(yōu)勢等位基因，其個體具有更低的體細胞評分（SCS）。Wang等［51］進行了404頭中國荷斯坦牛、三河牛和中國西門塔爾牛的TLR4基因的6個SNPs進行單倍型構(gòu)建及其效應(yīng)分析，發(fā)現(xiàn)Hap2、Hap4和Hap12對SCS有負效應(yīng)，而Hap13對SCS有正效應(yīng)。

關(guān)于TLR2基因，馬騰壑等［52］發(fā)現(xiàn)TLR2基因的EcoR V酶切多態(tài)位點BB基因型個體的SCS顯著低于AA和AB基因型個體，說明BB基因型可能為抵御乳腺炎的有利基因型。Zhang等［53］在TLR2基因編碼胞外結(jié)構(gòu)域的編碼區(qū)檢測到385T＞G、398G＞A和1884G＞A的3個錯義突變，并發(fā)現(xiàn)385T＞G位點的GG基因型個體的SCS均值顯著低于TT基因型和TG基因型個體。

此外，學(xué)者們也進行了TLRs信號通路關(guān)鍵基因IRAK2的多態(tài)性與奶牛乳腺炎的關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明IRAK2基因g.28879位點的CC基因型個體的SCS顯著低于CT基因型個體，且以加性效應(yīng)為主；g.28916位點的GG基因型個體的SCS顯著低于AG基因型個體［54］。

4.2 NOD2與趨化因子相關(guān)基因與乳腺炎的關(guān)聯(lián)

NOD2作為PRRs的主要成員，在乳腺炎的關(guān)聯(lián)分析上，也受到學(xué)者們關(guān)注。Pant等［55］發(fā)現(xiàn)加拿大荷斯坦牛NOD2基因編碼區(qū)c.3020A＞T與SCS的EBVs相關(guān)。Wang等［56］在中國荷斯坦牛和中國西門塔爾牛NOD2基因第12外顯子144A＞T和1594G＞A發(fā)現(xiàn)兩個突變位點的基因型組合BBFF的SCS極顯著高于其他基因型組合。在趨化因子基因方面，李虹［57］對奶牛CXCL1基因3'UTR及5'端側(cè)翼區(qū)的3個SNPs進行單倍型組合分析發(fā)現(xiàn)，H1H1、H2H4和H3H4單倍型組合（H1∶CCA；H2∶CCG；H3∶ATA 和H4∶ATG）具有較低的SCS。郭潤晴［58］發(fā)現(xiàn)奶牛CCL5基因5'端側(cè)翼區(qū)的g.727 T＞A可調(diào)控啟動子的活性，其TT基因型個體的SCS顯著高于AA基因型個體，還發(fā)現(xiàn)CCL5基因3'UTR的g.7413 G＞A可抑制牛miR-2295和靶標3'UTR的結(jié)合，其野生型（GG）個體的SCS顯著高于突變型（AA）個體。

目前，雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了影響奶牛乳腺炎的多個SNP位點，但是這些SNP影響乳腺炎的具體分子調(diào)控機制尚不完全清楚，能真正用于抗乳腺炎分子育種的分子標記位點仍然有限，更多的SNP以及調(diào)控機制有待于深入研究和在大群體中驗證。

5 展望

隨著高通量測序和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對大量數(shù)據(jù)進一步挖掘成為篩選奶牛固有免疫相關(guān)基因和分子標記的重要途徑。如前文所述，現(xiàn)已獲得了部分奶牛乳房炎固有免疫相關(guān)編碼基因的表達模式、分子作用機制和分子標記位點。然而，固有免疫反應(yīng)在不同細胞類型和不同亞細胞結(jié)構(gòu)中有多種識別機制，其在奶牛乳腺炎中的分子調(diào)控機制也尚未完全闡明。特別是關(guān)于候選基因與乳腺炎的關(guān)聯(lián)性及其群體遺傳多態(tài)性與乳腺炎的準確關(guān)系，以及如何用于分子標記進行輔助抗乳房炎分子育種和分子治療等方面的研究還很缺乏。因此，繼續(xù)篩選可能用于提高奶牛固有免疫力的候選基因和分子標記，更深入地探索PRRs之間相互作用以及固有免疫與適應(yīng)性免疫的聯(lián)動控制，仍然顯得尤為重要。