產(chǎn)電海洋脂肪酶生產(chǎn)菌的分離篩選鑒定及培養(yǎng)條件研究

黃陽天 陸育彪 黃益帖 孟繁龍 徐凱文 李鵬

（浙江海洋大學海洋科學與技術(shù)學院，舟山 316022）

脂肪酶（Lipase，3.1.1.3）是一類具有多種催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些不溶性酯類的水解、醇解、酯化、轉(zhuǎn)酯化及酯類的逆向合成反應(yīng)［1-2］。除此之外，還表現(xiàn)出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、膽固醇酯酶活性等［3］，廣泛存在于動物組織，植物種子和微生物中，尤其是微生物中脂肪酶種類最多。

脂肪酶的來源主要是通過微生物的發(fā)酵液提取，其主要原因是微生物脂肪酶反應(yīng)條件溫和，對溫度和 pH 值的適宜范圍較寬。微生物脂肪酶在食品加工［4-6］、洗滌劑［7-8］、生物柴油［9-10］、脫墨技術(shù)［11-12］、飼料［13-14］、生物制藥［15-16］等現(xiàn)代工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用前景。與國外相比，國內(nèi)脂肪酶的研究與開發(fā)相對較晚，應(yīng)用在工業(yè)生產(chǎn)中的脂肪酶種類有限，具有新型酶學性質(zhì)的脂肪酶種類稀少。

目前對于產(chǎn)脂肪酶微生物來源研究主要集中于極端環(huán)境中分離獲得，如高滲、高壓的海洋環(huán)境［17］，低溫環(huán)境［18］，高鹽堿性［19］及高溫［20］等自然環(huán)境，甚至從魚類消化道中也獲得具有特殊酶學性質(zhì)的脂肪酶［21］，因此微生物脂肪酶的開發(fā)利用潛力非常巨大。研究發(fā)現(xiàn)，有 65 個屬的微生物能產(chǎn)脂肪酶，其中 28 個屬是細菌，而報道被用于商品化的細菌脂肪酶只有8種［22］，隨著在科研和工業(yè)領(lǐng)域中脂肪酶的應(yīng)用越來越廣泛，陸生常見的脂肪酶越來越不適應(yīng)現(xiàn)代要求，對脂肪酶的要求也逐漸轉(zhuǎn)變成在極端反應(yīng)體系中的高催化、高活性與穩(wěn)定性。海洋來源的脂肪酶往往具備在高壓高滲透高鹽環(huán)境下特殊的催化活性，因此也成為將來的研究熱點。

本研究通過對潮間帶海泥分離篩選產(chǎn)脂肪酶海洋細菌，并進行菌種鑒定及酶活影響因素分析，旨在為海洋脂肪酶的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 準備無菌采集袋，采集舟山本島附近海洋潮間帶海泥，分別采樣長峙島、朱家尖、富翅島潮間帶海泥，帶回實驗室4℃冰箱暫時保存，一天內(nèi)處理完樣品。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB-1%橄欖油乳化液固體培養(yǎng)基（分離篩選培養(yǎng)基）：蛋白胨 2%、酵母膏 0.5%、氯化鈉1%、橄欖油乳化液 1%、瓊脂 2%；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏 3 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，瓊脂 18 g，海水 1 L；LB 瓊脂培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g，氯化鈉 10 g，海水 1 L，瓊脂 18 g；種子培養(yǎng)基：葡萄糖 10 g，蛋白胨 5 g，K2HPO4，MgSO40.5 g；海水1 L；發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨 5 g，尿素 0.25 g，甘油 5 g，NaHCO31 g，K2PO42 g，Tween80 15 mL，橄欖油 1.1%，海水1 L。上述培養(yǎng)基均121℃滅菌30 min，pH值均為7.2。

1.2 方法

1.2.1 分離篩選及純化 稱取泥樣10 g，放入 90 mL無菌水的三角瓶中（加玻璃珠），搖床 230 r/min 振蕩 30 min，即為稀釋度為 10-1的土壤懸液。取滅菌試管5支，每支裝 4.5 mL 無菌水，編號 10-2、10-3、10-4、10-5和 10-6。吸取 0.5 mL 稀釋度 10-1的土壤液，加入 10-2的無菌水試管中，輕輕吹吸數(shù)次，使之充分混勻，即成 10-2梯度稀釋液。依次制成 10-3、10-4、10-5和 10-6稀釋液。10-4-10-6三個稀釋度分別取 0.1 mL于分離培養(yǎng)基中，進行涂布，每個稀釋度做9個平行，后于37℃倒置培養(yǎng) 1-2 d，觀察菌落周圍是否出現(xiàn)透明圈。待出現(xiàn)有透明圈菌株，挑取于分離篩選培養(yǎng)基劃線，連續(xù)重復3次劃線后，斜面保種備用。

1.2.2 脂肪酶酶活測定 將斜面培養(yǎng)物接種一環(huán)到種子培養(yǎng)基，200 r/min，培養(yǎng)至OD600=1.5，即到對數(shù)生長期，按照2%的接種量，接種至50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，繼續(xù)200 r/min，培養(yǎng)1-2 d后，以橄欖油乳化液為底物，采用 NaOH 滴定分析法。每毫升酶液，在一定的溫度和條件下，每分鐘水解底物，產(chǎn)生1 μmoL的可滴定游離脂肪酸，定義為一個脂肪酶活力單位（U），單位為U/mL，其計算公式如下：

式中，V樣為滴定至終點時樣品瓶中消耗的NaOH的體積（mL）；V空為滴定至終點時對照瓶中消耗的NaoH的體積（mL），MNaOH為NaOH的摩爾濃度；T為反應(yīng)時間（min）；V酶為加入到反應(yīng)體系中的酶液的體積（mL）。

1.2.3 分子鑒定及電鏡形態(tài)掃描 取較高脂肪酶活性的海洋細菌作為目標菌株，進行16S rRNA基因分析，利用試劑盒提取染色體DNA，利用PCR擴增16S rDNA片段，通用引物（F1：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，F(xiàn)2：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'），PCR反應(yīng)體系：Template 0.5 μL；10×Buffer 2.5 μL；dNTP1 μL；Taq酶0.2 μL；Primer1 0.5 μL；Primer 2 0.5 μL；ddH2O 19.8 μL，PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，后利用SanPrep 柱式PCR 產(chǎn)物純化試劑盒回收，對回收的DNA進行測序，生工生物工程（上海）股份有限公司。利用BLAST對獲得的基因序列與GenBank中的序列進行比對，采用MEGA5.0的鄰接方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［23-25］。形態(tài)觀察采用電鏡SEM掃描。

1.2.4 發(fā)酵條件對酶活影響的研究 分別取培養(yǎng)時間12 h、24 h、36 h、48 h、60 h和72 h的發(fā)酵液，培養(yǎng)溫度為30℃，進行酶活的測定；分別調(diào)整發(fā)酵液的初始pH值為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)溫度為30℃以后測酶活；分別調(diào)整發(fā)酵培養(yǎng)基每升中的尿素含量為0.15 g、0.25 g、0.35 g、0.45 g、0.55 g和0.60 g，培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)溫度為30℃以后測酶活；培養(yǎng)溫度分別在25、30、35、40、45和50℃，培養(yǎng)時間為48 h，測脂肪酶酶活。

1.2.5 產(chǎn)電性能的測試 先構(gòu)建H型雙室MFC燃料電池，陽極和陰極室中間由離子交換膜隔開，兩極的碳布電極由銅導線連接，并外接1 000 Ω電阻，電池輸出電壓的采集由數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)（上海U00249）連接計算機完成，陽極室添加60 mL的搖床培養(yǎng)2 d至對數(shù)生長期的菌液為陽極電極液；陰極室添加同體積的50 mm的鐵氰化鉀溶液，菌株活化后取1 mL菌懸液接種到60 mL陽極液，運行MFC測試電壓的輸出，30 min記錄數(shù)據(jù)一次進行繪圖。

2 結(jié)果

2.1 海洋脂肪酶細菌的篩選

本研究共篩選到10株產(chǎn)透明圈的脂肪酶生產(chǎn)菌，并挑取其中兩株產(chǎn)較大透明圈且透明圈直徑/菌落直徑的值較大的細菌進行研究。其中菌株S11、S22的比值分別為3.01與2.85。

2.2 脂肪酶酶活的測定

采用NaOH滴定分析法，以酚酞試劑為指示劑，進行脂肪酶酶活的測定（表1）。重復3次取平均值，測酶活S11為15.2 U/mL，S22為20.8 U/mL。

2.3 分子鑒定結(jié)果及SEM掃描圖

對PCR擴增產(chǎn)物進行序列測定，得到的兩株菌株的序列分別為1 471 bp和1 484 bp。將序列已上傳至NCBI 的GenBank進行比對（采用clustalx1.83軟件），將比對結(jié)果利用MEGA 5.0的鄰接（N-J）方法，基于16S rRNA序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。由圖1可知，菌株S11屬于假單胞屬，在進化位置上與Pseudomonas putidaWAB1947最近，相似性達到99.8%，S22與芽孢桿菌屬Bacillus substillsLSRB在進化位置上最近，相似性達到99.9%，分別命名為Pseudomonassp. S11和Bacillussp.S22。將獲得的序列上傳至NCBI的GenBank，獲取登錄號分別為MW015750和MW015751。圖2為菌株S11和S22的電鏡掃描形態(tài)圖。將經(jīng)過產(chǎn)電輸出測試后的陽極碳布電極，經(jīng)過戊二醛固定后，送測SEM，結(jié)果顯示，在碳布電極表面，均有很好的菌株吸附現(xiàn)象，產(chǎn)生了膜狀及絲狀物質(zhì)，該物質(zhì)可能與菌株表現(xiàn)出的產(chǎn)電性能相關(guān)。

2.4 培養(yǎng)條件對脂肪酶酶活的影響

2.4.1 培養(yǎng)時間對脂肪酶酶活的影響 分別取培養(yǎng)時間12 h、24 h、36 h、48 h、60 h和72 h的發(fā)酵液，培養(yǎng)溫度為30℃，搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min，初始pH值為7.0，尿素含量為0.25 g，進行酶活的測定，結(jié)果如圖3所示。隨著培養(yǎng)時間增加，酶活逐漸增加，至48 h達到最大酶活，S11為15.3 U/mL，S22為21.2 U/mL，繼續(xù)培養(yǎng)，酶活逐漸下降。

圖2 菌株S11和S22的SEM掃描圖

2.4.2 初始pH值對脂肪酶酶活的影響 分別調(diào)整發(fā)酵液的初始pH值為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0，培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)溫度為30℃搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min，測酶活。結(jié)果如圖4所示，菌株S11和S22均在pH 7.0時達到最大酶活值，且隨著pH增加，酶活降低，當pH值到9.0時S11酶活消失，在此pH值時菌株S11的生長受限，導致無代謝產(chǎn)物生成。

2.4.3 尿素含量對脂肪酶酶活的影響 分別調(diào)整發(fā)酵培養(yǎng)基每L中的尿素含量為0.15 g、0.25 g、0.35 g、0.45 g、0.55 g和0.60 g，培養(yǎng)48 h，搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min，初始pH值為7.0，培養(yǎng)溫度為30℃以后測酶活，結(jié)果如圖5所示，當每升培養(yǎng)基中含的尿素含量超過0.55 g時，酶活迅速下降，可見過量的尿素含量對脂肪酶的產(chǎn)生起抑制作用。

圖3 培養(yǎng)時間對脂肪酶酶活的影響

圖4 初始pH值對脂肪酶酶活的影響

圖5 尿素含量對脂肪酶酶活的影響

2.4.4 培養(yǎng)溫度對脂肪酶酶活的影響 培養(yǎng)溫度分別在25、30、35、40、45和50℃，尿素含量為0.25 g/L，培養(yǎng)時間為48 h，搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min，初始pH值為7.0測酶活。結(jié)果如圖6所示。隨著溫度增加，兩株菌株的趨勢都是酶活先升高后降低，S11菌株在40℃時達到酶活最大值，S22菌株在35℃時到達最大值，在產(chǎn)酶條件中，菌株S11對溫度的耐受性要好于菌株S22。

圖6 培養(yǎng)溫度對脂肪酶酶活的影響

2.4.5 橄欖油含量對脂肪酶酶活的影響 分別調(diào)整發(fā)酵培養(yǎng)基每L中的橄欖油含量為0.5%、1.0%、1.5%、2%和2.5%，培養(yǎng)48 h，搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min，初始pH值為7.0，培養(yǎng)溫度為30℃以后測酶活，結(jié)果如圖7所示，當每升培養(yǎng)基中橄欖油含量超過2%時，酶活均略下降，過高的橄欖油含量對脂肪酶酶活具有一定的抑制作用。

圖7 橄欖油含量對脂肪酶酶活的影響

2.4.6 甘油含量對脂肪酶酶活的影響 分別調(diào)整發(fā)酵培養(yǎng)基每升中的甘油含量為2.5 g、5 g、7.5 g、10 g、12.5 g，培養(yǎng)48 h，搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min，初始pH值為7.0，培養(yǎng)溫度為30℃以后測酶活，結(jié)果如圖8所示，當每升培養(yǎng)基中含的甘油含量超過10 g/L時，酶活迅速下降，甘油濃度過高對酶活具有明顯的抑制作用。

2.5 產(chǎn)電能力的初步研究

將構(gòu)建好的H型MFC置于恒溫環(huán)境下（30℃），2 d后，逐漸有微弱電流產(chǎn)生，7 d后輸出電流較為穩(wěn)定，其中S11的最大輸出電壓為0.055 V，S22的最大輸出電壓為0.031 V，S1在18 d后輸出電壓逐漸降低，S22在20 d后輸出電壓逐漸降低。產(chǎn)脂肪酶菌株的產(chǎn)電性能較低。具體產(chǎn)電圖如圖9所示。

圖8 甘油含量對脂肪酶酶活的影響

圖9 菌株輸出電壓采集圖

3 討論

從舟山海域潮間帶中篩選到產(chǎn)脂肪的海洋細菌菌株S11和S22，基于16S rRNA序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示，菌株S11屬于假單胞屬，在進化地位上與Pseudomonas putidaWAB1947密切相關(guān)，S22芽孢桿菌屬Bacillus substillsLSRB在進化地位上密切相關(guān)，并分別命名為Pseudomonassp. S11和Bacillussp.S22，SEM掃描電鏡形態(tài)圖顯示S11菌株短桿狀，S22菌株呈現(xiàn)明顯的桿狀和短桿狀。利用NaOH滴定分析法進行脂肪酶酶活測定，結(jié)果顯示，菌株S11和S22的酶活分別是15.2 U/mL、20.8 U/mL。單因素實驗初步考查了培養(yǎng)時間、溫度、培養(yǎng)基中尿素含量、以及初始pH值對兩株菌株產(chǎn)酶的影響，結(jié)果顯示，菌株S11分別在培養(yǎng)48 h、初始pH 7.0、尿素含量為0.35 g/L、培養(yǎng)溫度為35℃時候?qū)?yīng)的酶活值最大；菌株S22分別在培養(yǎng)48 h、初始pH 7.0、尿素含量為0.35 g/L、培養(yǎng)溫度為40℃時候?qū)?yīng)的酶活值最大。構(gòu)建MFC分別進行產(chǎn)電性能測試，結(jié)果顯示菌株S11和S22的最大輸出電壓分別為0.055 V和0.031 V。

目前，來源于極端環(huán)境的海洋產(chǎn)脂肪酶細菌的報道較少，伍朝亞等［26］從渤海沉積物中分離篩選產(chǎn)脂肪酶細菌，分析其物種多樣性，結(jié)果顯示，Pseudoalteromonas、Marinobacter和Sulfitobacter三個屬的細菌屬于產(chǎn)脂肪酶的優(yōu)勢菌群。郝文惠等［27］在10℃恒溫培養(yǎng)條件下，從第29次南極科學考察獲得的南極深海沉積物樣品中分離篩選到產(chǎn)脂肪酶細菌3株，通過PCR擴增，獲得了脂肪酶全長序列，對該序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，該脂肪酶基因處于較獨立的分支。

利用產(chǎn)脂肪酶微生物可以分泌脂肪酶，水解油脂這一特性，將其應(yīng)用到含油脂廢水的處理上也是一種新的思路，在降解脂肪的同時，產(chǎn)生清潔能源-電能，更是一種十分具有前景的研究，Bacillus在作為微生物燃料電池（Microbial fuel cell，MFC）的陽極產(chǎn)電菌已有報道［28］，而Pseudoalteromonas則較少見報道。本研究希望能為產(chǎn)脂肪酶海洋細菌在污水處理中的使用奠定一定的研究基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

從舟山海域潮間帶中篩選到產(chǎn)脂肪酶的海洋細菌菌株S11和S22，16S rRNA序列鑒定結(jié)果顯示兩株菌分別屬于假單胞屬和芽孢桿菌屬，酶活測定顯示，兩菌株酶活分別是15.2 U/mL和20.8 U/mL。單因素實驗顯示菌株S11在培養(yǎng)48 h、初始pH 7.0、尿素含量為0.35 g/L、培養(yǎng)溫度為35℃時候?qū)?yīng)的酶活值最大；菌株S22在培養(yǎng)48 h、初始pH 7.0、尿素含量為0.35 g/L、培養(yǎng)溫度為40℃時候?qū)?yīng)的酶活值最大。產(chǎn)電性能測試結(jié)果顯示，菌株S11和S22的最大輸出電壓分別為0.055 V和0.031 V。