肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2C與骨質(zhì)疏松的研究進(jìn)展

何洋洋 趙玉馳 王力剛

(1.南華大學(xué)附屬邵陽醫(yī)院骨科，湖南邵陽 422000；2.深圳市鹽田區(qū)人民醫(yī)院骨科，廣東深圳 518000)

骨質(zhì)疏松癥是一種由骨量減少和骨組織微結(jié)構(gòu)改變形成的疾病，可導(dǎo)致骨強(qiáng)度下降、骨脆性增加和骨折風(fēng)險增加[1]。隨著人口老齡化和壽命延長，骨質(zhì)疏松癥正日益成為全球性疾病。目前，估計(jì)有超過2億人患有骨質(zhì)疏松癥[2]。由于我國社會老年化形勢進(jìn)一步加劇，骨質(zhì)疏松癥給我國社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來巨大影響。骨質(zhì)疏松癥的治療目的是提高骨強(qiáng)度。骨質(zhì)疏松的藥物治療主要包括：①基礎(chǔ)補(bǔ)充劑：鈣劑、維生素D及活性維生素D；②抗骨吸收藥物：雙膦酸鹽、激素替代治療及雌激素受體調(diào)節(jié)劑、降鈣素；③促進(jìn)骨合成藥物：甲狀旁腺激素。目前臨床上大多以抑制破骨細(xì)胞來達(dá)到增加骨量的目的，而且促骨合成藥物甲狀旁腺激素存在需每日應(yīng)用及價格昂貴的缺點(diǎn)，這使人們不斷探索新的促骨合成藥物。近年來人們注意到肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2C（myocyte enhancer factor 2C，MEF2C）與促進(jìn)骨合成相關(guān)，可能是治療骨質(zhì)疏松的新途徑。

1 MEF2C相關(guān)結(jié)構(gòu)特征及功能

MEF2C屬蛋白質(zhì)編碼基因，是MEF2家族中的轉(zhuǎn)錄因子。該基因位于負(fù)鏈5q14.3 處，編碼的蛋白質(zhì)MEF2多肽C有DNA結(jié)合活性[3]。該蛋白質(zhì)可在維持肌細(xì)胞分化狀態(tài)中起作用[4]，控制心血管系統(tǒng)發(fā)育和肌肉生成[5]。在突觸連接中通過抑制興奮性突觸數(shù)量調(diào)節(jié)基底和誘發(fā)的突觸傳遞，促進(jìn)海馬依賴性學(xué)習(xí)和記憶[6]。

2 MEF2C與骨代謝

2.1 骨硬化蛋白（sclerostin,SOST）與骨代謝

在骨代謝過程中，骨質(zhì)疏松發(fā)生發(fā)展的病理核心是破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞的失衡。成骨細(xì)胞既能產(chǎn)生核因子κB受體活化體配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL）與破骨細(xì)胞前體上的核因子κB 受體活化體（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK）結(jié)合，促使破骨細(xì)胞分化，也能分泌護(hù)骨素（osteoprotegerin,OPG）與RANK競爭性結(jié)合RANKL，抑制破骨細(xì)胞分化。通過成骨細(xì)胞譜系產(chǎn)生RANKL 及其誘餌受體OPG的平衡，以及它們與破骨細(xì)胞前體的細(xì)胞膜上的RANK 的相互作用最能詮釋骨骼基本多細(xì)胞單位內(nèi)細(xì)胞間的相互作用[7]。因此，成骨細(xì)胞對于骨形成代謝發(fā)揮重要作用。SOST由SOST基因編碼，含有213個氨基酸序列，其分子量為24 kDa，然而，在這個分子量下很少檢測到SOST，相反，發(fā)現(xiàn)其多以更高分子量的形式存在，可能是二聚體或三聚體，盡管它們的功能尚未確定[8]。SOST的表達(dá)對成骨細(xì)胞起負(fù)反饋?zhàn)饔?，減少骨的形成，降低機(jī)體骨量[9]。若人體中缺少SOST 的表達(dá)或分泌將導(dǎo)致遺傳性高骨量狀況，其特征是骨形成過度，造成硬化癥，Van Buchem 病和顱骨發(fā)育不良等疾病[10,11]。雖然已被證明作為成人骨量的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，SOST 基因表達(dá)的分子調(diào)節(jié)機(jī)制在很大程度上還是未知的，而且目前SOST 的中文翻譯是骨硬化蛋白，但這與它的實(shí)際生理功能并不吻合，有待今后進(jìn)一步探討。因此，闡明SOST基因的控制機(jī)制顯得尤為重要。

作為糖蛋白Dan家族的一員，SOST可抑制骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein,BMP）刺激骨形成，但后來發(fā)現(xiàn)它并不影響B(tài)MP信號，而可拮抗成骨細(xì)胞中Wnt信號傳導(dǎo)[12]。Wnt信號傳導(dǎo)從骨細(xì)胞生長、分化和凋亡到骨量調(diào)節(jié)和礦化等各方面都起到一定作用[13]。其中，Wnt/β-鏈蛋白信號通過Wnt蛋白與由卷曲受體和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白（low density lipoprotein receptor related protein,LRP）家族LRP5/6 的共同受體組成的受體復(fù)合物結(jié)合而激活。這一過程可穩(wěn)定β-鏈蛋白，誘導(dǎo)其易位，并激活基因轉(zhuǎn)錄。這種經(jīng)典的Wnt信號傳導(dǎo)途徑能促進(jìn)成骨細(xì)胞分化[14]。研究證明，作為調(diào)節(jié)經(jīng)典Wnt通路的主要參與者，骨細(xì)胞分泌的SOST通過與拮抗下游信號傳導(dǎo)的Wnt共受體LRP5/6結(jié)合，抑制Wnt途徑，從而抑制成骨細(xì)胞的分化與骨形成[15]。Fijalkowski 等[16]研究提示SOST還與LRP4相互影響，作為LRP蛋白家族中另一成員，LRP4促進(jìn)SOST對Wnt信號傳導(dǎo)起抑制作用。此外，Bouaziz等[17]通過小鼠不穩(wěn)定關(guān)節(jié)模型實(shí)驗(yàn)得出SOST可抑制c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）活化，提示SOST可能對非經(jīng)典JNK途徑也存在一定作用。

在探索SOST 基因與骨礦物質(zhì)密度（bone mineral density,BMD）的關(guān)聯(lián)上，目前取得了一系列的進(jìn)展。SOST基因座中的許多單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism,SNP）與全基因組關(guān)聯(lián)研究（genomewide association study,GWAS）和候選基因關(guān)聯(lián)研究中的BMD以及骨折密切相關(guān)[18]。Li等[19]在小鼠實(shí)驗(yàn)中證明SOST基因的缺失將導(dǎo)致兩性小鼠的椎骨與長骨的BMD增加50%，并同時增強(qiáng)松質(zhì)骨與皮質(zhì)骨的結(jié)構(gòu)特性。這說明了SOST基因?qū)橇康恼{(diào)節(jié)能力，有希望成為治療骨質(zhì)疏松等疾病的靶點(diǎn)。目前通過抗SOST治療骨質(zhì)疏松的骨硬化蛋白抗體（sclerostin antibody,Scl-Ab）也有新發(fā)現(xiàn)，Li等[20]在睪丸切除雄激素性骨質(zhì)疏松癥大鼠模型中證實(shí)了Scl-Ab可完全逆轉(zhuǎn)腰椎、股骨和脛骨中BMD的降低。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥女性的Ⅲ期臨床試驗(yàn)[21]表明，與安慰劑相比，Scl-Ab增加了腰椎和髖部的BMD，并降低了骨折的風(fēng)險。這給Scl-Ab的臨床應(yīng)用帶來了新的思路?？傊?，抑制SOST基因的作用或SOST表達(dá)可促進(jìn)骨形成從而達(dá)到治療骨質(zhì)疏松的目的，但目前SOST基因控制成骨細(xì)胞向成熟骨細(xì)胞分化的具體機(jī)制仍不明確，這有待于更進(jìn)一步的研究。

2.2 SOST與MEF2C的關(guān)系

Loots等[22]通過利用跨物種序列與體外和體內(nèi)增強(qiáng)子的比較發(fā)現(xiàn)SOST基因的遠(yuǎn)端增強(qiáng)子進(jìn)化保守區(qū)5（evolutionarily conserved region 5,ECR5），是一個255 bp的進(jìn)化保守序列。MEF2是ECR5區(qū)域中轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，它與ECR5區(qū)域結(jié)合并誘導(dǎo)SOST的表達(dá)，并據(jù)實(shí)驗(yàn)[23]分析，骨細(xì)胞中甲狀旁腺激素的刺激減少了MEF2向ECR5區(qū)域的募集并降低了SOST表達(dá)，該實(shí)驗(yàn)也指出MEF2蛋白與SOST在UMR-106細(xì)胞和小鼠股骨中共同定位，其中MEF2C表現(xiàn)出了最高的表達(dá)。同時，Collette等[24]還表示，MEF2C在骨細(xì)胞中依賴ECR5的SOST基因轉(zhuǎn)錄活性，成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞中MEF2C的缺失將導(dǎo)致高骨量并增加骨形成，并與剔除ECR5報告基因表達(dá)了相似的骨參數(shù)，表明MEF2C是ECR5依賴性SOST基因表達(dá)的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。Kramer等[25]研究進(jìn)一步證明了MEF2C與SOST基因密不可分的關(guān)系，他通過Dmp1-Cre誘導(dǎo)MEF2C缺乏的小鼠實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)3.5個月和5至6個月時小鼠股骨皮質(zhì)骨中SOST基因表達(dá)進(jìn)行性降低40%和70%，同時伴有骨密度的增加，這說明MEF2C基因是成骨細(xì)胞表達(dá)SOST所必需的。也有研究[26]發(fā)現(xiàn)，MEF2C和SOST基因雙敲除小鼠的高骨量表型比SOST基因單敲除小鼠更重，這表明MEF2C也通過一種獨(dú)立于SOST基因的機(jī)制調(diào)節(jié)骨量。

此外，組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)是能夠在各種細(xì)胞中使賴氨酸殘基去乙?；拿讣易濉Ｔ谧罱豁?xiàng)實(shí)驗(yàn)中，Wein等[27]用表達(dá)shRNA的慢病毒感染Ocy454細(xì)胞進(jìn)而敲低HDAC5，HDAC5的敲低增加了SOST基因表達(dá)，而HDAC5過表達(dá)降低了SOST基因水平，在HDAC5 shRNA的設(shè)定情況下降低MEF2C 水平降低了SOST 分泌，這表明MEF2C 是HDAC5 shRNA 增加SOST 基因表達(dá)能力必需的。他們認(rèn)為，在Ocy454 細(xì)胞分化早期，高水平的HDAC5與+45kB SOST基因增強(qiáng)子結(jié)合，阻斷MEF2C占據(jù)并聚集核受體輔阻遏物和HDAC3，以阻斷MEF2C 介導(dǎo)的SOST基因轉(zhuǎn)錄。隨著骨細(xì)胞分化的發(fā)生，在Ocy454細(xì)胞分化晚期，HDAC5 占據(jù)水平下降，從而允許增加MEF2C結(jié)合，導(dǎo)致增強(qiáng)子活化和SOST基因表達(dá)上升。

骨質(zhì)疏松分原發(fā)和繼發(fā)兩大類，原發(fā)性骨質(zhì)疏松主要包括激素性骨質(zhì)疏松和老年性骨質(zhì)疏松。多種類型骨質(zhì)疏松患者血清中皆存在SOST含量特異性的改變[28]。因此，通過SOST抗體拮抗SOST作用成為治療多種骨質(zhì)疏松的潛在方法之一。激素性骨質(zhì)疏松主要由于雌激素對破骨細(xì)胞的抑制減弱，破骨細(xì)胞功能增強(qiáng)導(dǎo)致骨吸收加劇，導(dǎo)致骨丟失[29]。老年性骨質(zhì)疏松癥主要是由于增齡導(dǎo)致的骨重建失衡，低免疫致促炎性反應(yīng)狀態(tài)，炎性反應(yīng)因子刺激破骨細(xì)胞，抑制成骨細(xì)胞使骨量減少[30]。糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松作為發(fā)病率僅次于前兩者的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松，可導(dǎo)致SOST表達(dá)增加，使成骨細(xì)胞前體向成熟成骨細(xì)胞的分化減少、成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞凋亡增加[31]。研究[25]表明，在促破骨細(xì)胞生成因子中，在任一性別的MEF2C敲除小鼠中，巨噬細(xì)胞集落刺激因子和RANKL的表達(dá)均未顯著改變。相反，在MEF2C敲除的雄性小鼠中，抗破骨細(xì)胞生成因子OPG的表達(dá)顯著增加70%。然而，在突變雌性小鼠中皮質(zhì)OPG表達(dá)沒有改變。這提示MEF2C可能存在調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞骨吸收的功能，雖然目前未有文獻(xiàn)明確揭露MEF2C在具體骨質(zhì)疏松病因下的骨代謝作用，但作為上游調(diào)節(jié)蛋白和Wnt信號傳導(dǎo)調(diào)節(jié)劑，MEF2C在骨細(xì)胞中對SOST基因的轉(zhuǎn)錄激活很重要，進(jìn)一步研究MEF2C-SOST-Wnt信號軸有可能揭示骨形成和體內(nèi)平衡的基本機(jī)制，盡管SOST基因與MEF2C之間的關(guān)系略顯復(fù)雜，但MEF2C對于SOST基因的重要性毋庸置疑，通過MEF2C影響SOST基因從而間接調(diào)控骨量及對破骨細(xì)胞的調(diào)節(jié)成為下一步探索MEF2C治療骨質(zhì)疏松的關(guān)鍵所在。

3 MEF2C的相關(guān)研究

盡管目前未見相關(guān)文獻(xiàn)報道骨質(zhì)疏松患者體內(nèi)MEF2C因子水平變化，但有研究發(fā)現(xiàn)在骨質(zhì)疏松癥患者中，微小RNA-27a（microRNA-27a,MIR-27a）的表達(dá)顯著降低，該研究用雙熒光素酶分析證實(shí)MEF2C是MIR-27a的直接靶點(diǎn)，在骨質(zhì)疏松癥患者中，MIR-27a的表達(dá)與MEF2C的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，沉默MIR-27a可減少骨形成，這提示MEF2C與骨質(zhì)疏松有一定聯(lián)系[32]。

我國學(xué)者通過基因多態(tài)性檢測后統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)MEF2C基因SNP位點(diǎn)rs1366594與總髖部骨密度存在相關(guān)性[33]，最近的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)[34]也確定了MEF2C 作為Wnt16信號傳導(dǎo)的潛在參與者來參與骨代謝，為未來研究MEF2C在骨代謝中的作用機(jī)制提供了寶貴經(jīng)驗(yàn)。如前文所述，Wnt信號傳導(dǎo)是骨骼發(fā)育和新陳代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，Wnt16 是Wnt 配體，可調(diào)節(jié)骨形成和再吸收[35]。該研究應(yīng)用特定方法發(fā)現(xiàn)了骨中的97個MEF2C靶標(biāo)與重組Wnt16在顱骨成骨細(xì)胞中下調(diào)的基因重疊，277個MEF2C靶標(biāo)與小鼠骨細(xì)胞中過表達(dá)Wnt16特異性下調(diào)的基因重疊，表明MEF2C在Wnt16介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中起作用。該研究也發(fā)現(xiàn)重組Wnt16可下調(diào)成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞樣細(xì)胞中的MEF2C表達(dá)。這些數(shù)據(jù)與MEF2C結(jié)合位點(diǎn)富集Wnt16抑制基因的啟動子的發(fā)現(xiàn)一起表明MEF2C是Wnt16介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的潛在參與者，Wnt16通過MEF2C的轉(zhuǎn)錄抑制下調(diào)其一些靶基因。

此外，MEF2C 可控制心血管系統(tǒng)發(fā)育和肌肉生成，參與肌纖維種類的調(diào)控，在骨骼肌中起重要調(diào)節(jié)作用[36]。最近的研究[25]結(jié)果表明骨骼肌與骨骼相反，盡管在MEF2C敲除小鼠的肌肉中，MEF2C表達(dá)降低，但編碼不同肌球蛋白重鏈亞型的慢抽搐和快抽搐肌纖維myh1、2、4和7的已知標(biāo)記物均未發(fā)生改變。這些數(shù)據(jù)與MEF2C條件性敲除小鼠的壽命正常的結(jié)果均表明，骨骼肌中MEF2C 表達(dá)的降低很可能與觀察到的骨質(zhì)量表型增加無關(guān)。

關(guān)于MEF2C的另一個研究熱點(diǎn)是肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2C-反義鏈1（myocyte enhancer factors 2C-antisense RNA 1,MEF2C-AS1）。MEF2C-AS1可編碼一條天然反義長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,lncRNA），該lncRNA與正義MEF2C基因的5'非編碼區(qū)域互補(bǔ)，這意味著lncRNA MEF2C-AS1可能在MEF2C表達(dá)和/或翻譯中起作用[37]。長鏈非編碼RNA是指長度大于200 nt的非編碼RNA，不會被翻譯成蛋白質(zhì)。lncRNA最初被認(rèn)為沒有生物學(xué)意義。隨著近年研究表明，lncRNA可參與多種生物學(xué)行為，如印記基因組位點(diǎn)，塑造染色體構(gòu)象和變構(gòu)調(diào)節(jié)酶活性等[38]。其中，一部分研究發(fā)現(xiàn)lncRNA與骨質(zhì)疏松存在一定聯(lián)系[39-41]，如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）是一種多功能潛能干細(xì)胞，擁有向成骨細(xì)胞分化的功能。Wang等[42]分別從小鼠病理模型和絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者中分離培養(yǎng)BMSCs，發(fā)現(xiàn)在從BMSCs分化至成骨細(xì)胞的過程中，BMSCs中l(wèi)ncRNA MEG3和microRNA-133a-3p 的表達(dá)顯著降低，且lncRNA MEG3 的過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了成骨誘導(dǎo)介導(dǎo)的microRNA-133a-3p的下調(diào),這表明lncRNA MEG3有調(diào)節(jié)microRNA-133a-3p表達(dá)，抑制BMSCs誘導(dǎo)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松成骨分化的功能。這揭露lncRNA與成骨細(xì)胞之間的聯(lián)系，為骨質(zhì)疏松的診斷和治療開辟了新途徑。

在關(guān)于lncRNA MEF2C-AS1的研究中，Mo等[43]基于GWAS發(fā)現(xiàn)位于5q14.3的MEF2C-AS1基因與股骨頸密度顯著相關(guān)（P=3.72×10-18），Zeng等[37]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在SNP rs6894139 處檢測到了最強(qiáng)的信號關(guān)聯(lián)（P=3.03×10-9），而且rs6894139-T和rs6894139-G這2種等位基因形式的最佳二級結(jié)構(gòu)有不同的最小自由能，后一種結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，這說明rs6894139可能改變MEF2CAS1的二級結(jié)構(gòu)，并潛在地影響其功能。這明確了lncRNA中多態(tài)性在確定BMD變異中的重要作用，為下一步的研究奠定了基礎(chǔ)。目前關(guān)于MEF2C-AS1對BMD影響的研究僅限于基因研究層面，并未涉及MEF2CAS1對骨細(xì)胞功能的調(diào)控作用，此外，lncRNA多態(tài)性對該調(diào)控作用的影響也等待著人們?nèi)ヌ剿鳌?/p>

4 小結(jié)

以上分別從SOST 基因與BMD，MEF2C 與SOST基因之間的關(guān)系及MEF2C-AS1 三方面概述MEF2C研究進(jìn)展。由于人均壽命延長和骨質(zhì)疏松防治尚未得到廣泛重視，骨質(zhì)疏松治療仍面臨許多挑戰(zhàn)。目前主要依賴于抗骨吸收的方法，促進(jìn)骨合成代表藥物為甲狀旁腺激素。對MEF2C的研究為未來從促進(jìn)骨合成角度治療骨質(zhì)疏松提供新方向。隨著基因技術(shù)的飛速發(fā)展，相信人們會繼續(xù)衡量骨吸收與骨合成之間的關(guān)系，從MEF2C的骨代謝作用機(jī)制著手，充分考慮其潛在副作用，為治療骨質(zhì)疏松帶來新方法。