通絡(luò)止痛方對(duì)人膝骨關(guān)節(jié)炎滑膜炎性細(xì)胞TLR的影響*

楊黎黎，王慶甫

（1．北京市隆福醫(yī)院骨科，北京 100010；2．北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院筋傷科，北京 100029）

膝骨關(guān)節(jié)炎（KOA）是一種老年人中常見的退行性疾病，以關(guān)節(jié)軟骨變性，滑膜炎癥、關(guān)節(jié)軟骨下骨的變化為主要特點(diǎn)[1-2]。雖然有很多導(dǎo)致KOA發(fā)生的因素，包括關(guān)節(jié)損傷、遺傳、肥胖、老化、生物力學(xué)和炎癥等[3-4]，但其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，至今尚未完全清楚。人工關(guān)節(jié)置換術(shù)（TJA）是一種有效的治療晚期骨性關(guān)節(jié)炎的治療方法。然而，該方法伴隨著相應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，如感染、假體周圍骨折、下肢深靜脈血栓形成、關(guān)節(jié)脫位等。因此，繼續(xù)深入研究骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制，有助于尋找新的治療靶點(diǎn)和治療方法，具有重要的臨床和臨床研究的重要作用。TLR2、TLR4是Toll樣受體（TLR）家族重要成員，在促炎癥因子、基質(zhì)金屬蛋白酶等導(dǎo)致的骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變病理進(jìn)程中起重要的介導(dǎo)作用,對(duì)軟骨細(xì)胞凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)代謝失衡具有關(guān)鍵作用。通絡(luò)止痛方是治療KOA的經(jīng)驗(yàn)方，具有通絡(luò)止痛，活血化瘀的功效，通過超聲促透外治法治療KOA可有效減輕患者疼痛、改善膝關(guān)節(jié)功能[5]。但其作用機(jī)制尚不明確，本實(shí)驗(yàn)將不同濃度通絡(luò)止痛方作用于人KOA滑膜炎癥細(xì)胞，通過對(duì)Toll樣受體通路的影響，探討該方的作用機(jī)制，為其治療KOA提供支持。具體報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 組織來源 人KOA炎性滑膜組織源于北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院行關(guān)節(jié)置換治療的KOA患者廢棄滑膜組織。無菌條件下將取得的滑膜組織去除脂肪、纖維等，加入PBS洗滌，PBS清洗兩次后放在無菌小青霉素瓶中用解剖剪切碎成糊狀。置于2 mL 0．4%Ⅰ型膠原酶的25 cm2培養(yǎng)瓶中消化2．5 h（期間搖勻數(shù)次）。經(jīng)200目金屬篩過濾。取未黏附的細(xì)胞移至離心管中，用2 000 r/min離心5 min，棄上清，加入含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,反復(fù)吹打后將細(xì)胞接種在25 cm2的培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中。1～2 d換液1次，選取3～4代細(xì)胞，純度大于98%，經(jīng)鑒定后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑與儀器 胎牛血清，購自四季青公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶-EDTA消化液（0．25%）、Ⅰ型膠原酶，均購自Gibco公司；PE-anti-human-TLR4、FITC-anti-human-TLR2，美國 eBioscience公司；Trizol，美國Sigma公司；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TOYOBO），SYBR Green Real-time PCR Master Mi ×（TOYOBO），5 ×LoadingBuffer（TAkara），DNA MARKER B（上海生工）；發(fā)光液，普利萊基因技術(shù)公司；羊抗兔 IgG／HRP，美國 Sigma公司；TLR4 抗體，abcom；TLR4引物均由北京百諾威生物科技有限公司出品；流式細(xì)胞儀，美國BD公司FACS Calibur；4℃低溫高速離心機(jī)，美國Thermo；ELX800型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，美國生物技術(shù)儀器公司；CO2培養(yǎng)箱，美國Thermo Scientific;四環(huán)凍干機(jī)，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司。

1.3 藥物制備及劑量 通絡(luò)止痛處方組成：桂枝100 g，白芍 60 g，桃仁 50 g，紅花 50 g，制草烏 10 g，細(xì)辛 3 g，川椒 20 g，牛膝 20 g，乳香 30 g，沒藥 30 g；購于北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院藥房。將上述中藥飲片按成方比例置煎煮容器內(nèi)，加水浸泡，煮沸30 min，棄藥渣取湯劑，經(jīng)過離心機(jī)2 000 r/min離心，棄藥渣取湯劑，利用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥，粉末狀，PBS溶解，用0．22 μm微孔濾器過濾除菌，配制成高、中、低濃度：高濃度組：2．5 mg/mL；中濃度組：0．25 mg/mL；低濃度組：0．025 mg/mL；對(duì)照組：0 mg/mL（培養(yǎng)液）。-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 觀察項(xiàng)目及檢測(cè)方法

1.4.1 流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)細(xì)胞中TLR2、TLR4表達(dá)情況 1）采用細(xì)胞免疫熒光直接標(biāo)記法，樣品中依次加入PE-抗人TLR4單克隆抗體和FITC-抗人TLR2單克隆抗體兩種熒光標(biāo)記抗體，振蕩器充分混勻。2）室溫避光染色 15 min。3）1 500 r/min，離心6 min，如此反復(fù)PBS洗3遍，將細(xì)胞碎片及未結(jié)合的熒光標(biāo)記抗體去除。將細(xì)胞密度調(diào)整為1×106個(gè)/mL上機(jī)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)采用SSC和FSC設(shè)門，測(cè)定10 000個(gè)滑膜細(xì)胞中TLR4、TLR2陽性表達(dá)百分率，用 FACSDiva Version 6．1．3 軟件對(duì)數(shù)據(jù)獲取及分析。

1.4.2 實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)TLR4 mRNA的基因表達(dá) 將培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)箱中取出，棄上清液，鋪板，加入不同濃度通絡(luò)止痛方，對(duì)照組加入培養(yǎng)液。繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。用Trizol提取滑膜組織總RNA，檢測(cè)其純度及完整性后將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，操作過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。將北京百諾威公司提供內(nèi)參GAPDH及上下游引在樣品液中加入各1 μL，引物序列見表1。反應(yīng)體系25 μL，經(jīng)過 95 ℃預(yù)變性 2 min，95 ℃變性 30 s，60℃退火30 s，60℃延伸30 s，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)后70℃延伸10 min進(jìn)行熒光檢測(cè)，由電腦自動(dòng)分析并計(jì)算出反應(yīng)體系中待測(cè)樣品c DNA達(dá)到設(shè)定閾值的循環(huán)數(shù)（CT 值）并計(jì)算 2-ΔΔCT值，其中，ΔΔCT=（Cttarget-CtGAPDH）加藥組-（Cttarget-CtGAPDH）對(duì)照組。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩組數(shù)據(jù)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)細(xì)胞中TLR2、TLR4表達(dá)情況 高、中、低濃度通絡(luò)止痛方組TLR4表達(dá)率與對(duì)照組比較都有明顯的降低（P＜0．05）,且隨著濃度升高，TLR4的表達(dá)率逐漸降低；高、中、低濃度通絡(luò)止痛方組TLR2表達(dá)率與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），見表 2。高、中、低濃度組通絡(luò)止痛方FSC-SSC散點(diǎn)圖圈定細(xì)胞圖與TLR2、TLR4的表達(dá)率流式圖見圖1～8。

表2 FCM檢測(cè)細(xì)胞TLR4及TLR2陽性表達(dá)百分率（±s） %

注：與對(duì)照組比較，*P＜0．05；與高濃度組比較，△P＜0．05。

組別 TLR4 TLR2對(duì)照組 52．8±1．21 0．3±0．08高濃度組 10．0±0．88* 1．6±0．43中濃度組 34．0±1．02*△ 0．5±0．19低濃度組 45．1±1．22*△ 0．2±0．06

2.2 實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)TRL4 mRNA的基因表達(dá) 與對(duì)照組比較，高、中、低濃度組中，人膝骨關(guān)節(jié)炎滑膜炎癥細(xì)胞TLR4的表達(dá)水平顯著降低（P＜0．05）。低濃度組通絡(luò)止痛方對(duì)滑膜炎癥細(xì)胞TLR4抑制作用與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。高、中濃度組抑制作用與濃度呈正比。結(jié)果見圖9。

圖1 高濃度組FSC-SSC散點(diǎn)圖圈定滑膜炎癥細(xì)胞

圖2 高濃度組TLR4、TLR2表達(dá)率流式圖

圖3 中濃度組FSC-SSC散點(diǎn)圖圈定滑膜炎癥細(xì)胞

圖4 中濃度組TLR4、TLR2表達(dá)率流式圖

圖5 低濃度組FSC-SSC散點(diǎn)圖圈定滑膜炎癥細(xì)胞

圖6 低濃度組TLR4、TLR2表達(dá)率流式圖

圖7 對(duì)照組FSC-SSC散點(diǎn)圖圈定滑膜炎癥細(xì)胞

圖8 對(duì)照組TLR4、TLR2表達(dá)率流式圖

圖9 不同濃度通絡(luò)止痛方對(duì)人膝骨關(guān)節(jié)炎滑膜炎癥細(xì)胞TLR4 表達(dá)的影響（±s）

3 討論

KOA屬中醫(yī)學(xué)的“骨痹”范疇[6]，是由多種因素引起的關(guān)節(jié)軟骨變性、破壞及增生和關(guān)節(jié)周圍軟組織炎癥等為特征的一種慢性關(guān)節(jié)疾病，老年人中常見病，嚴(yán)重影響著國民的生存質(zhì)量。盡管如此，KOA發(fā)病機(jī)制還不清楚發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，并且到目前為止，還沒有一種治療方法可以從根本上預(yù)防、改變或中止KOA的疾病進(jìn)程[7]。人類TLR是一類信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)跨膜受體位于細(xì)胞表面，可對(duì)入侵病原微生物的識(shí)別在固有免疫中發(fā)揮重要作用。TLR家族可以按其細(xì)胞定位及配體分為兩個(gè)亞群，一種亞群分布于細(xì)胞膜表面，以外均識(shí)別以脂質(zhì)為基礎(chǔ)的配體，包括TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、LR6 和 TLR10；一種亞群則識(shí)別以核酸為基礎(chǔ)分布在內(nèi)體、溶酶體以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器上的配體，包括TLR3、TLR7、TLR8和TLR9。TLR4、TLR2是最早被發(fā)現(xiàn)的TLR家族成員，是介導(dǎo)天然免疫和炎癥反應(yīng)的一種主要模式識(shí)別受體，在細(xì)菌感染和自身免疫性疾病中起重要作用。TLR4、TLR2是與骨關(guān)節(jié)炎最有關(guān)聯(lián)性TLRs的家族成員其中之一，同所知道的TLRs其他家族成員類似，TLRs啟動(dòng)和激活的信號(hào)傳輸和誘導(dǎo)歸于常規(guī)Toll的樣信號(hào)路徑，能夠開啟NF-κB路徑和應(yīng)激激酶路徑，激發(fā)炎癥因子包括白細(xì)胞介素（IL）－1β、腫瘤壞死因子（TNF）、蛋白聚糖酶（aggrecanases）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 TGF、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等[8]，最終產(chǎn)生炎癥表現(xiàn)。它可以通過模式識(shí)別受體識(shí)別病原相關(guān)分子模式或內(nèi)源性危險(xiǎn)相關(guān)分子模式并與之結(jié)合后被激活。最近幾年來研究證實(shí)，固有免疫應(yīng)答在誘發(fā)KOA滑膜炎癥反應(yīng)中有著重要作用，TLRs介導(dǎo)的滑膜細(xì)胞固有免疫應(yīng)答是促進(jìn)KOA滑膜炎的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[5-6]。

本課題組曾做過應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽法（MTT）法檢測(cè)不同濃度通絡(luò)止痛方對(duì)KOA滑膜細(xì)胞增殖活性的影響[9]。人KOA炎性滑膜組織源于本院行關(guān)節(jié)置換治療的KOA患者廢棄滑膜組織。原代培養(yǎng)細(xì)胞4 h可見細(xì)胞貼壁，見圖10，細(xì)胞成星狀，通過3～4條樹突與培養(yǎng)瓶相貼，細(xì)胞器不明顯，細(xì)胞密度稀疏。隨培養(yǎng)時(shí)間至3～4代細(xì)胞，見圖11，形態(tài)成滑膜成纖維細(xì)胞呈梭形、樹突樣，胞核狹長(zhǎng)，增殖旺盛,細(xì)胞器可見。其形態(tài)特點(diǎn)符合滑膜炎癥細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)。將通絡(luò)止痛方分為高、中、低濃度，和空白對(duì)照組，高濃度組：10/42、10/43、10/44mg/mL；中濃度組：10/45、10/46、10/47 mg/mL；低濃度組：10/48、10/49、10/410 mg/mL；并設(shè)立空白組：0 mg/mL，應(yīng)用MTT法檢測(cè)干預(yù)后KOA滑膜細(xì)胞的增殖水平，結(jié)果顯示，通過止痛方可以對(duì)滑膜成纖維細(xì)胞增殖產(chǎn)生影響，高中濃度組通絡(luò)止痛方抑制率為正值，隨濃度增加抑制率增大，低濃度抑制率為負(fù)值，隨濃度減低抑制率減少。在抑制率為正值的通絡(luò)止痛方濃度中將其按稀釋濃度比例分為高、中、低濃度組，為本實(shí)驗(yàn)的研究濃度。

圖10 原代培養(yǎng)4 h貼壁KOA滑膜細(xì)胞

圖11 KOA滑膜3～4代細(xì)胞細(xì)胞

在探究通絡(luò)止痛方整體的作用機(jī)制方面。取全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)患者術(shù)中廢棄滑膜組織培養(yǎng)成纖維細(xì)胞進(jìn)行不同濃度濃度通絡(luò)止痛方干預(yù)，用以觀察通絡(luò)止痛方對(duì)人膝骨關(guān)節(jié)炎滑膜炎性細(xì)胞TLR4及1L-1β的影響，認(rèn)為通絡(luò)止痛方可能通過Toll樣受體通路影響或抑制人膝骨關(guān)節(jié)炎滑膜炎性反應(yīng)。還觀察通絡(luò)止痛方對(duì)人膝骨關(guān)節(jié)炎滑膜炎癥細(xì)胞上清1L-1β和TNF-α含量的影響，認(rèn)為通絡(luò)止痛方對(duì)人膝骨關(guān)節(jié)炎滑膜炎癥細(xì)胞上清1L-1β和TNF-α有抑制作用，隨濃度增高，抑制程度越明顯。探討了通絡(luò)止痛方對(duì)人KOA滑膜成纖維細(xì)胞增殖的影響。認(rèn)為高、中濃度通絡(luò)止痛方對(duì)滑膜細(xì)胞增殖有抑制作用，低濃度組的通絡(luò)止痛方對(duì)滑膜細(xì)胞有增殖有促進(jìn)作用。

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用FCM，real-time PCR檢測(cè)技術(shù)驗(yàn)證了通絡(luò)止痛方可以抑制Toll樣受體通路上重要成分TLR4、TLR2的表達(dá)，在一定程度上說明了通絡(luò)止痛方的作用機(jī)制，以及Toll樣受體通路在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展中的重要作用。KOA的病理發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的過程，并非一兩個(gè)細(xì)胞因子作用的結(jié)果，但是Toll樣受體通路有可能成為KOA診斷和治療的一項(xiàng)有用的指標(biāo)，并且可能為KOA的治療提供一個(gè)新的靶點(diǎn)。通過通絡(luò)止痛方干預(yù)Toll樣受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路或抑制其生物活性，將為治療骨性關(guān)節(jié)炎開辟一條新的途徑。