生物活性分子在種植體骨結(jié)合中的研究進(jìn)展*

崔建通 賀慧霞

良好的骨結(jié)合是人工種植體成功的關(guān)鍵，鈦或鈦合金人工種植體由于其較為理想的生物相容性和機(jī)械性能植入體內(nèi)后與骨組織形成良好的骨結(jié)合而成為目前臨床上應(yīng)用最廣的人工種植體［1］。但鈦類材料表面生物惰性的缺點(diǎn)不利于種植體骨結(jié)合的進(jìn)一步提高［2］，尤其對一些伴有系統(tǒng)性疾病如骨質(zhì)疏松、糖尿病的缺牙患者，這些全身代謝性疾病使種植體周骨愈合能力下降，使種植體骨結(jié)合產(chǎn)生時(shí)間上的延遲或質(zhì)量上的下降，導(dǎo)致種植體骨結(jié)合率下降［3］。因此，提高種植體骨結(jié)合率和初期穩(wěn)定性進(jìn)而提高種植體長期成功率仍是需要進(jìn)一步研究的課題。其中種植體表面生物化學(xué)改性提高種植體骨結(jié)合率成為該領(lǐng)域近年來的研究的重要方向，方法是將生物活性分子如具有生物活性的蛋白、小分子多肽等采用一定的方式固定于種植體表面，通過其成骨誘導(dǎo)作用促進(jìn)種植體周骨形成，提高種植體骨結(jié)合。本文就近年來應(yīng)用于鈦類人工種植體表面的生物化學(xué)改性方法以及幾類主要生物活性分子對種植體骨結(jié)合作用及其機(jī)理的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1.生物化學(xué)改性方法

1.1 物理吸附 物理吸附是在對種植體表面進(jìn)行一定的粗糙處理后，將種植體浸入生物活性物質(zhì)與磷酸緩沖鹽溶液混合后的溶液中一段時(shí)間，使生物活性物質(zhì)吸附在種植體表面。此法操作簡單，對設(shè)備要求較低，但是吸附形成的作用力為靜電力、范德華力或氫鍵，較難牢固結(jié)合在種植體表面，并且較難控制生物活性物質(zhì)在種植體表面的均勻分布。

1.2 共價(jià)結(jié)合 生物活性物質(zhì)可通過接枝分子共價(jià)結(jié)合在種植材料表面，接枝分子在種植材料表面形成自組裝單分子層再與生物活性物質(zhì)的某些基團(tuán)共價(jià)連接，使生物活性物質(zhì)穩(wěn)定連接在種植材料表面。常見的接枝分子包括聚乙二醇、硅烷偶聯(lián)劑、聚多巴胺、磷酸自組裝單分子層等［4］。此外，近些年人們通過噬菌體展示技術(shù)發(fā)現(xiàn)一些可以直接與金屬鈦共價(jià)結(jié)合的短肽（ATWVSPY、RKLPDAPGMHTW等）可以將某些生物活性物質(zhì)（如層粘連蛋白衍生肽）連接在金屬鈦表面，從而對鈦種植體進(jìn)行表面改性［5］。共價(jià)結(jié)合可以將生物活性分子穩(wěn)定的結(jié)合在種植體表面，避免了初始爆發(fā)釋放，但生物活性分子可能在共價(jià)結(jié)合的過程中發(fā)生構(gòu)象的改變。

1.3 聚電解質(zhì)多層 聚電解質(zhì)多層由層層自組裝技術(shù)將帶相反電荷的聚電解質(zhì)順序吸附到帶電表面制備而成。這種方法的特點(diǎn)是改變電解質(zhì)沉積數(shù)量可以調(diào)控聚電解質(zhì)多層的厚度，逐層組件可以將生長因子、蛋白質(zhì)、遺傳物質(zhì)、抗體等直接集成到層中，或者可以用聚電解質(zhì)預(yù)先絡(luò)合各組分，然后組裝成復(fù)合物［6］。分子量大于10 kDa的生物活性物質(zhì)可以永久固定在聚電解質(zhì)層中，隨著聚電解質(zhì)逐層的降解實(shí)現(xiàn)藥物的逐漸釋放。

2.鈦種植體表面生物化學(xué)改性主要生物活性蛋白

2.1 膠原蛋白 膠原蛋白是骨組織細(xì)胞外基質(zhì)中的主要成分，也是骨組織的鈣化中心，可促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞中成骨相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨方向分化，同時(shí)可以提高成骨細(xì)胞對骨基質(zhì)的黏附。在鈦片表面沉積磷酸鈣和Ⅰ型膠原制備的礦化膠原涂層利于細(xì)胞伸展以及偽足的生長，可以有效促進(jìn)成骨細(xì)胞的黏附及增殖［7］。此外，吸附有Ⅰ型膠原的鈦片也更有利于促進(jìn)小鼠前成骨細(xì)胞株MC3T3-E1黏附斑蛋白與護(hù)骨素基因的表達(dá)［8］。將Ⅰ型膠原修飾的鈦種植體植入SD大鼠脛骨內(nèi)，HE染色發(fā)現(xiàn)4周后種植體周圍形成的新生骨的密度要優(yōu)于對照組。Ⅰ型膠原還可以參與攜帶藥物，從而調(diào)控種植體骨結(jié)合過程。Li等［9］通過層層自主裝技術(shù)將Ⅰ型膠原和透明質(zhì)酸修飾在鈦納米管表面，使管內(nèi)的依諾沙星緩慢釋放，抑制破骨細(xì)胞活性的同時(shí)還促進(jìn)了種植體表面新生骨的形成。

2.2 非膠原蛋白 結(jié)合在膠原表面特定位點(diǎn)的非膠原蛋白，包括纖連蛋白（fibronectin）和層粘連蛋白（laminin）等在啟動(dòng)羥基磷灰石晶體成核、生長及調(diào)控?zé)o機(jī)相相變的過程以及促進(jìn)細(xì)胞黏附、遷移和分化等過程中都發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。越來越多的研究顯示，將非膠原蛋白結(jié)合在種植體表面能夠有效提高骨結(jié)合的效果。纖連蛋白能夠增強(qiáng)對成骨細(xì)胞的粘附，進(jìn)一步提升種植體表面微槽對細(xì)胞的粘附作用［10］，加快成骨細(xì)胞的成熟，使種植體表面接觸的間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞呈現(xiàn)出成骨細(xì)胞自然成熟的多邊形態(tài)［11］。Chang等［12］將纖連蛋白吸附在鈦種植體表面，發(fā)現(xiàn)其在誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化、增加骨形成量以及提升種植體初期穩(wěn)定性方面較無纖連蛋白組有一定的提高。纖連蛋白上存在增強(qiáng)細(xì)胞活性的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（arginine-glycine-aspartic acid，RGD）序列和RGD協(xié)同序列（PHSRN）以及其中間一段有20個(gè)氨基酸的序列F20（PHSRNSITGTNLTPGYTITVYAVTGRGD）。有學(xué)者推測是纖連蛋白中間的這一段活性序列在發(fā)揮促進(jìn)骨結(jié)合的作用。將F20和纖連蛋白分別吸附到鈦片上，發(fā)現(xiàn)二者對基質(zhì)細(xì)胞系ST2粘附、增殖和分化能力的提升效果相似，此外還發(fā)現(xiàn)F20對成骨作用的促進(jìn)可能與Erk信號(hào)通路有關(guān)［13］。

層粘連蛋白作為細(xì)胞與基質(zhì)黏著的介質(zhì)，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附、生長和分化。Bougas等［14］將層粘連蛋白浸泡吸附在鈦種植體表面后植入兔的股骨中，4周后發(fā)現(xiàn)種植體周圍的骨結(jié)合程度得到明顯提高。在一項(xiàng)層粘連蛋白對種植體骨結(jié)合作用的回顧性研究中，91%的研究都表明層粘連蛋白可以促進(jìn)相關(guān)成骨相關(guān)標(biāo)記物的表達(dá)和（或）種植體周圍新骨形成［15］。

2.3 生長因子 骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Bone morphogenic proteins，BMP）是一組信號(hào)分子，是轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β超家族的成員，可以促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)骨缺損區(qū)新骨的形成［16］。BMP-2修飾的脫蛋白牛無機(jī)骨塊在犬牙槽嵴進(jìn)行垂直覆蓋提升術(shù)并同期植入種植體的第3個(gè)月時(shí)比未使用BMP-2的骨塊顯示出更高的骨礦化水平和更多的新骨形成量［17］。BMP-2緩慢均勻釋放似乎有利于促進(jìn)骨結(jié)合。Seo等［18］發(fā)現(xiàn)在水凝膠環(huán)境中BMP-2的持續(xù)釋放顯著促進(jìn)了鈦種植體周圍垂直骨的再生。Yang等［19］利用肝素連接BMP-2與生長分化因子5(growth and differentiation factor-5，GDF-5）結(jié)合在鈦片形成Ti-BMP-2-GDF-5涂層，肝素延長了BMP-2和GDF-5的半衰期，并且使其持續(xù)均勻釋放30天，將MC3T3-E1細(xì)胞放置含有該涂層的表面，細(xì)胞增殖和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性顯著增加，骨鈣素（osteocalcin，OCN）、Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)也明顯升高。兔體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示植入兔股骨內(nèi)的表面修飾有BMP-2和GDF-5的鈦棒也表現(xiàn)出骨與種植體界面處新骨形成明顯的增加。但種植體表面的BMP-2劑量對種植體骨結(jié)合有一定的影響，高劑量的BMP-2會(huì)導(dǎo)致局部、暫時(shí)的骨損傷。在一項(xiàng)高劑量BMP-2(＞150μg/mL）治療大鼠的臨界大小的股骨缺損實(shí)驗(yàn)中，2周后觀察到炎癥和異常骨形成。Guillot等［20］也發(fā)現(xiàn)當(dāng)大劑量BMP-2(9.3μg）附著于種植體表面時(shí)，第4和第8周BMP-2修飾的種植體骨結(jié)合率都低于無BMP-2組。

TGF-β2和TGF-β3是TGF-β超家族的兩個(gè)亞型，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和分化以及參與骨改建過程。在新西蘭兔拔牙窩內(nèi)即刻植入種植體，種植體周圍增加TGF-β2以及牙髓干細(xì)胞，術(shù)后第4、8周骨涎蛋白、骨鈣蛋白、Ⅰ型膠原表達(dá)水平明顯提高，種植體骨結(jié)合率以及種植體周圍骨小梁寬度明顯增加［21］。Kim等［22］通過電噴涂技術(shù)將聚乳酸丙交酯（PLGA）/重組人類TGFβ2顆粒噴涂在陽極氧化鈦種植體表面，種植體植入兔的脛骨第3周骨形態(tài)計(jì)量學(xué)分析發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的種植體骨接觸率（Bone-To-Implant Contact，BIC）和骨面積百分比明顯高于未噴涂重組人TGFβ 2的對照組。

血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)局部血管生成并且增加ALP的活性［23，24］。Guang等［23］將大鼠重組VEGF吸附于鈦片表面，發(fā)現(xiàn)其可以明顯促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞的增殖，將大鼠重組VEGF修飾的鈦種植體植入大鼠膝內(nèi)，在第2周和第4周免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)CD31陽性和骨鈣素陽性細(xì)胞的比例明顯增多。VEGF對放療患者種植體骨結(jié)合也有一定的促進(jìn)作用。將鈦種植體植入經(jīng)過15Gy射線輻射的兔脛骨中，在種植體中心的孔隙注射高表達(dá)BMP-2/VEGF165的慢病毒載體，第2周和第8周通過PCR分析發(fā)現(xiàn)Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-related transcription factor 2，Runx2)、骨鈣素、ALP和CD31表達(dá)水平增加，Micro-CT顯示新骨形成量明顯增加［25］。

神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的成員，對交感和感覺神經(jīng)元以及神經(jīng)元嵴細(xì)胞有很強(qiáng)的促進(jìn)作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，NGF還參與骨改建過程，對骨再生有一定的促進(jìn)。將含NGF的明膠海綿應(yīng)用于犬前磨牙缺損模型可以有效刺激骨的形成［26］。在小鼠腿骨植入鈦種植體區(qū)局部注射外源性NGF，可以促進(jìn)小鼠股骨鈦種植體植入早期的骨再生，加速早期骨膠原以及骨小梁的成熟，縮短種植體骨結(jié)合時(shí)間［27］。但由于NGF半衰期較短，NGF多被用于種植體局部注射，用于種植體表面改性的研究還較少。

骨的改建由多種生長因子共同參與，BMP、VEGF、TGF、NGF等在促進(jìn)骨生成方面有積極作用，控制生長因子在種植體表面的緩慢持續(xù)釋放，增加其作用時(shí)間可以進(jìn)一步促進(jìn)成骨，并且多種生長因子的聯(lián)合使用似乎可以取到更好的促進(jìn)效果。

3.生物活性肽

生物活性蛋白因其固有的生物活性為種植體表面的生物功能化提供了選擇，但是蛋白質(zhì)分子存在免疫原性且缺乏良好穩(wěn)定性，動(dòng)物提取的蛋白也具有病原體傳播和變異的風(fēng)險(xiǎn)。相比較而言，僅包含細(xì)胞結(jié)合序列的短肽可以發(fā)揮生物活性作用并能規(guī)避這些風(fēng)險(xiǎn)，具有良好應(yīng)用潛能。它們易合成、純化和存儲(chǔ)消毒，與大分子蛋白相比具有成本效益，并且其活性不依賴于其三級結(jié)構(gòu)［28］。下面著重于介紹4種具有促進(jìn)細(xì)胞粘附、增殖和分化功能多肽或寡肽，如RGD，P-15，成骨生長肽（osteogenic growth peptide，OGP）以及胰島素樣生長因子（insulin-like growth factors-1，IGF-1）。

RGD序列存在于纖連蛋白的細(xì)胞結(jié)合域，是細(xì)胞粘附所需要的最小序列，可以促進(jìn)細(xì)胞的擴(kuò)散粘附和增殖。貽貝來源蛋白（musselderived peptide，MP）是一種包含L-3，4二羥基苯丙氨酸（DOPA）結(jié)構(gòu)的蛋白，可以作為接枝分子把RGD和肝素結(jié)合蛋白（heparin binding protein，HBP）固定在鈦片上。Pagel等［29］將人類骨肉瘤細(xì)胞（sarcoma osteogenic，SaOS-2）置于附著MP-RGD的鈦片上培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其可以促進(jìn)SaOS-2黏附、生存和增殖，MP-RGD-HBP的促進(jìn)作用則進(jìn)一步增強(qiáng)。將抗菌肽和RGD肽共同結(jié)合在鈦種植體表面，不僅可以促進(jìn)SaOS-2細(xì)胞的附著和擴(kuò)散，同時(shí)阻止了細(xì)菌的生長［30］。此外肽的結(jié)構(gòu)也對骨結(jié)合過程也有一定影響，研究發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RGD相比線性RGD會(huì)引起垂直方向骨量的更明顯增加［31］，并且發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RGD可能是通過激活成骨細(xì)胞的黏著斑激酶（FAK），上調(diào)MARK信號(hào)通路c-fos轉(zhuǎn)錄閾值水平，進(jìn)而促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖［32］。

P-15是模擬Ⅰ型膠原蛋白結(jié)合域合成的短肽（GTPGPQGIAGAGQRGVV），具有促進(jìn)成骨細(xì)胞分化、增強(qiáng)細(xì)胞黏附、遷移和存活的功能。Fu等［33］通過表面引發(fā)的原子轉(zhuǎn)移自由基聚合（surface-initiated atom transfer radical polymerization，SI-ATRP）原位生長含酮聚合物，并通過肟化反應(yīng)將P-15共價(jià)連接在鈦表面。結(jié)果顯示聚合物接枝P-15的實(shí)驗(yàn)組相比未含P-15的對照組在第6h展現(xiàn)出更高的細(xì)胞存活率，細(xì)胞核染色法檢測24h細(xì)胞數(shù)顯示共價(jià)接枝P-15的鈦片吸附有更多細(xì)胞，21d茜素紅S染色也顯示P-15的存在增加了鈣沉積。Lutz等［28］將P-15吸附修飾在鈦棒表面并植入豬股骨中，組織形態(tài)計(jì)量學(xué)分析發(fā)現(xiàn)30d時(shí)相比未修飾的種植體展現(xiàn)出更高的BIC值。同樣，將磷酸鈣和P-15沉積吸附修飾的鈦種植體植入成年比格犬的雙側(cè)脛骨中，1周時(shí)也呈現(xiàn)出比其它對照組更高的BIC值［34］，提示P-15能夠有效誘導(dǎo)種植體周圍的骨形成。然而植入部位以及個(gè)體異質(zhì)性對生物活性物質(zhì)的作用可能會(huì)有一定的影響。Schmitt等［35］對植入比格犬頜骨內(nèi)的種植體中部、頂部以及頂部兩側(cè)進(jìn)行骨形態(tài)計(jì)量學(xué)分析后，發(fā)現(xiàn)在第2d和7d，P-15修飾的鈦種植體與對照組種植體周圍的BIC無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，因此P-15以及其它生物活性物質(zhì)在人體內(nèi)對骨結(jié)合的促進(jìn)作用仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

成骨生長肽是由14個(gè)氨基酸組成的多肽（ALKRQGRTLYGFGG），能增強(qiáng)ALP活性，加速基質(zhì)礦化、促進(jìn)骨再生。沉淀吸附有成骨生長肽的鈦片可以促進(jìn)大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞的附著、增殖和成骨分化。當(dāng)纖連蛋白與成骨生長肽共同附著于鈦片時(shí)，成骨分化作用進(jìn)一步加強(qiáng)［36］。Lai等［37］通過聚多巴胺將成骨生長肽共價(jià)連接在有鈦納米管的鈦片上，在其上接種大鼠顱骨成骨細(xì)胞，相比未修飾成骨生長肽的鈦片，ALP的水平明顯提高，成骨相關(guān)基因表達(dá)增加。

IGF-1是一種與胰島素結(jié)構(gòu)相似的小分子肽，可作為骨骼生長的調(diào)節(jié)劑，具有促進(jìn)細(xì)胞粘附的作用。Xing［38］等將大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種在加載有IGF-1的明膠/殼聚糖聚電解質(zhì)多層的鈦種植體表面，檢測發(fā)現(xiàn)ALP、Runx2、Ⅰ型膠原和骨鈣素的mRNA的表達(dá)水平提高，細(xì)胞增殖以及基質(zhì)礦化水平增加。將IGF-1修飾的種植體植入骨質(zhì)疏松模型大鼠股骨中，8周后通過亞甲藍(lán)/品紅和micro-CT觀察，相比對照組，實(shí)驗(yàn)組新骨厚度和連續(xù)性明顯增加，當(dāng)IGF-1為100ng/mL時(shí)促進(jìn)作用最強(qiáng)，為骨質(zhì)疏松癥患者的種植修復(fù)提供了新的策略。

肽類生物活性物質(zhì)克服了生物活性蛋白的諸多缺陷，降低了在體內(nèi)被內(nèi)源性酶降解的風(fēng)險(xiǎn)，在促進(jìn)細(xì)胞的粘附，增殖和分化以及促進(jìn)新骨形成增加種植體初期穩(wěn)定性方面具有良好的效果，在種植體表面改性方面具有良好的應(yīng)用潛力。但這些肽類生物活性物質(zhì)發(fā)揮促進(jìn)骨結(jié)合效果最恰當(dāng)?shù)臐舛冗€有待進(jìn)一步確定，如何使肽類活性物質(zhì)在種植體表面更穩(wěn)定的釋放也有待進(jìn)一步研究。

4.小結(jié)

生物活性分子在種植體表面的應(yīng)用有助于提高種植體骨結(jié)合。這通過其促進(jìn)成骨相關(guān)標(biāo)記物表達(dá)，促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，增加細(xì)胞的粘附和增殖等方式證實(shí)，而且動(dòng)物體內(nèi)研究也表明種植體表面的生物活性分子增加了種植體周圍新骨的形成，促進(jìn)種植體骨結(jié)合，展示了良好的臨床應(yīng)用前景。目前聚電解質(zhì)多層、水凝膠、納米粒子以及微球等緩釋系統(tǒng)的研究為生物活性物質(zhì)更加穩(wěn)定持久釋放提供了更廣闊的前景，但緩釋系統(tǒng)在種植表面對生物活性物質(zhì)的緩釋效果仍需在進(jìn)一步驗(yàn)證。目前研究大多數(shù)都是體外或動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，由于體內(nèi)影響因素較多，缺乏對其確切效果的臨床證據(jù)，尚未轉(zhuǎn)化為可供臨床應(yīng)用的產(chǎn)品。而且，這些生物活性分子用于種植體表面的制備方法、對種植體儲(chǔ)存和消毒帶來的難題以及體內(nèi)吸收、降解等對骨形成的影響體等一系列問題尚需更多、更深入的研究來解決，尤其是大量的、嚴(yán)謹(jǐn)科學(xué)設(shè)計(jì)的體內(nèi)研究有助于揭示其臨床應(yīng)用價(jià)值。